長期施肥對黃棕壤細菌多樣性的影響

劉東海，喬 艷，李雙來，陳云峰，張 智，李 菲，胡 誠*

（1 湖北省農業科學院植保土肥研究所，湖北武漢 430064；2 農業農村部武漢黃棕壤生態環境重點野外科學觀測試驗站，湖北武漢 430064）

土壤微生物是土壤生態系統的重要組分[1]，其參與土壤有機質的降解、腐殖質形成和養分轉化循環等過程，是反映土壤環境的重要敏感指標[2-3]。目前土壤微生物高通量測序技術已經成熟，比傳統的土壤微生物研究方法成本低[4]，可批量直接測序土壤微生物基因，提高了測序通量，豐富了試驗研究的信息量，使土壤微生物研究更為深入。

長期施肥可改變土壤理化性質和生物活性，影響作物產量[5]及土壤微生物群落多樣性[6]。Geisseler等[7]利用來自世界各地64項長期試驗的107個數據集的分析顯示，不同的作物管理措施、土壤環境及長期施用無機肥料等對土壤微生物的影響差異很大；Geisseler等[8]對水稻系統研究的文獻綜合分析得出的結論類同。目前針對黃棕壤的研究集中在產量、土壤理化性質和CO2等方面[9-11]，關于黃棕壤微生物多樣性的研究較少。因此以農業農村部武漢黃棕壤生態環境重點野外科學觀測試驗站連續35年的長期定位施肥的黃棕壤為研究對象，利用高通量測序技術，探索在稻麥輪作制度下，長期不同施肥管理模式對土壤微生物多樣性的影響，以了解土壤的長期培肥效應，為提高黃棕壤土地生產力和可持續發展提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗地概況

試驗在農業農村部武漢黃棕壤生態環境重點野外科學觀測試驗站進行，基地位于湖北省武漢市洪山區湖北省農業科學院南湖試驗站 (北緯30o28′，東經114o25′)，本區為北亞熱帶向中亞熱帶過渡的地理氣候帶，光照充足、熱量豐富、無霜期長、降水充沛。年平均日照時數為2080 h，日平均氣溫 ≥ 10℃的總積溫為5190℃，年降雨量1300 mm左右，年蒸發量1500 mm，無霜期230～300 天。土壤類型為黃棕壤發育的黃棕壤性水稻土，屬潴育水稻土亞類，黃泥田土屬。地形是壟崗平原，海拔高度20 m。提水灌溉，排灌方便。

試驗于1981年水稻生長季開始，試驗前耕層土壤 (0—20 cm) 的主要性狀為：有機質 27.40 g/kg、全氮 1.80 g/kg、全磷 1.00 g/kg、全鉀 30.20 g/kg、堿解氮 151.00 mg/kg、銨態氮 9.40 mg/kg、有效磷 5.0 mg/kg、速效鉀 98.50 mg/kg、pH 6.30。

1.2 試驗設計

試驗共設5個處理：不施肥對照 (CK)；氮磷鉀化肥 (NPK)；常量有機肥 (OM)；氮磷鉀+常量有機肥 (NPK+OM)；氮磷鉀+高量有機肥 (NPK+OMM)。供試化肥為尿素 (N46%)、磷酸一銨 (N 10%、P2O546%)、氯化鉀 (K2O 60%)，每年施用量為純 N 150 kg/hm2、P2O575 kg/hm2、K2O 150 kg/hm2，N∶P2O5∶K2O=1∶0.5∶1。有機肥料為鮮豬糞，堆置田頭一周腐熟后施用，其含水量 69%、C 282.1 g/kg、N 15.1 g/kg、P2O520.8 g/kg、K2O 13.6 g/kg (干基)。常規施用量為鮮豬糞 11250 kg/hm2，高量施用量為鮮豬糞 18750 kg/hm2，耕作制度為一年兩熟，水稻–小麥輪作，水稻和小麥化肥施用量分別占全年施肥量的60%和40%，有機肥施用量各占50%。水稻和小麥季磷鉀肥均采用移栽或播種前一次基施，氮肥施用水稻為基施40%、分蘗肥40%、穗肥20%；小麥為基肥50%、臘肥（冬季肥）25%、拔節肥25%。

1.3 樣品采集

試驗于2016年10月水稻收獲后采集土壤樣品，采樣深度為0—20 cm，每個小區9點采樣，剔除石礫和植物殘根等雜物后混合，然后裝入已消毒的自封袋中，放入冰盒中帶回實驗室。每個小區的混合土樣分為兩部分，一部分用于化學指標測試，另一部分放置于–80℃冰箱保存，用于DNA提取和高通量測序。

1.4 試驗方法

土壤堿解氮用堿解擴散法，有效磷用紫外可見分光光度法，速效鉀用火焰光度法，有機碳用重鉻酸鉀法，土壤pH采用1∶2.5的土水比—復合電極測定[12]。

土壤總 DNA 采用 E.Z.N.A Soil NDA Kit (Omega Bio-tek，Norcross，GA，U.S.) 提取，利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測提取的基因組NDA。對16S rRNA基因的V3～V4高變區片段進行PCR擴增，引物序列為338F (5′– ACTCCTACGGGAGGC AGCAG–3′)和806R (5′–GGACTACHVGGG TWTCTAAT–3′)。擴增條件為：95℃ 預變性 2 min；接著 95℃ 變性 30 s，55℃ 退火 30 s，72℃ 延伸 30 s，進行25個循環；循環結束后72℃最終延伸5 min。每個樣本3個重復，將同一樣本的PCR產物混合后用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，使用AxyPrepDNA凝膠回收試劑盒 (AXYGEN公司) 切膠回收PCR產物，Tris_HCl洗脫；2%瓊脂糖凝膠電泳檢測。參照電泳初步定量結果，將PCR產物用QuantiFluorTMST藍色熒光定量系統 (Promega公司) 進行檢測定量，按照每個樣本的測序量要求，進行相應比例的混合。在上海美吉生物醫藥科技有限公司的Illumina Miseq PE300平臺分別進行細菌測序。

1.5 數據統計及分析

采用單因素方差分析判斷各處理水稻產量、土壤理化性質和細菌群落α多樣性，多重比較采用最小顯著差數法 (LSD，P＜0.05)，分析軟件為SPSS 20.0 (SPSS Inc.，Chicago，IL，USA)。利用 R (3.51)分析軟件，用“plspm”包做偏最小二乘法路徑回歸分析 (PLS-PM)，細菌群落結構采用測序后經過抽平處理的OTU數據。運用Canoco 5.0 軟件做細菌群落與環境因子間的冗余分析 (RDA)。

2 結果與分析

2.1 土壤基礎化學性質和產量

長期不同施肥對土壤基礎化學性質影響顯著(表1)。與CK相比，施肥處理可顯著增加土壤堿解氮、有效磷、速效鉀和有機碳含量 (P＜0.05)。單施有機肥和有機無機肥配施能夠維持pH穩定，長期單施NPK降低了土壤pH。與NPK處理比較，OM、NPK+OM和NPK+OMM處理的堿解氮、有效磷和有機碳含量顯著提高；NPK+OM和NPK+OMM處理的速效鉀含量顯著提高。與OM相比，NPK+OM和NPK+OMM處理的堿解氮和有機碳含量沒有顯著增加，NPK+OM只顯著增加了速效鉀含量，而NPK+OMM處理顯著增加了有效磷和速效鉀含量。與CK處理比較，4個施肥處理均顯著提高了水稻產量，但這4個施肥處理間產量無顯著差異。

表 1 不同施肥處理土壤化學性質及產量Table 1 Soil chemical property and rice yield under long-term fertilizer treatments

2.2 長期不同施肥土壤細菌群落結構

2.2.1 土壤細菌α多樣性變化 不同施肥處理土壤細菌豐富度指數 (Chao)和多樣性指數 (Shannon) 如表2所示。長期施肥能夠提高細菌群落的豐富度，從大到小排序 OM＞NPK+OM＞NPK+OMM＞NPK＞CK。與NPK處理比較，OM、NPK+OM和NPK+OMM處理Chao指數分別提高了7.61%、3.90%和3.24%，Shannon指數分別提高了2.51%、–0.31%和–1.26%。說明施用有機肥較化肥更有利于提高土壤細菌豐富度，但是長期高量有機肥和無機肥配施(NPK+OMM) 細菌豐富度指數提高的幅度變小，同時多樣性指數有所降低。與CK處理相比，OM處理提高了細菌多樣性 (2.83%)，NPK和NPK+OM處理維持平衡 (0.31%和0.00%)，NPK+OMM處理降低了細菌群落多樣性 (–0.94%)。總的來看，長期單施常量有機肥提高了細菌的豐富度和多樣性，但長期高量有機肥和無機肥配施 (NPK+OMM)，細菌多樣性有所降低。

表 2 不同施肥處理土壤細菌α-多樣性指數Table 2 α-diversity of soil bacteria under long-term fertilizer treatments

相關性分析結果 (表3)顯示，長期施肥后水稻產量與土壤堿解氮和土壤有機碳（SOC)含量顯著正相關，且土壤SOC含量的增加可顯著增加細菌豐富度。堿解氮、有效磷、速效鉀、SOC和pH與土壤細菌α-多樣性指數 (Shannon) 沒有顯著相關性，SOC與豐富度指數 (Chao) 顯著正相關。

表 3 土壤理化性質與土壤細菌α-多樣性指數和產量的相關性Table 3 Correlations of soil chemical properties, bacterial α-diversity indices and yield

2.2.2 長期不同施肥下土壤細菌群落結構變化 偏最小二乘法判別分析 (PLS-DA) 發現，不同施肥處理對細菌群落 (綱水平) 的影響存在顯著差異 (圖 1)。CK、NPK、OM和有機無機肥配施 (NPK+OM和NPK+OMM) 細菌群落結構形成4個不同的分組，其中CK處理細菌群落結構最松散，組內差異較大，而不同施肥處理都提高了細菌群落的緊密度，尤其NPK+OM和NPK+OMM處理細菌群落結構更接近。

圖 1 細菌群落綱水平PLS-DA分析Fig.1 PLS-DA analysis of bacterial community at the class level

細菌門水平群落組成主要是綠彎菌門 (19.22%～31.20%)、變形菌門 (19.87%～25.89%)、放線菌門(14.53%～21.31%)、酸桿菌門 (13.63%～15.59%)、硝化螺旋菌門 (6.11%～8.33%)和芽單胞菌門 (2.23%～3.27%)，共占群落組成比重的88.73%～91.41% (圖2a)。圖2b顯示，細菌綱水平群落組成主要是放線菌綱(14.53%～21.31%)、酸桿菌綱 (13.63%～15.59%)、厭氧繩菌綱 (6.85%～16.14%)、硝化螺旋菌綱(6.11%～8.33%)、α-變形菌綱 (4.67%～7.85%)、β-變形菌綱 (3.67%～5.20%)、δ-變形菌綱 (9.73%～12.09%)、綠彎菌綱 (1.82%～4.37%)、芽單胞菌綱(2.23%～3.27%)、γ-變形菌綱 (1.03%～2.04%)。

圖 2 不同處理土壤細菌在門和綱水平上的類群組成Fig.2 Soil bacterial composition at the levels of phylum and class under different treatments

與 CK 比較，單施化肥 (NPK)、有機肥 (OM) 或者有機無機肥配施 (NPK+OM和NPK+OMM) 處理均提高了土壤 α-變形菌綱 (13.35%～67.93%)、β-變形菌綱(4.89%～41.76%)和γ-變形菌綱(16.61%～98.28%) 的相對豐度，降低了綠彎菌門的厭氧繩菌綱 (7.00%～57.53%)和綠彎菌綱(27.61%～58.25%) 相對豐度；NPK處理降低了放線菌綱 (8.20%)和硝化螺旋菌綱 (7.37%)相對豐度，提高了酸桿菌綱 (13.02%)相對豐度。OM、NPK+OM和NPK+OMM處理分別提高了放線菌綱相對豐度34.62%、29.61%和0.38%，OM、NPK+OM和NPK+OMM處理的酸桿菌綱相對豐度基本無變化(–0.89%～1.81%)；OM降低了硝化螺旋菌綱(18.81%) 相對豐度。

與NPK處理比較，OM處理顯著提高了變形菌門中的 α-變形菌綱 (48.15%)、β-變形菌綱 (32.26%)、γ-變形菌綱 (70.03%)和放線菌綱 (46.65%) 相對豐度，顯著降低了綠彎菌綱 (41.97%)和厭氧繩菌綱(53.99%) 相對豐度；NPK+OM和NPK+OMM處理相應的細菌相對豐度則變化不顯著。與NPK+OM處理比較，NPK+OMM處理分別降低了放線菌綱(22.55%)和α-變形菌綱相對豐度 (5.93%)，提高了厭氧繩菌綱 (31.42%)、綠彎菌綱 (49.91%)和硝化螺旋菌綱 (30.04%) 相對豐度。

2.3 土壤性質對土壤細菌群落結構的影響

環境因子影響黃棕壤水稻土細菌群落 (綱水平)（圖3）。RDA分析的第一軸和第二軸解釋度合計31.85%，說明在水稻季，除SOC、有效磷 (AP)、堿解氮 (AN)和pH等環境因子外，還有其他的土壤性質影響細菌群落結構。pH與細菌群落結構 (路徑系數=–0.48)和多樣性 (路徑系數=–0.16) 負相關，而SOC、有效磷、堿解氮和速效鉀則顯示正相關。

圖 3 土壤細菌群結構和土壤理化性質的RDA分析Fig.3 Redundancy analysis of the correlation between soil chemical properties and bacterial community structure

為了更好地研究土壤理化指標、細菌群落結構、細菌多樣性以及產量的相互關系，構建了偏最小二乘路徑模型 (PLS-PM，圖4)。擬合優度(goodness-of-fit)為0.615，模型擬合度較好。結果顯示土壤理化指標中的SOC、堿解氮、有效磷和速效鉀對細菌群落結構正調控 (路徑系數=0.36)，pH 對細菌群落結構負調控 (路徑系數=–0.48)；但是土壤理化指標中SOC、堿解氮、有效磷和速效鉀對細菌多樣性的調控較小 (路徑系數=0.24)。調控產量的理化指標主要是SOC、堿解氮和有效磷。土壤細菌多樣性對產量顯示正調控 (路徑系數=0.42)。

圖 4 最小二乘路徑模型分析Fig.4 Directed graph of the partial least squares path model (PLS-PM)

3 討論

3.1 土壤理化性質對長期施肥的響應

長期不同施肥對土壤化學性質產生了顯著影響。與CK相比，施肥處理能顯著增加土壤堿解氮、有效磷、速效鉀和有機碳含量，與以往對水稻土的研究結果[13-14]一致。施肥顯著提高水稻產量，最小二乘路徑模型分析顯示理化指標與產量正相關 (路徑系數=0.47)，但施肥處理間差異不顯著；與其他施肥處理相比，長期NPK+OMM處理水稻產量出現降低趨勢，最小二乘路徑模型分析顯示土壤細菌群落多樣性與產量正相關 (路徑系數=0.42)，因此土壤細菌群落多樣性或許可作為產量評估的參考指標。

3.2 土壤細菌多樣性對長期施肥的響應

本研究發現，施肥處理間細菌α多樣性差異不顯著，與前期研究[2,15-16]在水稻土上施用無機肥料和有機肥對細菌群落α多樣性的影響較小的結論一致。土壤pH是影響細菌群落的重要因素[17-18]，偏最小二乘路徑模型分析顯示pH與細菌群落結構負相關(路徑系數=?0.48)，但是施肥處理間pH沒有顯著差異。相關性分析、冗余分析 (RDA)和偏最小二乘路徑模型分析都顯示土壤理化指標對細菌多樣性的影響小，可能是由于水稻季水分因素對微生物群落的影響[19]。本研究NPK+OMM處理高量糞肥投入細菌多樣性較其他施肥處理有下降的趨勢，與Liu等[20]的研究結論一致。單施化肥或有機無機肥配施均能提高土壤細菌群落豐富度，與陸海飛等[21]的研究結論相同，但長期大量有機無機肥配施促進共營養生物的生長，同時導致細菌多樣性的降低，進而可能導致生態系統不穩定[22]。

3.3 土壤細菌群落組成對長期施肥的響應

本研究長期不施肥 (CK)、施用NPK以及有機肥(OM、NPK+OM和NPK+OMM) 處理土壤細菌群落結構存在顯著差異，其中NPK+OM和NPK+OMM處理細菌群落結構更為接近，證實了長期施用不同肥料土壤中的細菌群落結構會發生顯著變化[22-23]；Shen等[24]指出施用有機肥的土壤細菌群落結構緊密聚集，與本研究未施用有機肥和施用有機肥的土壤細菌群落結構明顯不同的結論一致。可能因為有機糞肥 (豬糞) 中含有的豐富的細菌類群為厚壁菌門、擬桿菌門和放線菌門，施入土壤引起土壤細菌群落結構變化[23]。

本研究中黃棕壤性水稻土細菌門水平群落組成主要是綠彎菌門、變形菌門、放線菌門和酸桿菌門，與Wang等研究的有關水稻土細菌群落的結論[15-16,25]一致。本研究中，與CK 比較，施肥處理提高了α-變形菌綱、β-變形菌綱和γ-變形菌綱的豐度，尤其OM處理顯著提高它們的豐度。α-變形菌在碳循環中具有重要的作用[26-27]，能夠利用難降解的碳源并降解為中間小分子物質，為其它微生物提供養分，因此可能導致OM處理的細菌多樣性最高；同時OM處理α-變形菌綱豐度高，有助于改善土壤肥力，甚至有助于植物生長[28]。CK處理綠彎菌門的厭氧繩菌綱和綠彎菌綱相對豐度最高，而綠彎菌門中大多數物種都是嚴格的厭氧菌[29-30]，側面反映CK處理土壤氧含量不足，而根際氧的缺乏會導致養分礦化速率減小，影響了根系對養分的吸收[31]，進而間接影響作物產量。與CK 比較，單施有機肥和有機無機肥配施均降低了綠彎菌門的厭氧繩菌綱和綠彎菌綱豐度，提高了放線菌豐度，尤其OM處理變化最顯著，與Liu等[20]指出的長期施用糞肥顯著促進變形菌和放線菌的生長結論一致。放線菌具有高度通用的降解能力，并在土壤碳礦化中起關鍵作用[32-33]，促進作物生長。NPK處理顯著提高了酸桿菌綱豐度，而單施有機肥和有機無機肥配施處理酸桿菌綱豐度基本無變化。酸桿菌跟土壤的pH存在一定的正相關關系[27,34]，證實了施用NPK會降低土壤pH。NPK+OMM處理提高了硝化螺旋菌綱豐度，硝化螺旋菌是氮循環微生物群落的關鍵組成部分[35]，負責將亞硝酸鹽氧化為硝酸鹽[36]，硝酸鹽向下移動，在水稻土厭氧層中經過反硝化作用轉化為分子氮 (N2)，從而降低了氮的利用效率[37]，可能因此間接導致NPK+OMM處理水稻產量較低。

4 結論

在試驗期限內，養分投入足夠的條件下，單施化肥、單施有機肥或者化肥有機肥配施尚沒有對水稻產量產生顯著的影響，但土壤速效養分和有機碳含量發生了顯著的變化。施肥沒有顯著改變土壤pH，與單施化肥相比，單施有機肥或者有機無機肥配施顯著提高了土壤有機碳和堿解氮含量，有機無機肥配施還顯著提高了有效磷和速效鉀含量。各施肥處理土壤細菌α多樣性無顯著差異，但細菌群落結構差異顯著。單施有機肥處理土壤α-變形菌綱和放線菌綱相對豐度最高，綠彎菌門的厭氧繩菌綱和綠彎菌綱以及硝化螺旋菌綱相對豐度最低；單施化肥降低了放線菌綱和硝化螺旋菌綱相對豐度，提高了酸桿菌綱相對豐度。與低量有機肥投入相比，高量有機肥投入降低了放線菌綱和α-變形菌綱相對豐度，提高了厭氧繩菌綱、綠彎菌綱和硝化螺旋菌綱相對豐度。偏最小二乘路徑模型 (PLS-PM) 結果顯示土壤理化指標中的SOC、堿解氮、有效磷和速效鉀對細菌群落結構具有正調控，pH為負調控，但都對細菌多樣性的調控較小。土壤SOC、堿解氮、有效磷和細菌多樣性對產量具有正調控作用。