HBsAg對干擾素基因刺激蛋白信號通路誘導外周血漿樣樹突狀細胞生成干擾素α的影響

杜萬威，耿 建，楊逸帆，王 霞，傅涓涓，潘修成

徐州醫科大學附屬醫院 感染性疾病科，江蘇 徐州 221002

在我國，HBV感染是慢性肝炎、肝硬化及肝細胞癌發生的主要病因[1-2]，其中機體抗HBV天然免疫和特異性免疫反應不足是HBV感染慢性化的關鍵原因[3]。漿樣樹突狀細胞(plasmacytoid dendritic cell，pDC)是人體產生內源性Ⅰ型IFN的主要天然免疫細胞[4]，不僅直接發揮抗病毒作用，還能激活自然殺傷細胞、B淋巴細胞、T淋巴細胞和髓樣樹突狀細胞，從而誘導并增強抗病毒免疫應答[5]。既往研究[6-8]發現，HBV顆?；騂BsAg抑制pDC通過Toll樣受體9(TLR9)通路表達IFNα，可能是HBV感染慢性化的重要原因。近期研究[9]發現，pDC中還存在不依賴TLR9的Ⅰ型IFN信號通路，即環鳥苷酸-腺苷酸合成酶(cyclic GMP-AMP synthase，cGAS)-IFN基因刺激蛋白(stimulator of interferon genes，STING)-Ⅰ型IFN信號通路。STING是調控Ⅰ型IFN基因表達的重要接頭蛋白。細胞內游離的雙鏈DNA在cGAS作用下，催化合成的環鳥甘酸-腺苷酸(cyclin GMP-AMP，cGAMP)直接激動STING 蛋白，然后通過TBK1介導干擾素調節因子3(IRF3)核轉移進而誘導Ⅰ型IFN表達[10]。作為產生內源性Ⅰ型IFN的主要細胞，pDC可以攝取HBV顆粒、HBsAg等，并與其相互作用進一步影響pDC功能[4]。目前關于HBV感染和STING誘導的天然免疫應答通路之間關系的研究較少，HBsAg對pDC的STING-Ⅰ型IFN通路是否有抑制作用尚未見報道。本研究初步觀察HBsAg對pDC通過激活STING通路表達Ⅰ型IFN功能的影響，以期進一步揭示HBV持續感染的發生機制，同時為慢性HBV感染免疫治療方案的制訂提供新的靶點。

1 資料與方法

1.1 研究對象 收集2016年2月—12月于徐州醫學院附屬醫院感染性疾病科門診及住院的慢性HBV感染者及體檢的健康成人外周靜脈全血。慢性HBV感染診斷標準符合《慢性乙型肝炎防治指南(2015年更新版)》[11]。排除標準：(1)除外HCV、HDV或HIV重疊感染；(2)妊娠或哺乳期婦女；(3)合并酒精性肝炎、免疫性疾??；(4)伴其他嚴重疾病如惡性腫瘤，嚴重心、肺、腎、精神疾病，甲狀腺功能亢進，糖尿病等。

1.2 材料 淋巴細胞分離液(Excellbio，中國)，IFNα ELISA試劑盒(Excellbio，中國)，IFNβ ELISA試劑盒(Excellbio，中國)，TNFα ELISA試劑盒(Excellbio，中國)，2′3′-cGAMP(Invitrogen, 法國)，FITC標記鼠抗人單克隆抗體(eBioscience，美國)，BDCA4樹突狀細胞分離試劑盒(Miltenyi Biotec, 德國)，磁珠分選套裝(Miltenyi Biotec, 德國)。

1.3 方法

1.3.1 收集外周血單個核細胞(PBMC) 分別采集慢性HBV感染者和健康成人外周靜脈血，用淋巴細胞分離液以聚蔗糖-泛影葡胺密度梯度離心法分離PBMC，培養基懸浮供后續實驗取用。

1.3.2 PBMC培養 慢性HBV感染者與健康成人PBMC(2×106/ml)分別加入cGAMP(終濃度200 nmol/L)刺激16 h后留取上清-80 ℃保存。健康成人PBMC(2×106/ml)加入HBsAg(50 μg/ml)孵育24 h，然后加cGAMP(終濃度200 nmol/L)刺激16 h，同時設置對照組，留取培養上清-80 ℃保存。

1.3.3 磁珠分選 按前述方法獲取健康成人PBMC(2×106/ml)以磷酸緩沖鹽溶液(PBS)(100 μl)懸浮，分別加FCR-Blocking(100 μl)、抗-BDCA4(10 μl)后混勻、孵育、洗滌并離心后去上清，用PBS重懸后，按套裝操作說明上機分選pDC。取分選后的PBMC即pDC - PBMC(1×106)體外以cGAMP按前述方法處理后收集上清供ELISA檢測細胞因子，同時設置未去除PBMC作為對照組。

1.3.4 流式細胞術計數pDC 健康成人PBMC分別按前述方法予以HBsAg和cGAMP處理后，用100 μl的PBS懸浮并加入FITC標記鼠抗人單克隆抗體CD3、CD14、CD16、CD19、CD20、CD56各5 μl，再加入PE標記的CDl23和APC標記的CD303各10 μl，然后加FCR-Blocking 20 μl，室溫避光孵育30 min。加入固定劑A 100 μl，固定15 min后離心(1500 r/min，5 min)棄上清，100 μl PBS懸浮并加固定劑A 100 μl，送流式細胞儀檢測pDC細胞頻數，APC-CD123和PE-BDCA2雙陽性的細胞即為pDC。

1.3.5 ELISA檢測細胞因子 根據ELISA試劑盒說明書分別檢測研究對象血清IFNα、IFNβ和TNFα水平。檢測細胞上清IFNα水平。

1.4 倫理學審查 本研究經由徐州醫科大學附屬醫院倫理委員會批準，批號：XYFY2020KL05201，入組患者均采取自愿原則，并簽署知情同意書。

2 結果

2.1 一般資料 共納入慢性HBV感染者43例，男27例，女16例，平均(32.43±8.60)歲；健康成人10例，男6例，女4例，平均(25.52±11.15)歲。2組研究對象在年齡、性別方面差異均無統計學意義(P值均>0.05)。

2.2 慢性HBV感染者PBMC生成IFNα水平降低 與健康對照組相比，慢性HBV感染者的PBMC分泌IFNα水平明顯降低，差異有統計學意義(t=4.868，P=0.001)。而2組間TNFα水平差異無統計學意義(P值>0.05)(表1)。此外，以cGAMP激活STING通路，在慢性HBV感染者或健康對照組PBMC培養上清中均未檢測到IFNβ分泌。

表1 cGAMP刺激慢性HBV感染者和健康人群 PBMC細胞因子表達

2.3 HBsAg抑制cGAMP誘導健康成人PBMC分泌IFNα的能力 將HBsAg與健康人PBMC預先共孵育，然后以cGAMP刺激，采用ELISA檢測培養上清IFNα水平。結果顯示，cGAMP刺激可誘導健康人PBMC高水平分泌IFNα，而預先與HBsAg共培養過的PBMC分泌IFNα水平(448.5±52.0)相比，未培養組(571.0±30.8)明顯降低(t=4.500，P=0.011)。

2.4 cGAMP誘導健康人PBMC中pDC生成IFNα 采用磁珠分選法去除健康人PBMC中的pDC，以cGAMP刺激16 h，ELISA法檢測上清液中IFNα水平，并與未去除pDC的健康人PBMC比較，結果顯示去除pDC組PBMC(pDC- PBMC組)培養上清IFNα水平(164.50±40.73)較未去除組(339.50±35.334)顯著降低(t=6.482，P=0.001)。

2.5 HBsAg抑制cGAMP-STING通路激活后健康人PBMC中pDC頻數 將健康成人PBMC預先與HBsAg共培養后并予cGAMP刺激，以流式細胞術分析pDC頻數，結果顯示cGAMP組外周血pDC細胞頻數明顯高于HBsAg+cGAMP組(P<0.05)(表2)。

表2 HBsAg對cGAMP刺激后的PBMC中pDC頻數的影響

3 討論

HBsAg是HBV的外膜蛋白，在HBV感染期間大量產生，并游離存在于慢性HBV感染者外周血循環。長期高載量HBsAg可導致抗HBV特異性T淋巴細胞耗竭以及干擾中和抗體結合[12]。不僅如此，HBsAg對機體抗HBV天然免疫反應也有抑制作用。近年研究[6]發現，HBsAg對pDC中TLR9通路誘導生成IFNα有抑制作用，可能是慢性HBV感染者外周pDC功能低下的重要原因。本研究結果顯示，慢性HBV感染者外周pDC功能低下還與其STING通路誘導IFNα表達受到HBsAg抑制有關。

胞質中的游離DNA被DNA識別受體cGAS識別后，催化合成cGAMP以激活靶定在內質網上的STING蛋白，進而活化IRF3入核介導Ⅰ型IFN或活化NF-κB介導TNFα及IL-6等炎癥因子表達[13-15]。本研究以cGAMP體外刺激PBMC，結果顯示，慢性HBV感染者PBMC分泌IFNα能力明顯低于正常對照組，而2組間TNFα分泌無明顯差異，提示慢性HBV感染者PBMC中STING-IRF3-IFNα分泌通路受到影響，而TNFα表達量無明顯改變。

慢性HBV感染者cGAMP誘導PBMC分泌IFNα水平低下可能與HBV顆粒、HBsAg或HBeAg等對其的抑制作用有關。已有研究[6]證實，HBsAg對pDC中TLR9誘導的IFN反應產生抑制作用，筆者推測HBsAg可能對cGAMP誘導PBMC的Ⅰ型IFN表達也有抑制作用。本研究以HBsAg預先與健康人PBMC共孵育，發現cGAMP誘導HBsAg預處理的健康人PBMC分泌IFNα的水平明顯低于未經HBsAg預處理組，證實了筆者的推測，即HBsAg對cGAMP誘導PBMC通過STING通路表達IFNα能夠發揮抑制作用。

pDC是機體產生內源性IFNα的主要細胞，是人體天然免疫應答的主要組成部分。有研究[5]報道，pDC受到HBV刺激后，分泌IFNα的能力是其他血細胞的100～1000倍。本研究也發現，將PBMC中pDC采用磁珠分選法去除后，再用cGAMP予以刺激，結果顯示，去除pDC的PBMC分泌IFNα能力顯著降低，證實pDC是PBMC中cGAMP激活STING通路產生IFNα的主要細胞。

為了進一步研究HBsAg對外周血pDC功能影響的機制，筆者用流式細胞儀檢測pDC頻數，結果發現cGAMP作用下的PBMC中pDC頻數增加，而HBsAg預孵的PBMC在cGAMP作用下pDC頻數明顯下降。這可能是HBsAg抑制cGAMP誘導PBMC分泌IFNα的重要原因，具體機制筆者團隊正在進一步研究中。

綜上所述，HBsAg對cGAMP激活pDC中STING通路表達IFNα有抑制作用，這對進一步研究HBV持續感染的免疫發生機制及慢性HBV感染的免疫治療方案的制訂具有重要意義。

利益沖突聲明：本研究不存在研究者、倫理委員會成員、受試者監護人以及與公開研究成果有關的利益沖突。

作者貢獻聲明：杜萬威、耿建、潘修成負責課題設計；杜萬威、耿建負責實驗操作，資料分析和撰寫論文；楊逸帆、王霞、傅涓涓參與收集數據，修改論文；潘修成負責擬定寫作思路，指導撰寫文章并最后定稿。