酸性紅壤上玉米不同部位固氮微生物群落豐度和組成特征

王 超，陳 娟，沈仁芳*

（1 土壤與農業可持續發展國家重點實驗室/中國科學院南京土壤研究所，南京 210008；2 中國科學院大學，北京 100049；3 淺水湖泊綜合治理與資源開發教育部重點實驗室/河海大學，南京 210098）

在中國，酸性土壤 (pH＜5.5) 面積約 2.18 億 km2，占土壤總面積的22.7%，主要分布在南方熱帶和亞熱帶地區[1]。這些地區具有充足的水熱資源，較高的生產潛力，但是較高的土壤酸度嚴重限制了作物的生產。尤其是近幾十年來，不合理的土壤利用在不斷加速土壤酸化，對該地區生態環境構成了嚴重威脅[2-3]。其中，大量化學氮肥的投入是土壤加速酸化的主要誘因，并引起面源污染和溫室氣體排放增加等一系列負面影響[2,4]。因此，當務之急是在穩產、增產的同時減少化學氮肥的投入。生物固氮是固氮微生物將大氣中不能被植物直接利用的氮氣還原成氨的過程，是經濟、無污染和生態友好的氮素供應方式[5-6]。生物固氮的挖掘和利用，在提高作物產量、降低化肥使用量、減少環境氮污染以及緩解土壤酸化等方面具有重要意義。

固氮微生物具有豐富的生物多樣性，按照固氮條件和生活習性，可分為共生固氮、聯合固氮和自生固氮[7]。除對豆科植物根瘤共生固氮微生物的研究外，近年來，非豆科植物的非共生固氮受到廣泛關注，涉及聯合固氮和自生固氮[7-9]。相對于共生固氮而言，非共生固氮速率雖然較低，但對非豆科作物的氮素來源具有重要貢獻[7,10]。非共生固氮微生物在時空分布上更為廣泛，在植物根際、根部、葉面甚至組織內部經常被發現[9]。目前，在水稻、玉米和小麥等作物中均發現了大量非共生固氮菌，暗示了禾本科作物具有生物固氮的潛力[11-13]。生物固氮效率的高低與固氮微生物數量和種群結構的變化密切相關[14-15]。對于固氮微生物種類的認識，以前的大多研究僅局限于純培養技術，大大限制了對固氮菌的了解。隨著高通量測序的發展，利用分子生態學方法發現了大量不可培養的固氮微生物[16]，其中nifH基因已經被廣泛應用于對固氮微生物的多樣性和群落結構的研究中，進而反映生態環境中固氮功能的變化和潛能[17-18]。

在酸性土壤中，鋁毒是限制作物生長的主要因素之一，植物基因型表現不同的耐鋁能力去適應酸性土壤環境[19-20]。而這些植物基因型可直接影響或通過改變土壤環境間接影響土壤微生物的群落結構、多樣性和豐度[18,21]。我們前期研究中發現，酸性土壤上不同耐鋁能力的玉米品種形成了差異明顯的根際固氮微生物群落組成，說明植物基因型控制著根際固氮微生物群落[18]。這可能由于非共生固氮菌與植物構成的體系容易受到植物因素的影響[7]。目前，對不同耐鋁植物品種根部和葉際固氮微生物的物種組成和群落結構還缺乏認識。因此，本研究采用熒光定量PCR和高通量測序相結合的方法，以固氮微生物nifH基因為分子標記，對耐鋁玉米品種先玉335和鋁敏感玉米品種Mo17的不同部位 (葉部、根部和根際土壤) 中的固氮微生物群落豐度、多樣性和結構組成進行研究，目的在于探討固氮微生物群落在不同玉米品種和不同部位的存在特征，為探明酸性土壤植物氮素養分途徑提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料和盆栽試驗

供試土壤取自中國科學院江西鷹潭農田生態系統國家野外科學觀測研究站的松樹林。土壤母質為第四紀紅粘土，土壤基本理化性質為pH 4.62、有機質 7.20 g/kg、全氮 0.40 g/kg、全磷 0.38 g/kg、全鉀10.53 g/kg、可交換性鋁 0.25 g/kg。玉米品種選用本課題組前期研究中的雜交系先玉335 (耐鋁)和自交系 Mo17 (鋁敏感)[18]。

盆栽試驗于2019年4—5月在中國科學院南京土壤研究所遮陰網室中進行，培養條件為自然光照。每盆各裝2.0 kg土壤，并施用磷酸二氫鉀0.20 g/kg和硫酸銨0.50 g/kg作為基肥。在玉米播種前，先將基肥和土壤充分混勻，澆滅菌的純凈水，平衡一周。每個玉米品種分別種植4盆，每盆播種10粒玉米種子，在地上部長到1 cm高時間苗，每盆留3棵幼苗。自間苗之日起，進行為期4周的培養。期間土壤含水量保持在20% (w/w)。

培養結束后，分別收集玉米根系和地上部，采用抖根法收集根際土壤，每盆玉米根際土壤收集并混勻為一個土壤樣品，相應的根系和地上部也分別混合為一個樣品。取一部分根部和葉部樣品保存于–80℃冰箱，用于土壤DNA的提取。土壤樣品過2 mm篩后分為3份，一份保存于–80℃冰箱用于土壤DNA的提取；一份4℃保存，用于銨態氮和硝態氮測定；余下部分自然風干、過篩和研磨用于土壤理化指標測定。

1.2 玉米植株氮磷含量和土壤理化指標測定

收集的根系和地上部樣品，用蒸餾水沖洗后于105℃殺青，隨后70℃烘干至恒重，稱重。樣品粉碎，經H2SO4–H2O2消煮后用凱氏定氮儀測定氮含量；經HNO3消煮后，采用鉬銻抗比色法測定磷素含量。

土壤理化性質測定參照《土壤農業化學分析方法》[22]進行。土壤pH采用pH計測定，全氮測定采用凱氏定氮法，有效磷測定采用碳酸氫鈉浸提—鉬銻抗比色法，速效鉀測定用乙酸銨浸提—火焰光度法，有機質測定用重鉻酸鉀容量法—外加熱法，銨態氮和硝態氮采用流動分析儀測定。

1.3 土壤和植株 DNA 提取

采用 DNA 試劑盒 (FastDNA SPIN Kit for soil) 提取土壤DNA，然后用DNA純化試劑盒 (PowerClean?DNA Clean-up Kit) 對 DNA 進行純化。

將新鮮玉米根部和葉部分別用無菌剪刀剪成2 cm 的小段，70% 酒精浸泡 30～60 s，10% NaCl處理10 min進行表面滅菌，然后無菌水沖洗4次，每次10 min，最后一次洗滌的無菌水涂布在LB平板上作為對照，確定是否消毒徹底。將消毒的根和葉片采用 DNA 試劑盒 (Fast DNA SPIN Kit for soil) 提取植株DNA。

1.4 nifH基因豐度測定

固氮菌nifH基因的擴增引物序列為PolyF：5′–TGCGAYCCSAARGCBGACTC–3′和PolyR：5′–ATSGCCATCATYTCRCCGGA–3′[23]。利用熒光定量PCR技術檢測nifH基因拷貝數，反應在熒光定量PCR 儀 LightCycler 480 系統 (Roche Diagnostics，Mannheim，Germany) 上進行。反應體系為：2 ×SYBR real-time PCR premixture (Bioteke，大連)10 μL，上下游引物 (10 μmol/L) 各 0.8 μL，DNA 模板 2.0 μL(1～10 ng)，最后用滅菌的超純水補至20 μL。熒光定量 PCR 反應條件為：94℃ 5 min；94℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃ 30 s，42 個循環。按照我們以前的方法[18,24]，獲得含有nifH基因的重組質粒，分別以10倍梯度稀釋基因重組質粒得到標準曲線。并根據標準曲線計算基因豐度。

1.5 高通量測序和數據處理

采用引物PolyF/PolyR擴增固氮菌nifH基因。擴增時在每個樣品的上游引物5'端添加一段長度為7個堿基的特異性多肽用于區分樣品。PCR體系(25 μL)：5 × ExTaq 緩沖液 5.0 μL，dNTP (2.5 μmol/L) 2.0 μL，上下游引物 (10 μmol/L) 各 1.0 μL，DNA 模板 2.0 μL (1～10 ng)，最后用滅菌的超純水補至25 μL。PCR 反應條件為：94℃ 5 min；94℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃ 30 s，30 個循環；72℃ 7 min。擴增結果進行1%瓊脂糖凝膠電泳，切取目的片段用凝膠回收試劑盒回收。PCR產物送至上海派森諾測序公司，運用IlluminaMiSeq測序平臺進行測序。

利用FLASH軟件對雙端序列進行連接后，通過QIIME軟件調用USEARCH檢查并剔除嵌合體序列。質量和拼接的效果進行質控過濾，根據序列特異性多肽和引物序列區分樣品得到有效序列。再將序列翻譯成為氨基酸序列，含有終止子或與nifH蛋白不匹配的序列刪掉。最后，優質序列聚類成操作分類單元 (operational taxonomic unit，OTU)，閾值設置為90%[17-18]，并選取每個OTU中豐度最高的序列作為代表序列。這些序列與NCBI GenBank中已知nifH序列相比對，以此對OTU進行分類注釋[17-18]。將每個樣品的OTU序列稀釋到相同水平 (26900個有效序列)，用于α和β多樣性分析。使用QIIME軟件中alpha_diversity.py指令計算出每個樣品的Shannon指數。

1.6 數據分析

不同玉米品種間的干重、氮磷含量和土壤根際理化性質差異采用SPSS 22.0軟件的單因素方差分析(One-way ANOVA) 進行檢驗，并通過 Duncan 檢驗進行多重比較。玉米品種和取樣部位對固氮微生物群落豐度、多樣性指數和優勢菌屬相對豐度的影響采用雙因素方差分析進行檢驗，如果影響達到顯著水平，再用單因素方差分析或T-test進行差異比較。通過非度量多維尺度 (NMDS)，(vegan程序包，R語言) 分析固氮微生物群落結構的相似程度，并對不同品種和不同取樣部位間的群落相似性差異進行多因素方差 (PERMANOVA) 分析 (vegan 程序包，R 語言)。

2 結果與分析

2.1 玉米生物量、氮磷含量及根際土壤理化性質

在酸性紅壤上生長1個月的玉米，耐鋁品種先玉 335 地上部和根部生物量顯著 (P＜0.05) 高于鋁敏感品種Mo17 (表1)，表明耐鋁品種更適應酸性土壤。然而，鋁敏感品種Mo17地上和根部氮、磷含量顯著 (P＜0.05) 高于先玉 335 (表 1)，這可能由于耐鋁品種吸收的養分分布到更大的生物量中，從而對養分元素產生了稀釋作用。

表 1 玉米地上部和地下部生物量和氮磷含量Table 1 Biomass, N and P concentrations in maize shoot and root

玉米收獲后，先玉335根際土壤比Mo17根際土壤具有更低的土壤pH、銨態氮和速效鉀含量 (P＜0.05)，然而兩者間的硝態氮、有效磷、全氮和有機質含量沒有顯著差異 (表2)。耐鋁品種更高的生物量需要從根際土壤中吸收更多養分，而根系吸收更多銨態氮伴隨質子釋放，加速根際土壤酸化。

表 2 玉米根際土壤理化性質Table 2 Soil physicochemical characteristics in the rhizosphere soil of maize

2.2 固氮微生物 nifH基因豐度

植株和根際土壤樣品nifH基因豐度范圍為1 g 干土或植株 0.32 × 105～8.92 × 105copies。雙因素方差分析顯示，取樣部位 (根際土壤、根部和葉部)和玉米品種 (先玉 335和Mo17) 都顯著 (P＜0.05) 影響固氮微生物nifH基因豐度 (圖1)，但是取樣部位的影響程度 (F=285.072，P=0.000) 要高于品種 (F=14.371，P=0.001)。對于每個品種的不同取樣部位，根部nifH基因豐度顯著 (P＜0.05) 高于根際土壤和葉部的豐度，而根際土壤 (0.62 × 105copies/g 土和0.64 × 105copies/g 土)和葉部 (0.59 × 105copies/g 植株和0.50 × 105copies/g 植株) 之間沒有顯著差異。對于不同玉米品種，先玉335根部nifH基因豐度 (7.61 ×105copies/g 植株) 顯著 (P＜0.05) 高于 Mo17 根部(5.12 × 105copies/g 植株)，然而根際土壤和根葉部nifH基因豐度在兩個品種間沒有顯著差異。這些結果說明，酸性紅壤上固氮微生物群落豐度在玉米不同部位間的差異程度大于品種間的差異程度。

圖 1 玉米根際、根系和葉片nifH基因豐度Fig.1 The nifH gene abundance in the rhizosphere, root and leaf of maize

2.3 固氮微生物測序結果和α 多樣性

利用IlluminaMiSeq平臺對固氮微生物nifH基因進行測序，經質控和蛋白翻譯檢測后，將每個樣品的有效序列稀釋到相同測序深度 (26900個有效序列)，以用于α和β多樣性分析。把相似度水平 ≥ 90%的序列聚為一個操作分類單元 (OTU)，根際土壤、根部和葉部中獲得的OTU數量分別為258～291、166～200和103～126。α多樣性主要分析了Shannon指數和OTU數量 (圖2)。雙因素方差分析可見，取樣部位顯著影響 Shannon 指數 (F=167.728，P=0.000)和OTU 數量 (F=306.460，P=0.000)，而品種并未表現顯著影響。在不同的取樣部位，Shannon指數和OTU數量的變化趨勢一致為根際土壤＞根部＞葉部。這些結果說明，固氮微生物群落多樣性在玉米不同部位間的差異程度大于品種間的差異程度。

圖 2 玉米根際、根系和葉片固氮菌群落多樣性指數Fig.2 Diazotrophic community diversity index in the rhizosphere, root and leaf of maize

2.4 固氮微生物優勢菌屬

通過對樣品獲得的OTUs進行歸類，得到2個門，4個綱，11個目，21個科和39個屬。在門水平上，分別為變形菌門 (Proteobacteria)和藍藻門(Cyanobacteria)，在根際土壤和根部樣品中變形菌門占65.96%～98.27%，葉部樣品中藍藻門占40.86%～64.43%。在屬水平上 (圖 3)，優勢屬 (相對豐度＞1%) 主要包括慢生根瘤菌屬 (Bradyrhi zobium)、細鞘絲藻屬 (Leptolyngbya)、伯克氏菌屬(Burkholderia)、鞘脂單胞菌屬 (Sphingomonas)、寡養單胞菌屬 (Stenotrophomonas)、動膠菌屬 (Zoogloea)、艾德昂菌屬 (Ideonella)、固氮根瘤菌屬 (Azorhizobium)、甲基細胞菌屬 (Methylocella)、固氮弧菌屬(Azohydromonas)、紅游動菌屬 (Rhodoplanes)、厭氧粘細菌屬 (Anaeromyxobacter)和磁螺菌屬(Magnetospirillum)。其中Bradyrhizobium在根際土壤和根部樣品中為最多的優勢屬，相對豐度占17.92%～65.86%，而Leptolyngbya在葉片樣品中為優勢屬，相對豐度為40.64%～64.37% (圖3)。雙因素方差分析顯示 (表 3)，取樣部位顯著 (P＜0.05) 影響Bradyrhizobium、Leptolyngbya、Burkholderia、Sphingomonas、Stenotrophomonas、Zoogloea、Ideonella、Azospirillum和Rhodoplanes的相對豐度，而玉米品種僅僅顯著影響Leptolyngbya的相對豐度。其中，相比于根際土壤和根部樣品，葉部含有更高的Leptolyngbya相對豐度 (59.96%和44.70%)和更低的Bradyrhizobium相對豐度 (7.16%和5.70%)。

表 3 玉米根際、根和葉片中優勢固氮菌屬 (＞1%) 的相對豐度比較 (%)Table 3 Comparison of the relative abundances of dominant diazotrophic genera (＞1%) in rhizosphere,root and leaf of maize

圖 3 玉米根際、根系和葉片優勢固氮菌屬種類 (＞1%)和固氮菌群落結構的 NMDS 分析Fig.3 The relative abundance of the dominant diazotrophic genera (＞1%) in the rhizosphere, root and leaf of maize and the non-metric multidimensional scaling analysis (NMDS) of diazotrophic community composition

2.5 固氮微生物群落結構

采用NMDS可視化了固氮微生物的群落結構(圖3)，結果顯示兩個玉米品種相同取樣部位樣品的聚集更加緊湊，相比葉部，根際土壤和根部樣品距離更近。PERMANOVA分析進一步證實了取樣部位(R2=0.461，P=0.001) 對固氮微生物群落組成的影響程度大于玉米品種 (R2=0.077，P=0.006)，盡管兩者都產生了顯著影響 (表4)。在不同取樣部位中，固氮微生物群落組成在根際土壤、根部和葉部之間的差異都達到顯著水平 (P＜0.05)，而根際土壤與葉部 (R2=0.523)、根部與葉部之間的差異 (R2=0.460)程度明顯高于根際土壤與根部之間的差異 (R2=0.188)。對于不同玉米品種，根際土壤樣品間存在顯著差異 (P＜0.05)，而根部和葉部樣品在兩個品種間的差異未達到顯著水平。這些結果可見，酸性紅壤上玉米不同部位對固氮微生物群落組成的影響程度大于品種的影響。

3 討論

在貧瘠的酸性土壤上，除了嚴重的毒害因子 (例如鋁毒、錳毒)，養分缺乏也是限制作物生長的重要因素[3-4,19]。因此，充分發揮固氮微生物功能對保障酸性土壤植物氮素供應，以及降低化學氮肥的投入具有重要貢獻。其中固氮微生物群落結構組成和豐度對生物固氮潛能及維持氮素循環平衡起到關鍵作用[14-15]。已有研究認為植物與固氮微生物的互作關系受植物基因型的控制[18]。而本研究發現，相對于玉米品種，玉米不同部位間的固氮微生物豐度、多樣性和群落組成的差異更為明顯 (圖1、圖2和表4)，說明玉米不同部位為固氮微生物的定殖和生長提供了不同的環境場所。這些場所不僅為固氮微生物提供賴以生存的營養物質和能量來源，而且也存在一些障礙因子，已形成了獨特的固氮微生物生態位。類似的，Prakamhang等[25]研究發現，水稻不同組織對固氮微生物的影響要遠遠大于土壤類型和施肥。Rodríguez-Blanco等[26]研究也發現，固氮微生物物種對植物不同組織表現出很強的偏好性。

表 4 玉米不同取樣部位固氮微生物群落組成的PERMANOVA分析Table 4 PERMANOVA analysis (global test and pairwise comparison) of diazotrophic community composition in different sampling positions and cultivars of maize

盡管植物根部定殖的微生物物種主要來源于周圍根際土壤，但是在多數研究中根際土壤和根部表現出明顯不同的微生物群落組成[24]。在本研究中，相比于根際土壤，根部固氮微生物豐度更高 (圖1)，說明根部環境有利于固氮微生物的生長，但是多樣性指數更低 (圖2)，而且兩者之間的固氮微生物群落組成也明顯不同 (表4)。這與我們以前的研究結果相似[24]。作為微生物的棲息地，根部通過細胞壁、組織結構以及防御系統，特異地從周圍土壤中選擇微生物物種在根部組織中定殖[27]。一旦在根部定殖，固氮微生物物種將降低土壤氮素的抑制作用以及與土著微生物的競爭關系。此外，植物根部分泌碳源和抑菌物質在促進一些微生物物種生長的同時也抑制了其他物種的生長[25]。植物根部分泌的糖、有機酸、氨基酸形成的梯度和低氧濃度能吸引特定固氮菌，降低其對營養物質的競爭，促進植物與菌體之間的物質交換[28]。因此，這些進入植物根部的固氮微生物物種，具有較高的特異性，占據著根部組織內有利于營養供應和微環境適宜的生態位，不僅提高自身生長，而且能夠有效地拮抗病原微生物的生長，較根外環境更有利于形成高效固氮體系。

研究發現，相對于根際土壤和根部，葉部固氮微生物群落組成的差異更大，多樣性更低 (圖2和表4)。與根際環境相比，葉際生態系統相對簡單，環境比較苛刻，營養物質更為貧乏[29-30]。盡管葉際微生物與其生存環境形成了一個復雜的生態系統，但是由于直接暴露在空氣中，紫外線照射和存在活性氧，以及晝夜溫差和濕度波動等不利因素都會直接或間接的影響葉際固氮微生物的生存，使其與周圍土壤中的微生物群落組成明顯不同[29,31]。因此，葉際固氮微生物物種的適應性是環境和植物分泌物性質的特殊選擇，導致為固氮微生物提供了更少的生態位。然而，這些葉際固氮微生物對植物氮素供應仍然起著重要作用。

前期研究發現，玉米耐鋁性影響了根際土壤固氮微生物的群落組成[18]。本研究也發現了類似現象，但是在葉部和根部中玉米品種間的固氮微生物群落組成沒有顯著差異 (表4)，說明玉米耐鋁性對固氮微生物群落組成的影響表現出部位間的差別。有機酸分泌被認為是植物耐鋁毒的一個重要機制，在酸性土壤中耐鋁植物往往比鋁敏感植物分泌更多的有機酸[19-20]。這些有機酸分泌上的差別可能影響根際土壤固氮微生物群落結構[32-33]。此外，由于較高的生物量，耐鋁植物吸收更多的根際養分，從而形成與鋁敏感植物不同的根際環境。在本研究中，耐鋁玉米先玉335根際土壤表現出更低的土壤pH、銨態氮和速效鉀含量 (表2)。這些土壤理化因子被報道是影響固氮微生物群落組成的重要因素[34-35]。而且，在酸性土壤中耐鋁植物生長越旺盛，根系分泌物越多，越有利于根際固氮微生物物種的特異性生長。這些因素可能引起根際固氮微生物群落組成的變化。然而，由于根部和葉際環境對微生物的選擇性定殖作用，形成特異的固氮微生物群落結構，進而可能降低了植物耐鋁性在這些部位引起的群落結構差異。

不同玉米部位由不同的優勢固氮菌組成，這些物種相對豐度的差異直接貢獻于群落結構的變化 (表3)。本研究與R?sch等[36]報道的結果一致，變形菌門固氮菌在酸性土壤中占優勢。本研究中，根際土壤和根部的優勢菌屬是慢生根瘤菌屬 (Bradyrhizobium)，而葉部中的優勢菌屬是細鞘絲藻屬 (Leptolyngbya)，說明不同部位優勢物種的差異較大。慢生根瘤菌屬在酸性土壤中有很高的存活能力[33,37]，因為該菌屬能更好的忍耐和適應酸性條件[38]。此外，慢生根瘤菌屬不僅是共生固氮菌，也是一種非共生固氮菌[35]，而且在一些研究中也發現行使植物促生功能[39]。細鞘絲藻屬屬于藍藻門，該門類的微生物一般是水生環境中的優勢固氮菌群，但在一些葉際固氮菌中也常被發現[31]。藍藻門在江西紅壤中普遍存在[40]，這與我們的研究結果一致。

4 結論

酸性紅壤上，固氮微生物豐度、多樣性和群落組成在玉米不同部位間的差異大于品種間的差異。玉米根部表現出更高的固氮微生物豐度，而固氮菌多樣性指數在根際土壤中最高。葉部與根部和根際土壤的固氮菌群落組成差異更大，而且有最低的固氮菌豐度和多樣性指數。不同玉米部位固氮菌群落組成差異主要體現在富集的優勢菌屬明顯不同。