不同施肥模式對土壤氮循環功能微生物的影響

郭俊杰，朱 晨，劉文波，王建中，凌 寧，郭世偉*

（1 南京農業大學資源與環境科學學院/江蘇省固體有機廢棄物資源化研究重點實驗室，江蘇南京 210095；2 溧陽市南渡鎮農業綜合服務站，江蘇常州 213371）

土壤氮循環是農業生態系統的關鍵組成部分，主要包括氨化、硝化、反硝化和固氮等過程[1-2]。從本質上講，氮循環是由植物、真菌、細菌和古菌等共同催化的氮化合物氧化還原反應網絡[3]，其中微生物是主要的驅動者[4]。研究表明，微生物對其定殖環境的變化非常敏感[5]。作為農業生態系統中主要的人為干擾因素，施肥能夠通過改變土壤微環境，塑造土壤微生物群落，進而影響土壤氮循環過程[6-7]。基于氮素生物地球化學所涉及微生物功能基因的定量分析已被證明能夠有效提供關于行使氮轉化功能的微生物群落動態及其生態學信息，有助于將功能微生物類群與土壤性狀以及實際氮轉化生態過程直接聯系，以提高對土壤氮循環關鍵微生物過程及機制的理解[8]。不同施肥模式對氮循環各功能基因具有顯著不同的影響[6-7]。但是，大多數研究主要集中在涉及特定氮轉化過程的一種或幾種功能基因[6-8]，關于施肥模式對整個土壤氮循環相關微生物群落的影響仍缺乏足夠的認知。

在參與氮循環的微生物中，氨氧化微生物和反硝化微生物通常作為微生物生態學研究的模式微生物，以深入理解微生物群落在農業生態系統功能調控中的重要作用[9-10]。Petersen等[11]研究發現，氨氧化微生物和反硝化微生物的功能基因豐度是預測土壤硝化和反硝化潛在速率最重要的變量。相比于由多種不同的細菌、古菌和真菌所介導的反硝化過程，氨氧化過程僅由少數系統發育聚集的氨氧化古菌(AOA)和氨氧化細菌 (AOB) 完成，因而更適用于探究功能微生物類群與生態功能之間的聯系[8]。AOA和AOB在大多數土壤中共存，且通常AOA的豐度比AOB更豐富，因此AOA被認為是土壤氨氧化過程的主導微生物[12]。然而，一些研究卻提出了相反的結論，認為氨氧化活性的變化僅與AOB群落的豐度和組成有關，而與AOA的群落無關[13-14]。目前，AOA和AOB之間的生態位分異和功能互補已有較為明確的結論[15-16]，但是關于不同施肥模式下AOA與AOB對土壤硝化作用的相對貢獻仍有待于進一步研究。

本研究通過采集短期不同施肥模式田間試驗的土壤樣品，利用熒光定量PCR (q-PCR) 技術定量分析參與土壤氮循環過程的各類功能微生物基因豐度，探究土壤氮循環功能微生物對不同施肥模式的響應及其關鍵影響因素。同時，以氨氧化微生物為例，評估功能微生物類群與土壤生態功能間的內在聯系。本研究旨在明確施肥模式對土壤氮循環功能微生物類群及其氮轉化過程的影響，為制定更好的氮素管理策略提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 田間試驗地點與土樣采集

田間試驗始于2011年6月，地點位于中國江蘇省常州市溧陽市南渡鎮 (31°27′N，119°19′E)，為常規稻麥輪作生態系統。該地區氣候類型為北亞熱帶季風氣候，年平均氣溫與降雨量分別為17.5℃和1149.7 mm。土壤類型為白土型水稻土。

稻季試驗設置如下處理：1) 單施化肥 (NPK)，施肥量為N 351.75 kg/hm2、P2O575 kg/hm2和K2O 84 kg/hm2；2) 化肥+畜禽有機肥 (NPKM)，施肥量為N 282.75 kg/hm2、P2O575 kg/hm2、K2O 84 k g/hm2和有機肥 (鮮基) 1500 kg/hm2；3) 化肥+秸稈還田(NPKS)，施肥量為N 351.75 kg/hm2、P2O575 kg/hm2、K2O 84 kg/hm2和小麥秸稈 (干基) 3000 kg/hm2。其中，NPKM處理是在NPK處理基礎上減施20%化肥氮后增施有機肥。供試化肥種類為兩種復合肥 (N–P2O5–K2O 分別為16–16–16 以及20–12–16)和尿素，有機肥為豬糞有機肥。2014年10月底，水稻收獲后采集土壤樣品，同時采集相鄰江蘇省耕地質量監測點不施肥處理的土壤樣品作為對照 (CK)。在每個處理小區中，使用土鉆采集10個位點0—20 cm土層土壤樣品，混合后，過 2 mm篩除去雜質，之后分為三部分：一部分鮮土儲存在–80℃冰箱，用于土壤DNA提取；一部分儲存于4℃ 冰箱中，用于土壤銨態氮 (NH4+)和硝態氮 (NO3–)含量以及硝化潛勢的測定；剩余部分風干后用于土壤pH、土壤有機碳 (SOC)和全氮含量分析。

1.2 土壤理化性質分析

將0.01 mol/L CaCl2溶液與鮮土按照液土比為10∶1的比例混合后振蕩30 min，過濾后使用連續流動分析儀 (Autoanalyser 3，Bran Luebbe，Norderstedt，Germany) 測定土壤中銨態氮 (NH4+)和硝態氮 (NO3?)含量。使用 Vario MACRO cube 元素分析儀(ElementarAnalysensysteme GmbH，Hanau，Germany)測定風干土壤 (過 0.149 mm 篩) 的有機碳 (SOC)和全氮含量。將過 1 mm 篩的風干土壤與煮沸后冷卻的無 CO2去離子水按 1∶2.5 (質量∶體積) 比例混合，振蕩 30 min 并靜置 30 min，使用 pH 計 (PE-10，Sartorious，Germany) 測定土壤懸濁液的pH。

1.3 土壤DNA提取及實時熒光定量PCR

稱取 0.25 g 鮮土，使用 MoBioPowerSoilTMDNA提取試劑盒提取DNA。使用NanoDrop分光光度計 (NanoDrop Technologies，Wilmington，DE) 檢測所提取 DNA (最終體積，100 μL) 的質量和濃度。使用 ABI 7500熒光定量 PCR儀 (Applied Biosystems，America)和SYBR?Premix Ex TaqTM試劑盒 (Takara) 進行定量 PCR (qPCR)，分析氨化(gdh)、硝化 (AOA-amoA、AOB-amoA)、反硝化(narG、nirS、nirK、norB、nosZ)、固氮 (nifH)、硝酸鹽異化還原 (napA) 等氮循環過程相關功能微生物基因的豐度。qPCR 反應體系為25 μL，包含 1 μL DNA 模板，12.5 μL SYBR? Premix Ex TaqTM，0.5 μL 正、反向引物，0.5 μL ROX Reference Dye II(50 ×) 以及 10 μL ddH2O。氮循環功能基因引物序列詳見表1。

表 1 氮循環功能基因引物序列Table 1 The primer sets for amplification of functional genes involved in nitrogen cycle

1.4 硝化潛勢測定

按照Taylor等[25]和Ouyang等[14]的方法，通過測定添加與不添加 1-辛炔 (4 μmol/L Caq) 情況下的土壤硝化潛勢，確定AOA與AOB對硝化潛勢的相對貢獻。簡而言之，將4.5 g鮮土置于150 mL蓋有黑色瓶蓋和灰色橡膠塞的玻璃瓶中，加入30 mL 30 mmol/L TES(2-[[三 (羥甲基) 甲基]氨基]乙磺酸) 緩沖液(含 1.0 mmol/L NH4+，pH 7.2)，將瓶子在 30℃ 下以200 r/min振蕩2 h以均勻混合。之后，將瓶子分為兩組，其中一組立即加入1-辛炔氣體 (4 μmol/L Caq)，另外一組不添加1-辛炔作為對照。在振蕩后2與24 h分別采集5 mL土壤懸濁液。土壤懸濁液離心8 min (8000 r/min)，再用濾紙過濾至 10 mL 離心管。用連續流動分析儀 (AA3) 測定濾液中亞硝態氮(NO2?)和硝態氮 (NO3?) 的濃度。硝化潛勢通過(NO2?+NO3?) 濃度與時間的線性關系斜率表示。1-辛炔能夠使AOB的氨單加氧酶不可逆轉地失活，但對AOA無顯著的抑制作用[25]。因此，在1-辛炔存在下硝化潛勢為AOA (對1-辛炔拮抗) 介導的硝化潛勢。AOA的硝化潛勢與無1-辛炔存在下測定的總硝化潛勢之間的差值為AOB (對1-辛炔敏感) 所介導的硝化潛勢。

1.5 統計分析

單因素方差分析 (ANOVA) 用于檢驗施肥模式對氮循環功能基因豐度、硝化潛勢等的影響，并采用Fisher最小顯著性差異法 (LSD) 進行多重比較 (α=0.05，SPSS 16.0 for Windows，IBM Corp.，Armonk，NY，USA)。基于歐式距離矩陣，采用主成分分析(PCA)和單因素多元方差分析 (PERMANOVA)、置換多元分散分析 (PERMDISP) 比較樣品之間整體氮循環功能基因豐度的差異 (R 3.2.2, ape和vegan package)。使用相似度百分比分析 (SIMPER) 評估單一氮循環功能基因對施肥與對照處理之間功能微生物變異的相對貢獻[6](R 3.2.2，vegan package)。采用回歸分析評估總硝化潛勢和amoA基因豐度之間的關系、AOA或AOB所介導的硝化潛勢與其相應的AOA-amoA或AOB-amoA基因豐度之間的關系 (R 3.2.2，stats package)。通過前向選擇，篩選納入冗余分析 (RDA) 的土壤理化參數。使用RDA闡明土壤理化性質與氮循環功能基因豐度之間的關系，并使用蒙特卡羅置換 (Monte Carlo permutations) 檢驗其顯著性。使用逐步回歸分析土壤理化性質與單一氮循環功能基因豐度以及硝化潛勢的關系 (R 3.2.2，MASS package)。

2 結果與分析

2.1 不同施肥模式對氮循環功能基因豐度的影響

主成分分析 (PCA) 表明，不同施肥模式下土壤中氮循環功能基因豐度整體發生了顯著改變(PERMANOVAF=19.517，P=0.001；PERMDISPF=0.1682，P=0.915，圖 1)。PCA 1 軸與 2 軸分別解釋75.92%和8.68%的整體氮循環功能基因的變化。如圖1所示，各施肥模式可分為3組：CK處理的土壤與其他施肥處理下的土壤相比差異較大，作為一組；NPK與NPKS處理的土壤氮循環功能基因分布相似，作為一組；NPKM處理的土壤作為一組。

圖 1 氮循環功能基因的主成分分析Fig.1 PCA plot of microbial functional genes involved in nitrogen cycle

圖2顯示，施肥處理對AOA-amoA、nirS、napA3個氮循環功能基因豐度無顯著影響，但是對其余7個功能基因豐度均有不同程度的影響。與CK相比，NPK處理顯著提高了土壤AOB-amoA(21.3倍)、narG(3.3 倍)、nosZ(1.1 倍)、nifH(0.9 倍) 的基因豐度，但對gdh、nirK、norB基因的豐度沒有顯著影響；NPKS處理則提高了土壤AOB-amoA(26.1倍)、narG(4.6 倍)、nirK(2.8 倍)、nosZ(4.5 倍)和nifH(3.3倍) 基因的豐度；NPKM處理顯著提高了除AOA-amoA、nirS、napA基因外的氮循環功能基因的豐度，特別是AOB-amoA，比CK處理高33.5倍 (圖2)。

圖 2 不同施肥模式下氮循環功能基因豐度Fig.2 Abundance of functional genes involved in nitrogen cycling under different fertilization regimes

通過SIMPER計算每個功能基因對施肥土壤與對照土壤間氮循環功能微生物群落差異的相對貢獻，以明確導致施肥處理與對照處理間氮循環功能微生物差異的主要基因 (表2)。3個施肥處理中，AOB-amoA基因豐度的變化對氮循環功能基因整體豐度變異的權重最大，占28.56%～38.92%，其次為narG，貢獻率在11.50%～18.42%，而norB基因的貢獻最低，僅為0.39%～3.14%。

表 2 各功能基因對不同施肥處理與對照間整體氮循環功能基因豐度變異的貢獻 (%)Table 2 Contribution of each target gene to total variations of nitrogen cycling gene abundance between fertilization and CK using SIMPER analysis

2.2 不同施肥模式對硝化潛勢的影響

不同施肥處理間土壤硝化潛勢差異顯著 (圖3)，以NPKM處理土壤的硝化潛勢最高，為15.07 mg/(kg·d)，以CK處理的土壤硝化潛勢最低，僅為5.25 mg/(kg·d)。與 CK 處理的土壤相比，NPK、NPKM和NPKS處理的土壤硝化潛勢分別提高了149.09%、187.16%和186.10%。

圖 3 不同施肥模式下土壤的硝化潛勢 (1-辛炔抑制法)Fig.3 Nitrification potential with and without 1-octyne under different fertilization regimes

施肥模式對AOB介導的土壤硝化潛勢影響顯著(F=78.11，P＜0.05)，而對 AOA 介導的土壤硝化潛勢無顯著影響 (F=0.735，P=0.56)。CK 處理的土壤硝化潛勢為2.65 mg/(kg·d)。與CK處理的土壤相比，施用肥料顯著提高了AOB介導的土壤硝化潛勢，增幅為10.72～12.76 mg/(kg·d)。AOB 介導的硝化潛勢約占土壤總硝化潛勢的50.47%～84.92%，對土壤硝化潛勢的貢獻高于AOA。

圖4 回歸分析表明，土壤總硝化潛勢隨著土壤中AOB-amoA基因拷貝數的增加呈線性增長趨勢(R2=0.957，P＜0.001)，但是與 AOA-amoA基因拷貝數相關性不顯著。分析AOA與AOB各自介導的土壤硝化潛勢與其相應amoA基因拷貝數之間的關系發現，其各自介導的土壤硝化潛勢均隨著amoA基因拷貝數的增加呈現增長趨勢 (AOA：R2=0.406，P=0.026；AOB：R2=0.960，P＜0.001)。

圖 4 硝化潛勢與AOA-amoA及AOB-amoA基因拷貝數之間的關系Fig.4 Linear relationships between soil nitrification potential and the copy numbers of AOA-amoA or AOB-amoA gene

2.3 影響氮循環功能基因及硝化潛勢的土壤理化因素

通過前向選擇，篩選出pH、SOC和NO3?含量 3個主要理化因素。冗余分析 (RDA) 表明，理化性質解釋了氮循環功能基因豐度總變異的87.96%，其中前兩軸解釋變異的83.08% (圖5)。第一組分 (RDA1)將CK處理的土壤與其他土壤分開，并解釋了74.98%的變異。第二組分 (RDA2) 將NPKM處理的土壤與NPK、NPKS處理的土壤分開，并解釋了8.10%的變異。根據蒙特卡羅置換測驗，pH、SOC和NO3?含量顯著影響了氮循環功能基因豐度的變化。逐步多元回歸分析同樣表明，SOC含量是決定土壤中絕大多數氮循環功能基因豐度的主要因素 (表3)。此外，pH和SOC含量是影響土壤硝化潛勢的重要理化因素。

圖 5 不同施肥模式下氮循環功能基因豐度與土壤理化性質的冗余分析Fig.5 Redundancy analysis (RDA) ordination plots depicting the relationships between abundance of the functional genes involved in nitrogen cycle and selected soil properties under different fertilization regimes

表 3 與氮循環功能基因拷貝數以及總硝化潛勢顯著相關的土壤理化性質 (經逐步回歸分析篩選)Table 3 The soil properties correlated with functional gene copy numbers involved in nitrogen cycle and total nitrification potential (screened by stepwise regression analysis)

3 討論

3.1 施肥模式對氮循環功能微生物基因豐度的影響

一般而言，化肥的施用對不同氮循環相關微生物的豐度具有顯著影響，但其變化趨勢卻并不一致[6-7,26-27]。相比之下，有機類肥料 (包括畜禽有機肥、秸稈等) 的施用通常對固氮[28]、硝化[29]和反硝化[30]微生物的豐度表現出具有類群特異性的提升作用。資源有效性影響著土壤微生物的生存與發展，例如固氮微生物通常受到碳與磷供應的限制[31]，而氨氧化微生物的生長與底物銨鹽的有效性緊密相關[14]。與化肥短期而快速的養分釋放特性不同，有機類肥料能夠為土壤微生物提供充足且持續的碳源與養分，支持土壤微生物種群的整體生長，從而導致氮循環相關微生物種群也可能隨之增長[7]。在本研究中，RDA與逐步多元回歸分析均表明了SOC含量是影響氮循環功能微生物群落豐度最重要的因素。除了SOC含量，pH與NO3?含量也顯著影響著氮循環功能基因豐度。前人的研究表明，土壤pH除了影響整體微生物群落組成[32-33]，對氮循環功能基因的豐度和多樣性也具有強烈的調控作用[8,34]。與秸稈還田相比，畜禽有機肥對氮循環相關微生物的促進效果更強。導致這一現象的原因可能是畜禽有機肥與秸稈相比更能提供均衡和穩定的營養供應[35]，可以維持更多樣化的土壤微生物群落[36]。此外，畜禽有機肥與秸稈本身的性質差異，如木質素與纖維素含量、碳氮比等，會影響有機物質的礦化，也是導致土壤氮循環微生物響應不同的可能原因[35]。需要注意的是，由于功能基因豐度與氮循環生態過程的可能聯系[7]，施用肥料尤其是有機類肥料所引起的硝化、反硝化相關功能基因豐度的提高，可能會導致氮素損失、氮肥利用率下降等潛在風險的發生。與Sun等[6]的研究結果相似，在本研究中，AOB-amoA基因是施肥影響下氮循環功能微生物群落豐度變異最重要的基因。這一結果表明氨氧化細菌對施肥的敏感性高于其他氮循環相關微生物類群。其主要原因可能是所施用的肥料中，復合肥中所含的銨態氮以及尿素通過水解形成的氨會直接影響土壤氨氧化細菌的生長[6]。此外，硝化作用的代謝產物硝酸鹽是反硝化作用中硝酸鹽還原過程的底物，因此硝酸鹽還原酶編碼基因narG對氮循環群落豐度變異的貢獻也較高。

3.2 土壤氨氧化微生物與土壤硝化活性的聯系

AOA與AOB所介導的氨氧化是土壤硝化過程的初始與限速步驟，因此也被認為是影響肥料有效性的關鍵過程。在本研究中，與AOB相比，AOA具有更高的豐度 (約為AOB的1.2～25倍)，且施肥導致AOA與AOB的豐度比值顯著降低。這是由于無論是單施化肥還是增施有機類肥料，AOA-amoA基因豐度均不受影響。不同于AOA，與不施肥土壤相比，施肥導致土壤中AOB-amoA基因豐度顯著增加。這一結果與Ouyang等[14]的研究結果相似。然而，其他研究者卻發現隨著糞肥或堆肥的施用，AOA豐度增加[29,37]。這可能是由于這些研究中糞肥或堆肥施用時間長，且具有較高施用量，能夠提供大量由有機態氮礦化而成的氨/銨態氮，有利于AOA的生長[14]。此外，與AOA相比，AOB具備更大的細胞尺寸[15]，且兩者的氨氧化途徑不同，這些也可能會影響它們對銨態氮的生理響應[7]。

在所有施肥的土壤中，AOB對總硝化潛勢的貢獻約為81.90%～84.92%。即使在不施肥土壤中，AOB對總硝化潛勢的貢獻也超過50%。Ouyang等[14]通過4年的田間試驗發現，相比于AOA，AOB對農業土壤中的氮源更敏感，在土壤硝化過程中起主導作用。Xia等[38]則通過穩定性同位素探針技術發現，AOB主導了農業土壤中約76%的硝化作用。此外，本研究結果顯示，AOA對總土壤硝化潛勢仍具有15.08%至49.53%的貢獻，表明AOA同樣是土壤氨氧化過程的參與者[14,39]。雖然土壤總硝化潛勢僅與AOB-amoA基因豐度呈顯著正相關，但是AOA、AOB的功能基因豐度與AOA、AOB各自介導的硝化潛勢也呈現顯著的正相關，這再次說明在農業土壤中，AOA和AOB都是土壤硝化作用的重要貢獻者。但是，AOB對氮肥的響應比AOA更敏感。因此，在調控農田土壤硝化作用以減少氮素損失、提高氮素利用率時，應該主要集中在調節AOB豐度上，特別是在施用銨態氮肥或酰胺態氮肥的土壤中。通過物理化學手段 (如施用硝化抑制劑) 或者植物分子育種途徑 (如培育根際強硝化抑制的作物)，可能是調控農田土壤AOB微生物群落生長的有效管理措施。

4 結論

化肥與有機類肥料配合施用可不同程度地提高氮循環功能基因的豐度。土壤pH、有機碳和NO3?含量是影響氮循環微生物群落豐度的關鍵因素。AOB-amoA基因對施肥模式最為敏感，其豐度的變化影響著土壤整體氮循環群落豐度變化。AOB主導著農田土壤的硝化作用，AOB-amoA基因豐度的高低可在一定程度上反映土壤硝化作用的強弱。