基于Sestrin 2通過mTOR信號通路調節胰腺癌上皮-間質轉化過程的實驗研究

戴勝杰，陳豪，樓彬，孫洪偉

（1.溫州醫科大學附屬第一醫院 肝膽胰外科，浙江 溫州 325035；2.浙江省杭州市余杭區第三人民醫院 普外科，浙江 杭州 311115）

胰腺癌由于其進展迅速、早篩率較低等因素，被認為是惡性程度極高的腫瘤，其5 年生存率不到5%[1-3]。目前胰腺癌的治療仍以手術治療為主，而只有不到10%的胰腺癌患者能達到根治性切除的標準，且仍不能保證術后生存期[2-4]。雖然近年來靶向治療、放療、化療、生物治療等輔助治療技術取得較大進步，在一定程度上改善了胰腺癌的預后，但這種改善仍不盡人意。因此，尋找有效遏制胰腺癌惡化進程的手段變得極為重要。

眾所周知，當腫瘤發生侵襲和轉移時，治療變得更加困難。而上皮-間充質轉化（EMT）進程被認為是腫瘤發生轉移侵襲的早期階段，隨著EMT進程的推進，細胞骨架發生重塑，細胞的黏附力減弱甚至喪失，細胞極性異常，從而增加轉移能力，導致腫瘤的轉移擴散。在EMT進程中，上皮細胞特征標志物表達減少（如E-鈣黏蛋白，被認為是腫瘤向浸潤性癌進展的關鍵步驟），而間質細胞特征標志物表達相應增加（如N-鈣黏蛋白、波形蛋白）[5-6]。Sestrins家族成員主要有Sestrin 1、Sestrin 2和Sestrin 3[7-8]。Sestrin 2（SESN2）主要在細胞增殖分化、凋亡自噬和生長存活中發揮作用，并參與調控mTOR信號通路。Sestrin 2 可通過激活AMP依賴性蛋白激酶（AMPK）和失活Rheb胍三磷酸酶來抑制mTORC1，也可直接抑制RAG GTP酶來影響mTORC1活性，從而調控細胞的生長和分化。同時，mTOR參與了EMT進程中具有不容忽視的作用[9]。已有研究表明，Sestrin 2在結直腸癌、肺癌、黑色素瘤等多種腫瘤中的表達下調可導致mTOR信號通路過度激活，導致細胞代謝和氧化應激失衡，從而促進腫瘤的增殖、生長、侵襲和轉移[10-13]。而Sestrin 2 在胰腺癌惡化進程中的作用尚不清楚。因此，本研究將探索Sestrin 2 在胰腺癌EMT進程中的作用，并探究其是否與mTOR信號通路具有相關性。

1 材料和方法

1.1 細胞株和試劑

本研究采用兩種人胰腺癌細胞系進行研究，分別為PANC-1 細胞系和CFPAC-1 細胞系（購自中國科學院細胞庫）。上述胰腺癌細胞采用標準細胞培養法，相應培養基分別為添加了10%胎牛血清的DMEM培養基和RPMI-1640培養基。抗Sestrin 2抗體購自Proteintech（美國）。抗E-鈣黏蛋白抗體、抗N-鈣黏蛋白抗體、抗波形蛋白抗體和抗p70S6K抗體均購自Sigma Chemical（美國）。

1.2 病毒轉染和分組方法

上述兩種胰腺癌細胞株分別進行Sestrin 2 敲減病毒、Sestrin 2 陰性敲減病毒、Sestrin 2 過表達病毒和Sestrin 2 陰性過表達病毒轉染，最終將每種胰腺癌細胞株轉染培養形成對照組、Sestrin 2 敲減組（Sestrin 2-組）、Sestrin 2過表達組（Sestrin 2+組）、陰性敲減組和陰性過表達組五個模型。

1.3 劃痕實驗

將不同模型組細胞接種于6孔板上，每孔約2× 105個細胞。當6孔板中細胞覆蓋率達80%～100%時，將其原有培養基去除，采用無血清培養基孵育1 h，然后用無菌移液管尖均勻用力劃出一道劃痕，并將 0 h和48 h后的劃痕情況進行拍攝并定量計算，統計實驗結果。

1.4 Transwell侵襲實驗

首先，將基質膠（BD Biosciences，CA，USA）均勻鋪于Transwell板小室底部的聚對苯二甲酸乙二酯膜（8 μm孔徑）上，待其凝固成膠凍狀后將已經過饑餓處理后的胰腺癌細胞（含有約5×104個細胞的100 μL無血清培養液）接種至小室中，同時在下室加入500 μL含10%胎牛血清的對應培養基。胎牛血清鋪墊在下室中可作為趨化因子促進腫瘤細胞的侵襲行為。經過恒溫箱24 h的孵育，取出小室置入 4%多聚甲醛中固定15 min，隨后用結晶紫試劑染色10 min后沖洗干凈，并擦去小室內膜細胞。最后，將小室倒置，隨機選取3個視野對小室進行觀察，計數外膜細胞數并攝像。

1.5 Western blotting實驗

將含有蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的RIPA緩沖液加至培養后的相應模型胰腺癌細胞中使細胞裂解而收集總裂解產物。然后離心總裂解產物，收集離心后上清液，并用BCA法測定蛋白濃度后在10%聚丙烯酰胺凝膠中分離相應蛋白質混合物（包括預染色的蛋白質標志物）。隨后，將分離后的蛋白質轉移至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上，在室溫下把相應PVDF膜放在5%脫脂乳的Tris緩沖鹽水（10 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0，含有150 mmol/L NaCl和0.1% Tween-20）中封閉2 h后，最后將PVDF膜置于對應一抗溶液中4 ℃孵育過夜。次日，將PVDF膜用TBST 清洗后，放在辣根過氧化物酶（HRP）結合的二抗中室溫孵育1 h，使用AlphaEaseFC（STandalone）記錄和測量蛋白條帶的密度。

1.6 RNA提取和RT-PCR

使用Trizol試劑（Ambion，Carlsbad，California，USA）提取對應胰腺癌細胞組總RNA。然后，將不同組別的總RNA（1 μg）進行逆轉錄，隨后加入SYBR Green Master進行RT-PCR，用7500實時PCR系統進行qRT-PCR定量分析，計算相應ΔCt值，并進行分析。β-actin作為內參。不同PCR引物具體序列見表1。

表1 PCR引物序列

1.7 動物負瘤實驗

將約1×107個胰腺癌細胞懸浮液注射于無胸腺裸鼠皮下[BALB/C-nu/nu，6～8周齡，雌性，購自中國科學院動物中心（上海）]。隨著腫瘤細胞定植在裸鼠皮下，會在注射部位形成微腫瘤，定期觀察各模型組裸鼠的腫瘤情況。相關動物實驗倫理已經溫州醫科大學倫理委員會批準。

1.8 TCGA數據庫分析

在癌癥基因組圖譜數據庫（TCGA，https://tcgadata.nci.nih.gov/tcga/）中下載176例胰腺癌患者相關數據并進行分析，相應操作均符合TCGA相關政策。

1.9 統計學分析

采用SPSS 19.0軟件（IBM，USA）進行分析，收集3次以上獨立實驗獲得的數據，并用（）表示。組間數據比較采用方差分析，而P＜0.05 認為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 Sestrin 2在人胰腺癌中呈低表達并與胰腺癌預后密切相關

首先，本研究初步探索了Sestrin 2與胰腺癌的關系。通過分析來自TCGA數據庫的176例胰腺癌患者數據，我們發現高表達Sestrin 2組比低表達Sestrin 2 組擁有更長的生存周期（P＜0.05，圖1A）。其次，我們簡單分析了Sestrin 2與KRAS之間的相關性（KRAS作為胰腺癌的四大驅動基因之一，在胰腺癌的發生發展中起著重要作用）。結果表明，Sestrin 2在存在KRAS突變的胰腺癌患者中的表達量顯著低于無KRAS突變的胰腺癌患者（P＜0.05，圖1B）。最后，我們對四組人類胰腺癌組織及其癌旁胰腺組織進行蛋白質定量檢測，結果表明Sestrin 2 在胰腺癌組織中呈顯著低表達（圖1C）。

圖1 Sestrin 2在胰腺癌患者組織中的表達情況及其與預后的相關性

2.2 Sestrin 2與胰腺癌細胞轉移及侵襲能力密切相關

上述結果初步表明Sestrin 2 與胰腺癌之間存在密切相關性。緊接著，我們通過構建不同Sestrin 2表達量的胰腺癌細胞模型，檢測在干預Sestrin 2 表達量的情況下，胰腺癌細胞轉移侵襲能力變化。結果顯示，低表達Sestrin 2的CFPAC-1胰腺癌細胞和低表達Sestrin 2的PANC-1胰腺癌細胞均呈現較強的遷移能力（圖2A），而過表達Sestrin 2的相關胰腺癌細胞遷移能力降低（圖2B）。同時，通過Transwell侵襲試驗，結果顯示低表達Sestrin 2 的胰腺癌細胞侵襲能力增強（圖3A），而高表達Sestrin 2的胰腺癌細胞侵襲能力降低（圖3B）。綜上所述，Sestrin 2能抑制胰腺癌的轉移侵襲能力。

圖3 Sestrin 2調節胰腺癌細胞系的細胞侵襲能力。分別對正常胰腺癌細胞和轉染陽性慢病毒細胞的侵襲能力進行檢測，并在0 h和48 h進行拍攝（×400）。

圖2 Sestrin 2調節胰腺癌細胞系的細胞遷移能力。分別對正常胰腺癌細胞、轉染對應陰性慢病毒對照細胞和轉染陽性慢病毒細胞的劃痕遷移能力進行檢測，并在0 h和48 h進行拍攝（×80）。

2.3 Sestrin 2與胰腺癌細胞增殖能力密切相關

本研究通過動物皮下負瘤實驗檢測不同Sestrin 2 表達水平下胰腺癌細胞的增殖能力。通過構建不同Sestrin 2表達量的CFPAC-1胰腺癌細胞和PANC-1胰腺癌細胞動物皮下負瘤模型，結果顯示，敲減Sestrin 2 后的胰腺癌細胞在裸鼠中生長增殖的腫瘤最大，而過表達Sestrin 2組別的瘤體較小（圖4），這表明Sestrin 2能抑制胰腺癌的增殖。

圖4 Sestrin 2調節胰腺癌細胞系的細胞增殖能力。分別對CFPAC-1和PANC-1胰腺癌細胞進行Sestrin 2敲減與過表達，相應模型細胞動物皮下負瘤實驗。

2.4 Sestrin 2與胰腺癌EMT密切相關

隨后我們深入探索Sestrin 2 和胰腺癌EMT之間的關系。我們通過在改變Sestrin 2 表達量的情況下，觀察E-鈣黏蛋白、N-鈣黏蛋白和波形蛋白這三個EMT主要標志物的表達量變化。結果顯示，當Sestrin 2 表達量降低時，E-鈣黏蛋白的蛋白質表達水平（圖5E，表2）和mRNA水平（圖5A，圖5B）均降低，而當Sestrin 2過表達時，E-鈣黏蛋白表達水平升高（圖5C，圖5D，圖5F，表3）。相應地，N-鈣黏蛋白和波形蛋白的相關表現與E-鈣黏蛋白呈相反的變化。這表明，Sestrin 2 在胰腺癌中起著抑制胰腺癌EMT進程的作用。

2.5 Sestrin 2在胰腺癌中可能通過mTOR信號通路調節EMT進程

以往的研究表明，PI3K-AKT-mTOR信號通路激活可觸發EMT過程，我們通過觀察mTOR信號通路的關鍵下游分子p70S6k表達量變化來觀察mTOR信號通路的變化。結果顯示，當Sestrin 2表達量下調后，p70-s6k的表達水平升高（圖5A，圖5B，圖5E，表2），而當Sestrin 2表達上調時，p70-s6k的表達水平下降（圖5C，圖5D，圖5F，表3）。Sestrin 2過表達時所得結果與Sestrin 2被敲減時的結果相反。因此，我們初步得出結論：Sestrin 2通過mTOR/p70s6k途徑調控胰腺癌細胞的EMT進展。

表2 不同胰腺癌細胞Sestrin 2敲減模型中相應指標蛋白條帶灰度值變化（×10 000）

表3 不同胰腺癌細胞Sestrin 2過表達模型中相應指標蛋白條帶灰度值變化（×10 000）

3 討論

雖然目前對于胰腺癌的研究已經較為深入，但關于胰腺癌的手術治療和化療的效果仍不甚滿意，其病死率仍居高不下[1-2]。在如胰腺癌等腫瘤發生發展進程中，會有很多因素（如腫瘤微環境、miRNA、基因突變等）多方面地影響腫瘤的發展進程，因此通過深入研究腫瘤的發生發展機制，進而從不同環節介入干預腫瘤的惡化進程，這將對腫瘤的相關治療產生巨大幫助[14-17]。本研究主要通過研究上皮-間質轉化（EMT）進程在胰腺癌中的作用來研究胰腺癌的生物學行為。

研究表明，EMT主要影響細胞的侵襲和遷移能力[18-20]，當腫瘤細胞EMT進程得到促進，其癌癥細胞的轉運能力變強，進而在宏觀上表現為癌癥容易全身轉移擴散，從而加劇了腫瘤的治療難度[20-22]。相比較正常細胞，腫瘤細胞的E-鈣黏蛋白的表達水平降低，而N-鈣黏蛋白和波形蛋白的表達水平升高。因此，在腫瘤的發生發展過程中，抑制或逆轉EMT進程對幫助腫瘤患者抑制疾病、治療疾病等均起著重要作用。

Sestrin 2 的表達水平與腫瘤的發生發展密切相關，同時其能協同mTOR信號通路維持上皮細胞穩態。然而Sestrin 2 在胰腺癌的發生發展過程中尚無相關研究。本研究通過構建不同Sestrin 2 表達水平的人胰腺癌細胞模型，探索Sestrin 2與胰腺癌EMT之間的關系并觀察潛在的分子機制。我們發現，隨著Sestrin 2 表達水平的升高，胰腺癌細胞的轉移侵襲能力降低，增殖能力也被抑制，E-鈣黏蛋白的表達水平升高，而N-鈣黏蛋白和波形蛋白的表達水平降低。基于上述結果，我們推測Sestrin 2可能通過抑制胰腺癌的EMT進程來抑制胰腺癌的惡性進程。

同時，mTOR信號通路作為腫瘤發生發展過程中的“明星”信號通路，其幾乎在所有腫瘤中表現為激活狀態[23-24]。而Sestrin 2作為mTORC1的抑制劑，對mTOR信號通路有著顯著的抑制作用。本研究顯示，隨著Sestrin 2表達水平的升高，mTOR信號通路的關鍵通路分子p70-s6k呈顯著抑制狀態。結合EMT的相關結論，我們推測，Sestrin 2通過抑制mTOR信號通路進而抑制胰腺癌EMT過程，從而達到抑制胰腺癌相關惡性生物學行為的作用。

本研究我們主要研究了Sestrin 2 在胰腺癌發生發展和EMT過程中所扮演的作用，了解了Sestrin 2起著抑制胰腺癌發生發展的作用。在胰腺癌的惡變過程中，Sestrin 2 的表達量被抑制，這導致胰腺癌侵襲、轉移等生物學行為不被抑制，最終導致胰腺癌患者的極速惡化。假如我們能有效地定向誘導Sestrin 2表達，這將有效的抑制胰腺癌的惡化進程，故繼續深入研究Sestrin 2 在胰腺癌發生發展進程中的具體機制將對胰腺癌的相關靶向治療產生巨大的臨床應用價值。

4 結論

綜上所述，我們得出初步結論：Sestrin 2 可能通過抑制mTOR信號通路抑制胰腺癌EMT進程，從而起到抑制胰腺癌轉移侵襲等惡性生物學行為。本研究不僅建立了不同Sestrin 2 表達水平的胰腺癌細胞模型，更是豐富了Sestrin 2在胰腺癌EMT進程和mTOR信號通路中的相關研究。