馬鈴薯病毒病病原研究

楊茹薇 邢斌德 劉易 徐琳黎 孫慧

摘 要：從新疆烏魯木齊縣、吉木薩爾縣主產(chǎn)縣采集共92份馬鈴薯樣本，使用植物檢測病毒抗血清進(jìn)行ELISA檢測，摸清當(dāng)前烏魯木齊周邊地區(qū)馬鈴薯病毒的種類和染毒率，全面掌握馬鈴薯病毒的發(fā)生情況，以期為有效防治病毒病提供重要科學(xué)依據(jù)。

關(guān)鍵詞：馬鈴薯;病毒病;ELISA檢測

中圖分類號 S435.32文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A文章編號 1007-7731（2021）09-0096-03

Abstract： This test from the xinjiang urumqi county， jimsar which collected a total of 92 potato samples， the plants were used to detect virus antiserum for ELISA test， find out the current urumqi surrounding areas and the kinds of potato virus infected rate， a comprehensive grasp of potato viruses， provide important basis for effective prevention and treatment of viral diseases.

Key words： The potato; Virus disease; ELISA detection

馬鈴薯是茄科茄屬一年生草本植物，是一種兼具營養(yǎng)價(jià)值和藥用價(jià)值的食用塊莖作物[1]。馬鈴薯是世界第四大糧食作物中增長潛力最大的作物，其產(chǎn)業(yè)鏈長，是重要的經(jīng)濟(jì)作物和工業(yè)原料作物。馬鈴薯在保障國家糧食安全、推進(jìn)農(nóng)業(yè)結(jié)構(gòu)調(diào)整和促進(jìn)農(nóng)民持續(xù)增收等方面有著不可替代的重要作用。而馬鈴薯病毒病是馬鈴薯的主要病害，一般使馬鈴薯減產(chǎn)20%～50%，嚴(yán)重的達(dá)80%以上[2]。感染病毒的馬鈴薯通過無性繁殖進(jìn)行世代積累和傳遞，致使產(chǎn)量不斷下降，不能留種再生產(chǎn)，嚴(yán)重制約了馬鈴薯產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。

蚜蟲傳播、接觸傳播和摩擦傳播是馬鈴薯病毒病的主要傳播途徑[3、4]。馬鈴薯可以受到1種病毒的單獨(dú)侵染或幾種病毒的復(fù)合侵染。常見感染馬鈴薯病毒的種類有10余種，造成嚴(yán)重危害的主要是PVX、PVY、PVS、PVA、PVM、PLRV。對病毒病的防治目前尚無特效藥，現(xiàn)階段主要以預(yù)防為主，脫毒生產(chǎn)技術(shù)防治為主，高效可靠的病毒檢測是重要種薯質(zhì)量控制方法[5]。目前酶聯(lián)免疫吸附法和分子鑒定廣泛用于檢測操作中，本試驗(yàn)應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)對烏魯木齊縣和吉木薩爾縣馬鈴薯病毒病進(jìn)行了調(diào)查和鑒定，以為更有效地防治馬鈴薯病毒病提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料 樣本材料包括烏魯木齊縣、吉木薩縣試管苗44份，原原種16份，原種20份，商品薯12份，共92份樣本。

采用馬鈴薯病毒檢測試劑盒，包括馬鈴薯X病毒（PVX）、馬鈴薯Y病毒（PVY）、馬鈴薯S病毒（PVS）、馬鈴薯卷葉病毒（PLRV）。材料包括96孔包被抗體的微孔板、堿性磷酸酶標(biāo)記物、ECI緩沖液、PNP底物緩沖液、陽性質(zhì)控物、PBST洗滌緩沖液、吐溫、通用樣品提取緩沖液、研缽、密封盒、吸水紙、蒸餾水、酶聯(lián)儀、微量移液器、恒溫箱、離心機(jī)、冰箱等。

2 試驗(yàn)方法

2.1 配置緩沖溶液 用蒸餾水將配置20倍的PBST緩沖液400mL，使用蒸餾水配置5倍的ECI緩沖液和PNP緩沖液50mL。

2.2 質(zhì)控物溶液的制備 用樣品提取緩沖液2mL溶解陽性質(zhì)控物干粉，輕輕搖勻后在4℃條件下貯存，在使用前完全回溫后使用。

2.3 樣品的提取及稀釋 采集馬鈴薯葉片作為ELISA實(shí)驗(yàn)的檢測樣本，每份樣品提取后需徹底清洗研缽，以免造成樣品間的相互污染。取0.1g馬鈴薯葉片加入1mL提取緩沖液研磨提取離心。樣本研磨后，將提取液與提取緩沖液以1∶10的比例混合均勻。

2.4 點(diǎn)樣及孵育 根據(jù)樣本設(shè)計(jì)圖，100uL樣品提取稀釋液到各樣品孔中，取100uL陽性質(zhì)控物溶液到陽性對照孔中，并在25℃恒濕箱中孵育2小時(shí)反應(yīng)。

2.5 酶標(biāo)記物的制備 先將ECI緩沖液稀釋到1倍，后將酶標(biāo)記物加到ECI緩沖液中制備50mL，混合均勻，酶標(biāo)記物在孵板結(jié)束前的10min內(nèi)制備完成。

2.6 洗板及加酶標(biāo)記物稀釋液 孵育結(jié)束后，將反應(yīng)孔中的試劑倒出，加入250uL的1倍PBST緩沖液，之后快速倒出，重復(fù)6～8次，將微孔板倒扣在吸水紙上以控干孔中殘留液體。在各反應(yīng)孔中加入100uL酶標(biāo)記物稀釋液。

2.7 孵育及PNP底物的制備 在25℃恒濕箱中孵育2h，孵育結(jié)束前的15min制備PNP底物溶液。在室溫下用5mL PNP緩沖液（1倍濃度）溶解1片PNP底物片。避免直接接觸PNP底物片或?qū)⒌孜锶芤罕┞对趶?qiáng)光下，直接接觸或強(qiáng)光刺激會在陰性反應(yīng)孔中導(dǎo)致背景色干擾。

2.8 洗板、加PNP底物溶液、孵育 洗板同2.6，在各反應(yīng)孔中加入100uL PNP底物溶液。在恒濕箱中黑暗孵育60min，避免光直射或強(qiáng)光。

2.9 數(shù)據(jù)判定 使用酶標(biāo)儀在405nm波長下測量結(jié)果，數(shù)值高于陰性對照2倍數(shù)值，判定為陽性，小于或等于陰性對照的判斷為陰性。

3 結(jié)果和分析

3.1 不同馬鈴薯樣本的病毒檢出率 通過對烏魯木齊周邊主產(chǎn)縣的92份樣本的檢測結(jié)果，對樣本進(jìn)行PVX、PVY、PVS、PLRV病毒檢測，其中PLRV檢測率為0，PVS檢測率最高，試管苗為4.55%，原原種為12.5%，商品薯為8.33%，原種為5%。其次PVY病毒帶毒率偏高，原種檢測率為15%，商品薯為8.33%。PVX有零星發(fā)生，未脫毒試管苗帶毒率2.27%。其中PVS在4種病毒中樣本檢測率最高，達(dá)6.52%，說明大田生產(chǎn)中該病毒侵染力強(qiáng)，實(shí)驗(yàn)室脫毒較難脫去，造成PVS檢測率高于原原種及試管苗。其次為PVY在3種樣本中均發(fā)生，說明該病毒較其他病毒難脫除，且脫毒率低于PVS。

3.2 不同馬鈴薯品種的病毒檢出率 從表2得出，檢測92份樣本材料中16個(gè)品種都不含PLRV病毒，其中T系列1個(gè)樣本檢測帶PVX，冀張薯12號、黑金剛、大西洋、T系列5個(gè)樣本檢測帶PVY，T系列、紅寶石品種6個(gè)樣本檢測帶PVS，其中T5品種攜帶2種病毒，所有品種帶毒檢測率為13.04%。

4 結(jié)論

通過對烏魯木齊地區(qū)周邊馬鈴薯樣本的檢測可知，馬鈴薯種苗不是完全符合脫毒種薯的標(biāo)準(zhǔn)要求，需連續(xù)對農(nóng)民使用的種薯進(jìn)行病毒檢測，為使用脫毒種薯提供保證。由于病毒檢測試劑盒只能定量分析，微量病毒的檢測還需分子方法鑒定分析。目前原種和商品薯檢測率分別為80%、83.33%，說明脫毒種薯的質(zhì)量還需進(jìn)一步提高。在種薯生產(chǎn)各環(huán)節(jié)中，定期病毒檢測的質(zhì)量監(jiān)測至關(guān)重要，只有從源頭保證無毒侵染，才能保證種薯繁育質(zhì)量。

馬鈴薯病毒與蚜蟲傳播及大田生產(chǎn)中切種和機(jī)械等操作有關(guān)，在各環(huán)節(jié)應(yīng)注意工具消毒，及時(shí)預(yù)防并控制蚜蟲種群數(shù)量，適時(shí)殺秧，從基本環(huán)節(jié)降低病毒的發(fā)生和侵染傳播。

參考文獻(xiàn)

[1]SALAZARL.F.馬鈴薯病毒及其防治[M].閻文昭，張勇飛，譯.北京：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)技術(shù)出版社，2000.

[2]吳麗萍，王蒂，司懷軍，等.馬鈴薯S病毒的RT-PCR檢測[J].中國馬鈴薯，2006，20（4）：200-203.

[3]肖雅，何長征，聶先舟等.馬鈴薯病毒病防治策略[J].中國馬鈴薯，2008（2）：106-110.

[4]王子民，時(shí)家寧，宮海建.馬鈴薯病毒病的發(fā)生及防治[J].現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009（7）：118.

[5]吳興泉，陳士華，謝聯(lián)輝.馬鈴薯X病毒的分子鑒定與檢測技術(shù)[J].河南農(nóng)業(yè)科學(xué)，2005（2）：72-75.

（責(zé)編：王慧晴）