基于LC－MS／MS研究補腎化瘀生新方在大鼠體內的入血成分*

劉雪曼，張金生，張寶霞

1.河南中醫藥大學，河南 鄭州450046；2.河南中醫藥大學第三附屬醫院，河南 鄭州450008；3.河南中醫藥大學第一附屬醫院，河南 鄭州450000

補腎化瘀生新方由熟地黃、巴戟天、川芎、當歸、石斛、肉桂、甘草等7味中藥組成，具有補腎活血、化瘀生新的功效。前期研究表明，補腎化瘀生新方協同靜脈注射骨髓間充質干細胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）可延緩衰老，有抗衰防衰的作用［1］，其延緩細胞衰老的作用可能與降低β－半乳糖苷酶活性、激活端粒酶活性、提高BMSCs增殖分化能力有關［2］。

中藥及其復方成分復雜多樣，認為被吸收入血的成分有可能產生藥效［3－4］。本文在前期研究基礎上，采用血清藥物化學研究方法，應用液相色譜－串聯質譜（LC－MS／MS）技術分析補腎化瘀生新方的吸收入血成分，以期探討其藥效物質基礎和作用。

1 材料

1.1 動物SPF級SD大鼠40只，雄性，6～8周齡，體質量（200±10）g，購于河南省實驗動物中心，動物合格證號：41003100006978。飼養于河南中醫藥大學第三附屬醫院實驗動物中心，溫度18～22℃，濕度30%～60%，明暗周期各12 h，自由采食、飲水。本實驗經河南中醫藥大學倫理委員會批準，并按照相關要求嚴格執行，倫理批號：DWLL2018030051。

1.2 藥物與試劑補腎化瘀生新方：熟地黃12 g（批號：181101）、巴戟天10 g（批號：181001）、肉桂3 g（批號：180801）、石斛10 g（批號：180801）、川芎15 g（批號：180801）、當歸12 g（批號：181101）、甘草3 g（批號：181001），上述中藥均購于安徽三義堂中藥飲片有限公司，并經河南中醫藥大學藥學院崔瑛教授鑒定。對照品：阿魏酸（批號：CHB180206）、梓醇（批 號：CHB181129）、地 黃 苦 苷（批 號：CHB180129）、大黃素甲醚（批號：CHB180730）、黃芩苷（批號：CHB190115）、甲基異茜草素（批號：CHB190120），純度均≥98%，均購自成都克洛瑪生物科技有限公司；甲醇（色譜純，賽默飛世爾科技有限公司，貨號：A452－4）；甲酸（色譜純，賽默飛世爾科技有限公司，貨號：85174）。

1.3 儀器Orbitrap Fusion、Xcalibur質譜工作站、SPD2010－230 SpeedVac離心濃縮儀、Heraeus Multifuge X1R型高速臺式冷凍離心機（Thermo Fisher Scientific公司）；BE－3100型超級混勻小精靈（海門市其林貝爾儀器制造有限公司）；XH－C旋渦混合器（金壇市國旺實驗儀器廠）；十萬分之一電子天平（METTLER TOLEDO公司）；Milli－Q處理純凈水（Millipore公司）；Thermo Accucore C18色譜柱（100 mm×2.1 mm，2.6μm）；Mass Frontier 6.0工作站。

2 方法

2.1 溶液的制備

2.1.1 補腎化瘀生新方溶液的制備熟地黃、巴戟天、當歸、川芎、肉桂、石斛、甘草等7味中藥，加12倍量水煎煮提取2次，每次1 h，過濾，合并濾液，濃縮，備用。

2.1.2 對照品溶液的制備取阿魏酸、黃芩苷、梓醇、地黃苦苷、甲基異茜草素、大黃素甲醚各對照品適量，精密稱定，用甲醇溶解，定容配置成0.01 g·L－1的對照品溶液備用。

2.2 動物給藥與含藥血清樣品采集將40只大鼠隨機分為空白組和給藥組，每組20只。根據前期實驗結果［2］，給藥組以122.9 g·kg－1的劑量給大鼠灌胃補腎化瘀生新方，空白組灌胃等體積的蒸餾水，早晚各1次，連續給藥7 d，第7天下午末次給藥后麻醉，腹主動脈取血，室溫靜置30 min后，離心半徑12 cm、3 500 r·min－1離心15 min，取 血 清，用0.22μm過濾器無菌過濾，標記，－80℃保存備用。

2.3 血清樣本的處理血清樣品置于室溫下解凍后，取100μL血清樣品，加入3倍量的甲醇，渦旋30 s，1 500 r·min－1混懸10 min，12 000 r·min－1離心10 min，取上清液，45℃下干燥2 h，殘渣用200μL甲醇復溶，渦旋30 s，1 500 r·min－1離心10 min，取上清，12 000 r·min－1離心10 min，取上清，進樣分析。

2.4 質譜與色譜條件

2.4.1 質譜條件電噴霧離子源（ESI），DMSS2模式，正、負離子分別掃描，掃描范圍：m／z 120～1200。噴霧電壓3 500（＋）／2 500（－）伏，離子傳輸管溫度300℃，自動增益控制目標：4.0e5，最大注入時間50 ms。

2.4.2 色譜條件Thermo Accucore C18色譜柱（100 mm×2.1 mm，2.6μm），以甲醇（A）和0.1%甲酸水（B）為流動相，流速0.2 mL·min－1，梯度洗脫（0.00～5.00 min 95%→55%B，5.00～14.00 min 55%→37%B，14.00～26.00 min 37%→10%B，26.00～34.00 min 10%→0%B，34.00～35.00 min 0%B），柱溫30℃，進樣量5μL，檢測波長254 nm。

2.5 補腎化瘀生新方中入血成分的鑒定應用LC－MS／MS技術，對大鼠灌胃補腎化瘀生新方后的含藥血清、空白血清及對照品溶液進行對比分析，應用Xcalibur軟件以精確m／z提取離子峰以確定保留時間，運用Mass Frontier 6.0工作站匹配特征碎片離子，結合文獻相關信息，鑒別化合物結構，確定入血成分。

2.6 補腎化瘀生新方中入血成分的濃度測定取阿魏酸、黃芩苷、梓醇、地黃苦苷、甲基異茜草素、大黃素甲醚各對照品溶液適量，按一定比例用甲醇由高到低配制成6個濃度梯度的混合對照品溶液，分別進樣分析，記錄對應峰面積，以進樣濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標，繪制標準曲線，計算樣品濃度。

2.7 統計學方法使用Excel 2010軟件對實驗數據進行歸納、整理，應用SPSS 21.0軟件進行線性回歸分析。

3 結果

3.1 補腎化瘀生新方入血成分的鑒定最終鑒定出補腎化瘀生新方的入血成分6個，見表1。其中來源于熟地黃的化學成分2個，分別是地黃苦苷、梓醇；來源于巴戟天的化學成分2個，分別是大黃素甲醚、甲基異茜草素；來源于當歸的化學成分為黃芩苷；阿魏酸主要來源于當歸或川芎；其中代表性成分地黃苦苷、大黃素甲醚提取離子流色譜圖，見圖1。

表1 6個化學成分鑒定結果

3.2 測定補腎化瘀生新方在大鼠體內的入血成分濃度經LC－MS／MS分析，補腎化瘀生新方入血成分中阿魏酸、黃芩苷、梓醇、地黃苦苷、甲基異茜草素、大黃素甲醚6個化學成分的濃度。見表2。

圖1 對照品（a）、含藥血清（b）的代表性成分LC－MS／MS色譜圖

表2 6個化學成分體內濃度

4 討論

中藥復方的藥效物質基礎及作用機制研究是中醫藥現代化發展的核心問題［5－6］，因中藥復方所含化學成分復雜多樣，其所屬化學成分并非復方內單味藥物化學成分的簡單組合，而是復方中各味中藥間共同作用的結果。補腎化瘀生新方由7味中藥組成，所含化學成分繁雜。本實驗采用血清藥物化學研究方法，應用LC－MS／MS技術分析空白血清與含藥血清，快速分離并尋找藥物入血成分，通過對入血成分進行分析最終確定梓醇、地黃苦苷、甲基異茜草素、大黃素甲醚、黃芩苷、阿魏酸6個化合物為補腎化瘀生新方大鼠體內吸收入血成分。

藥理研究表明，阿魏酸通過刺激血管內皮生長因子、PDGF和HIF－1α顯示出血管生成活性，其血管生成作用可通過調控MAPK和PI3K途徑發生，是缺血性疾病的潛在新治療劑［7－9］。低濃度的阿魏酸通過上調SIRT1、SIRT7和MDM2蛋白表達發揮神經保護、增殖作用，高濃度的阿魏酸可誘導神經分化和神經突起生長［10］。地黃苦苷對腦缺血再灌注損傷有神經保護作用，其機制可能與抑制過氧化亞硝酸鹽介導的有絲分裂激活有關［11］。黃芩苷可抑制炎癥反應、抗氧化應激、保護線粒體、促進神經元保護因子表達、抑制細胞凋亡和壞死，從而發揮對腦缺血大鼠的腦保護作用［12－15］。梓醇可抑制腫瘤壞死因子－α、白細胞介素－6的水平，從而改善機體微炎癥狀態［16］，通過上調大鼠大腦皮質神經生長因子、腦源性神經營養因子及其基因的表達，促進缺血性病灶周圍神經元軸突生長，使芽生軸突形成新的突觸連接，增強突觸結構可塑性，從而促進神經元存活、修復再生，加速神經功能恢復［17－18］。研究發現，梓醇可通過調節細胞內Ca2＋穩態、降低線粒體損傷、抑制ERK1／2和PARP－1激活進而抑制細胞凋亡，保護細胞免受缺血缺氧性損傷，具有延緩衰老作用［19－21］。甲基異茜草素通過抑制破骨細胞的形成、分化和骨吸收功能來減少骨質丟失［22－23］，另還具有抗炎、免疫調節的作用［24］。研究發現，腎精不足小鼠與腫瘤小鼠的基因表達譜存在相似性，主要體現在細胞分化、細胞周期調節及細胞功能等，這為臨床應用補腎填精法治療癌癥提供了借鑒［25］。巴戟天具有補腎陽、壯筋骨、祛風濕功效，其中有效成分大黃素甲醚具有廣泛抗癌作用［26］，可抑制多種癌細胞系的生長，如鼻咽癌、肝癌、乳腺癌等，作用機制可能與誘導細胞凋亡與自噬、阻斷細胞周期進程、抑制癌細胞轉移有關［27－30］。

經與文獻對比及前期化學成分研究，認為6個入血成分主要來源于熟地黃、巴戟天、當歸、川芎，提示這4味中藥可能對補腎化瘀生新方在體內發揮藥效起主要作用。6個化合物分屬于環烯醚萜苷類、蒽醌類、黃酮類及有機酸類，提示這些成分可能是該方發揮藥效的物質基礎。在后續研究中，課題組將會進一步探討入血成分的生物活性，以便更好地探究補腎化瘀生新方的藥效物質基礎及作用機制。