HBV相關肝細胞癌患者血清N-糖組圖譜改變與肝組織糖基轉移酶表達變化的關系

曹 曦，孫艷玲，陳翠英，肖義煒，向寬輝，劉學恩，莊 輝

1 北京大學醫學部基礎醫學院 病原生物系和感染病中心，北京 100191；2 解放軍總醫院第五醫學中心 肝病醫學中心肝病外科，北京 100853；3 江蘇先思達生物科技有限公司，南京 210000

HBV慢性感染是肝細胞癌 (HCC) 發生的最常見病因，HCC的發病率和病死率在惡性腫瘤中分別占第6位和第4位，嚴重威脅著人類健康[1]。HCC細胞異常增殖可使血清糖蛋白N-糖鏈組成和結構發生改變，因此，血清糖蛋白的N-聚糖可作為HCC診斷標志物和HCC治療的分子靶點[2]。N-聚糖改變的基礎在于肝細胞內糖基轉移酶活性的變化，其中多數糖基轉移酶表達與肝臟功能密切相關。當肝細胞發生癌變時，某些糖基轉移酶基因被激活，其表達異常增加，或基因表達受抑制而含量下降，從而導致一些蛋白質異常糖基化修飾。大量研究[3]表明，這種異常糖基化修飾與腫瘤細胞惡性侵襲行為密不可分。筆者前期研究[4]發現，與健康對照相比，HBV相關HCC(HBV-HCC)患者血清中N-聚糖圖譜發生一系列特征改變，其中二天線N-聚糖峰1(peak1,NGA2F)豐度升高；三天線N-聚糖峰9(peak9, NA3Fb)豐度特異性升高；其他三天線和四天線N-聚糖峰(peak10 NA3Fc、peak11 NA4、peak12 NA4Fb)豐度也有不同程度的升高。但目前HBV-HCC患者血清N-聚糖變化機制尚未完全闡明。本研究中，通過檢測HBV-HCC患者癌組織與癌旁組織中8種重要的糖基轉移酶基因(包括巖藻糖基轉移酶FUT3、FUT4、FUT6、FUT7、FUT8和N-乙酰氨基葡萄糖轉移酶Gn-TⅢ、Gn-TⅣa、Gn-TⅤ)表達水平變化并比較其差異，探索HBV-HCC患者血清N-聚糖變化的可能機制。

1 材料與方法

1.1 肝組織標本和血清標本的收集 收集解放軍總醫院2018年9月—2019年11月HBV-HCC行手術患者的肝癌和癌旁組織及正常肝組織標本，同時采集血清標本，置于-80 ℃冰箱保存。患者符合以下入選標準: (1)均為感染HBV的HCC患者；(2)排除HAV、HCV、HDV、HEV等肝炎病毒感染；(3)患者術后病理標本均經醫院病理科確診為HCC，肝癌診斷符合原發性肝癌診療規范(2019年版)[5]。同時收集HCC患者臨床資料。另外選取20例健康成年人血清作為對照。

1.2 DSA-FACE法檢測HBV-HCC患者血清N-聚糖圖譜 應用SPSS 20.0軟件從34例HCC患者中隨機選擇8例HCC患者血清標本作為HCC試驗組，20例健康成年人血清標本作為對照組。采用DSA-FACE法檢測和分析血清N-聚糖圖譜[6]，具體步驟如下：

(1)寡糖的釋放：取3 μl血清，加入含有2 μl 10 mmol/L NH4HCO3緩沖液和3 μl去離子水的PCR反應板中, 反應板放入PCR儀器，95 ℃加熱5 min 后冷卻至4 ℃,然后加入3 μl PNGaseF(2.2 U/μl)，37 ℃孵育3 h，之后加入100 μl去離子水終止反應，標記為D板。

(2)標記寡糖：從D板吸取10 μl溶液加入一新的PCR反應板中，開蓋在60 ℃條件下烘干90 min，加入3 μl標記溶液(20 mmol/L APTS∶1 mol/L NaCNBH3=1∶1)，90 ℃反應2 h，加入100 μl去離子水終止反應，標記為L板。

(3)去唾液酸：從L板中取2 μl溶液加入一新的PCR反應板，加入0.25 μL 100 mmol/L NH4Ac(pH=5.0)、0.2 μl 唾液酸酶(2.5 U/μl)和1.55 μl去離子水, 震蕩混勻后42 ℃孵育4 h，加40 μl去離子水終止反應，標記為DE板。

(4)DNA 測序儀上機檢測：取DE板10 μl溶液加入ABI測序儀專用96孔板，放入ABI 3500 測序儀進行N-聚糖圖譜分析，數據經 GeneMapper 軟件分析。

1.3 熒光定量PCR法檢測患者癌組織與癌旁組織中的糖基轉移酶mRNA表達水平 凍存的肝組織放入超聲震蕩儀研磨后，用Trizol試劑提取總RNA，用Nano Drop One檢測總RNA的濃度和純度。將總RNA逆轉錄為cDNA后，用熒光定量PCR儀(ABI 7500 FAST)進行cDNA擴增，反應體系為20 μl。反應條件為：(1)95 ℃ 30 s；(2)95 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s共40個循環；(3)溶解曲線：95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min, 95 ℃ 15 s。

以RPS11作為內參基因，目的基因的相對表達量用2-△△CT表示。癌組織和癌旁組織糖基轉移酶mRNA相對表達量檢測分析的對照均是正常肝組織。 FUT3、FUT4、FUT6、FUT7、FUT8、Gn-TⅢ、Gn-TⅣa和Gn-TⅤ基因的特異引物由生工生物工程股份有限公司合成，引物序列見表1。

表1 熒光定量PCR檢測糖基轉移酶基因引物序列表

1.4 蛋白印跡法檢測癌組織和癌旁組織中FUT8、Gn-TⅤ和Gn-Ⅳa的蛋白表達水平 凍存的肝組織放入超聲震蕩儀研磨后，用含cOmplete蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液提取蛋白，用BCA蛋白試劑盒來測定蛋白濃度。電泳分離不同分子量蛋白后，15 V恒壓下用半干轉電轉儀將蛋白轉移至PVDF膜，于5%的脫脂奶粉中室溫封閉1 h，加入抗-FUT8(1∶1000)、抗-Gn-TⅣa(1∶1000)、抗-Gn-TⅤ(1∶1000)、抗-β-actin(1∶4000)一抗，4 ℃過夜，TBST溶液洗膜3次，分別加入抗鼠或抗兔的二抗(1∶5000)，室溫下孵育2 h，TBST溶液洗膜3次，加入增強型ECL化學發光試劑，凝膠成像儀掃描顯影的條帶，ImageJ軟件分析條帶灰度。以β-actin作為內參，目的蛋白的相對表達量用目的蛋白灰度值與內參蛋白灰度值的比值來表示。

2 結果

2.1 HBV-HCC患者臨床特征 34例HBV-HCC患者臨床特征見表2。

2.2 HBV-HCC患者血清N-聚糖圖譜特征 應用DSA-FACE法分析HCC試驗組8例HBV-HCC患者與對照組20例健康成年人血清N-聚糖圖譜(圖1)，其特征改變與筆者前期研究發現的特征改變相同[4]。

與對照組相比，HCC試驗組患者三天線N-聚糖峰9(peak9，NA3Fb)豐度明顯升高(t=-2.514，P<0.05)；血清二天線N-聚糖峰1(peak1，NGA2F)和四天線N-聚糖峰(peak11 NA4、peak12 NA4Fb)的豐度在兩組間差異無統計學意義(P值均>0.05)。

表2 34例HBV-HCC患者臨床特征

2.3 癌組織與癌旁組織8種糖基轉移酶mRNA表達水平比較 癌組織中FUT8、Gn-TⅣa和Gn-TⅤ基因mRNA表達水平顯著高于癌旁組織(1.50±0.34 vs 0.65±0.11,t=-2.354，P=0.022; 2.90±0.47 vs 1.68±0.19,t=-2.403，P=0.019; 3.57±0.64 vs 1.33±0.16,t=-3.384，P=0.001)，差異均有統計學意義。FUT3、FUT4、FUT6、FUT7和Gn-TⅢ mRNA的表達水平在癌組織與癌旁組織間比較差異均無統計學意義(P值均>0.05)(圖2)。

進一步比較了HCC試驗組中8例患者癌組織與癌旁組織中8種糖基轉移酶mRNA表達水平。與癌旁組織相比，8例HCC試驗組患者癌組織中Gn-TⅤ mRNA表達明顯升高(Gn-TⅤ:5.26±1.70 vs 1.49±0.33,t=-2.173,P=0.047)；Gn-TⅢ、Gn-TⅣa、FUT4 和FUT8 mRNA表達在癌組織與癌旁組織間無顯著性差異(Gn-TⅢ:1.03±0.46 vs 1.55±0.62,t=0.663,P=0.518；Gn-TⅣa: 5.15±1.50 vs 2.39±0.46,t=-1.752,P=0.102; FUT4: 1.56±1.12 vs 0.81±0.27,t=-0.653,P=0.524; FUT8: 2.61±1.26 vs 1.01±0.41,t=-1.213,P=0.245)。

2.4 癌組織和癌旁組織FUT8、Gn-TⅣa和Gn-TⅤ基因的蛋白表達水平比較 選取mRNA表達有顯著性差異的3個糖基轉移酶基因FUT8、Gn-TⅣa和Gn-TⅤ作為蛋白印跡實驗的檢測因子。結果如圖3所示，癌組織中FUT8與Gn-TⅤ的蛋白表達水平顯著高于癌旁組織(0.70±0.11 vs 0.083±0.017,t=9.555,P=0.001; 1.33±0.19 vs 0.60±0.15,t=5.097,P=0.007)；Gn-TⅣa的蛋白表達水平在癌組織與癌旁組織間比較差異無統計學意義(0.52±0.24 vs 0.24±0.11,t=1.833,P=0.141)。

注：a，血清中12種N-聚糖豐度比較；b，12種N-聚糖結構。Peak1-Peak12圖引自文獻[4]，Peak1: 二天線無半乳糖基核心ɑ-l,6巖藻糖基化N聚糖(NGA2F)；Peak2: 二天線無半乳糖基核心ɑ-l,6巖藻糖基化平分型N聚糖(NGA2FB)；Peak3/Peak4: 二天線核心ɑ-l,6巖藻糖基化單支鏈半乳糖基N聚糖(NG1A2F)；Peak5: 二天線N聚糖(NA2)；Peak6: 二天線核心ɑ-l,6巖藻糖基化N聚糖(NA2F)；Peak7: 二天線平分型核心ɑ-l,6巖藻糖基化N聚糖(NA2FB)；Peak8: 三天線N聚糖(NA3)；Peak9: 三天線支鏈ɑ-l,3巖藻糖基化N聚糖(NA3Fb)；Peak9’: 三天線核心ɑ-l,6巖藻糖基化N聚糖(NA3Fc)；Peak10: 三天線支鏈ɑ-l,3巖藻糖基化與核心ɑ-l,6巖藻糖基化N聚糖(NA3Fbc)；Peak11: 四天線N聚糖(NA4)；Peak12: 四天線支鏈ɑ-l,3巖藻糖基化N聚糖(NA4 Fb)。

注：*，P<0.05，**，P<0.01。圖2 癌組織與癌旁組織中8種糖基轉移酶mRNA表達水平比較

注：**，P<0.01圖3 癌組織與癌旁組織糖基轉移酶FUT8、Gn-TⅣa和Gn-TⅤ的蛋白表達水平比較

3 討論

HCC患者血清中常出現大量異常糖基化N-糖蛋白，分離糖蛋白的N-聚糖鏈進行表達圖譜分析，可發現支鏈與核心巖藻糖基化N-聚糖和多天線N-聚糖含量增加，這些N-聚糖與HCC發生發展密切相關，可作為篩查和診斷HCC的特異性標志[12]。研究[4,13]發現在HBV-HCC患者血清中支鏈巖藻糖基化三天線N-聚糖(peak9, NA3Fb)豐度顯著升高，且核心巖藻糖基化二天線N-聚糖(peak1,NGA2F)、核心巖藻糖基化平分型二天線N-聚糖(peak2,NGA2FB)、支鏈與核心巖藻糖基化三天線N聚糖(peak10,NA3Fc)、四天線N-聚糖(peak11,NA4)和支鏈巖藻糖基化四天線N-聚糖(peak12,NA4Fb)豐度也有不同程度的升高(N-聚糖結構如圖4)。本研究通過對HBV-HCC患者癌組織與癌旁組織相關糖基轉移酶基因表達檢測分析，探尋HCC患者特異性血清N-聚糖變化的可能機制。

糖基轉移酶Gn-TⅤ與Gn-TⅣa催化形成三天線及三天線以上N-聚糖的N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)糖鏈結構[14-15]，而Gn-TⅢ催化合成N-聚糖的平分型GlcNAc結構，Gn-TⅢ與Gn-TⅤ、Gn-TⅣa有拮抗作用(圖4)[16]。本研究發現，在癌組織中Gn-TⅤ與Gn-TⅣa mRNA表達水平顯著高于癌旁組織(P<0.05)，蛋白印跡實驗也顯示，在癌組織中Gn-TⅤ蛋白表達顯著高于癌旁組織(P<0.05)。而Gn-TⅢ mRNA表達水平在癌組織與癌旁組織間無統計學差異(P=0.711)。本研究結果可以解釋HCC試驗組患者血清中N-聚糖變化：與對照組相比，8例HCC患者血清中三天線N-聚糖(peak9)豐度顯著升高(P<0.05)，而且這8例HCC患者癌組織Gn-TⅤ表達水平顯著高于癌旁組織(P<0.05)。說明HCC患者血清中多天線N-聚糖豐度升高可能與糖基轉移酶Gn-TⅤ高水平表達密切相關，促進含GlcNAc多分支(三天線及以上)N-聚糖的合成(圖4)。

以往研究[4,13]表明，在HBV-HCC患者血清中核心巖藻糖基化N-聚糖(peak1、peak2、 peak10)豐度較高。本研究發現，在癌組織中核心巖藻糖基轉移酶FUT8 mRNA與蛋白表達水平顯著高于癌旁組織(P<0.05)。FUT8表達上調會導致核心巖藻糖基化修飾結構的N-聚糖增加，可能與癌細胞高轉移潛能有關[17]。另外，AFP是臨床上最常用的HCC血清學檢測指標，有研究[18]發現HCC患者血清中AFP經FUT8催化作用下可形成核心巖藻糖基化AFP(AFP-L3)，其與腫瘤的發展速度、腫瘤大小和腫瘤轉移密切相關，且診斷HCC效力優于AFP。除了α-1,6核心巖藻糖基化N-聚糖，α-1,3分支巖藻糖基化N-聚糖的豐度在HBV-HCC患者血清也特異性升高。α-1,3分支巖藻糖基化結構是三天線N-聚糖(peak9)中Lewis X結構形成的關鍵[4]，參與合成α-1,3分支巖藻糖基化結構且與HCC密切相關的糖基轉移酶有FUT3、FUT4、FUT6、FUT7[19]。本研究顯示，在34例HCC患者癌組織與癌旁組織間FUT3、FUT4、FUT6和FUT7 mRNA表達水平沒有顯著性差異(P>0.05)，不能解釋血清N-聚糖水平異常改變。結合以往研究報道分析FUT基因表達的檢測結果，可能因為多種巖藻糖基轉移酶參與合成α-1,3分支巖藻糖基化結構，而目前對于這些酶相互作用機制尚未明確，較難判斷巖藻糖基轉移酶中那一種亞類起主導作用。本研究主要檢測8種與HCC密切相關的糖基轉移酶基因表達，初步闡述HBV-HCC患者血清中N-聚糖變化的可能機制。但對于不同糖基轉移酶之間相互作用的具體機制以及其他血清N-聚糖(如異常唾液酸化修飾的N-聚糖等)變化機制，還有待于進一步研究。

圖4 HBV相關HCC患者血清特異變化N-聚糖與8種糖基轉移酶之間的關系

利益沖突聲明：本研究不存在研究者、倫理委員會成員、受試者監護人以及與公開研究成果有關的利益沖突。

作者貢獻聲明：曹曦完成實驗和數據分析，撰寫論文；孫艷玲、肖義煒、向寬輝參與收集標本和分析數據；陳翠英參與修改論文；劉學恩、莊輝負責課題設計，指導撰寫文章并最后定稿。