牛肝菌液態(tài)發(fā)酵及活性成分誘導(dǎo)培養(yǎng)研究進展

郭 磊，范方宇，劉 云，闞 歡

（西南林業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，云南昆明 650224）

牛肝菌科（Boletaceae）真菌屬真菌界（Fungi）、擔(dān)子菌亞門（Basidiomycotina）、層菌綱（Hymenomycetes）、傘菌目（Agaricates），它既是高營養(yǎng)價值的真菌，也具有多種生理功效[1]。牛肝菌在全世界范圍內(nèi)都有分布，在歐洲的瑞典、法國，美洲的美國，亞洲的馬來西亞、日本等國都有大量文獻記錄，中國已知牛肝菌有28 個屬387 個種（變種），主要分布在云、貴、川、粵等地區(qū)[2-3]。牛肝菌屬外生菌根真菌，對寄主有一定的選擇性，很難實現(xiàn)人工栽培[4]，故液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)將是以后牛肝菌研究的重要方向。

菌絲是牛肝菌液態(tài)發(fā)酵過程的重要產(chǎn)物，受各種發(fā)酵因素如培養(yǎng)基組成與比例、初始pH、發(fā)酵溫度及發(fā)酵時間等的相互影響，牛肝菌菌絲發(fā)酵體系的流變特性也隨之改變，進而影響到質(zhì)量、熱量和動量的傳遞[5]，最終會影響到菌絲和發(fā)酵液中營養(yǎng)成分的生成和效率。同時，真菌液態(tài)發(fā)酵會產(chǎn)生多糖、色素、三萜類化合物及黃酮類化合物等次生代謝產(chǎn)物，具有抑菌、抗氧化、抗腫瘤、促進植物生長等作用[6]。有些次生代謝產(chǎn)物結(jié)構(gòu)新穎，生物活性獨特，是活性化合物研究的重要來源，且在抗腫瘤治療上具有不可替代的作用，近年來所發(fā)現(xiàn)的新結(jié)構(gòu)、新活性次生代謝產(chǎn)物超過50%來源于真菌[7]。另外，通過物理、化學(xué)及生物外源誘導(dǎo)手段可以提高牛肝菌液態(tài)發(fā)酵過程中目標(biāo)生物活性成分的含量,生產(chǎn)過程具有可再生性，且不受自然環(huán)境或資源限制，已成為牛肝菌資源高效利用的創(chuàng)新研究方向。

1 牛肝菌科真菌菌絲的液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基研究

真菌培養(yǎng)基是供真菌菌絲生長繁殖或積累代謝產(chǎn)物的營養(yǎng)基質(zhì)，根據(jù)菌絲對營養(yǎng)物質(zhì)的需求來配制，培養(yǎng)基一般有碳源、氮源、無機鹽、生長素及水分等物質(zhì)。不同培養(yǎng)基的成分是不同的，其中任何一種成分或含量的改變都會影響到菌絲的生長繁殖，各種培養(yǎng)基的成分與比例對菌絲的生長都會有較大影響。在真菌液態(tài)發(fā)酵過程中，除發(fā)酵培養(yǎng)基配方的影響外，初始pH、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時間及轉(zhuǎn)速等也是影響真菌菌絲生長繁殖和代謝的重要指標(biāo)。不同牛肝菌科真菌的液態(tài)發(fā)酵條件及菌絲生長情況見表1。

表1 不同牛肝菌液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)條件及菌絲生長情況Table 1 Liquid fermentation conditions and hyphae growth state of different Boletaceae fungi

通過優(yōu)化培養(yǎng)基組成及發(fā)酵條件，牛肝菌菌絲體在營養(yǎng)素含量上遠高于子實體，有著更高的營養(yǎng)價值保健功能，具有非常大的發(fā)展?jié)摿?。美味牛肝菌號稱“牛肝菌之王”，是世界著名的食藥用真菌[19]，冮潔等[20]使用馬鈴薯200 g/L、葡萄糖25 g/L、蛋白胨7 g/L、K2HPO41.5 g/L、CaCl20.005 g/L 在初始pH5.0 時制備美味牛肝菌液態(tài)培養(yǎng)基，研究發(fā)現(xiàn)菌絲體蛋白質(zhì)含量（28.40%）高于子實體（25.10%），菌絲體氨基酸總量（22.56%）也高于子實體（17.93%）。通過優(yōu)化牛肝菌液態(tài)發(fā)酵的各種條件，能夠在短時間內(nèi)產(chǎn)生大量的菌絲體，克服了人工栽培難度大和對給生態(tài)環(huán)境帶來的破壞，同時也能夠獲得和子實體相似的營養(yǎng)成分和代謝產(chǎn)物，具有廣闊的市場發(fā)展前景。

2 牛肝菌中生物活性成分的液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)

牛肝菌含有多糖、萜類、甾體、色素及生物堿等多種成分，具有抗氧化、抗腫瘤和抗菌等多種生物活性，是安全、有效、低毒的天然藥物分子來源，在疾病治療上有著較大的發(fā)展?jié)摿2]。目前，牛肝菌生物活性成分的獲取多來自于子實體，受自然資源條件的限制，原料來源有限且產(chǎn)量少，而液態(tài)發(fā)酵可以大量生產(chǎn)目標(biāo)代謝活性成分，具有可再生性，有重要的科學(xué)研究意義。

2.1 胞外多糖

真菌胞外多糖（exopolysaccharides，EPS）具有高黏性、抗氧化、抗病毒和抗腫瘤等多種生物學(xué)活性[21]。但目前對牛肝菌發(fā)酵產(chǎn)EPS 的研究較少（見表2），如何獲得并通過真菌誘導(dǎo)提高牛肝菌EPS 產(chǎn)量已經(jīng)是科研人員新的研究方向。

表2 牛肝菌EPS 發(fā)酵培養(yǎng)條件Table 2 Fermentation conditions of EPS from Boletaceae fungi

楊玉紅等[23]對美味牛肝菌EPS 發(fā)酵因素研究后發(fā)現(xiàn)，影響EPS 產(chǎn)量較大的三個因素分別是葡萄糖、硫酸錳和磷酸二氫鉀。在EPS 生產(chǎn)過程中，除通過控制發(fā)酵培養(yǎng)條件外，提取及純化技術(shù)同樣是提高EPS 產(chǎn)量及質(zhì)量的關(guān)鍵因素。矯麗曼[27-28]研究了美味牛肝菌EPS 的提取純化工藝及單糖組成，結(jié)果表明超聲波協(xié)同酶法提取EPS 優(yōu)于熱水法、超聲波法、酶法及超聲波協(xié)同酶法對美味牛肝菌菌絲多糖的提取效率，EPS 提取率達到8.315%。采用DEAE 纖維素柱和G-100 葡聚糖凝膠柱對其純化后發(fā)現(xiàn)EPS 是由D-木糖、D-甘露糖和D-半乳糖組成,摩爾比為3.1:63.3:1.0。闞國仕等[29]通過抗氧化活性研究發(fā)現(xiàn)美味牛肝菌EPS 對超氧陰離子自由基和羥基自由基有顯著的清除能力,還能夠抑制小鼠肝組織中丙二醛的生成、肝組織自發(fā)性脂質(zhì)過氧化及減少紅細胞氧化溶血。許春平等[25]分析了脫蛋白后銅色牛肝菌EPS 的體外抗氧化活性，研究得出EPS 對ABTS 自由基、DPPH 自由基及超氧陰離子自由基具有很好的清除能力。

真菌EPS 生產(chǎn)周期短，不受季節(jié)、地域和病蟲害等限制，已作為增稠劑、乳化劑及穩(wěn)定劑在食品工業(yè)中得到廣泛應(yīng)用，并作為血漿替代品、抗腫瘤、降血糖及降血脂藥物在醫(yī)藥行業(yè)中有著非常廣泛的應(yīng)用[30]。

2.2 色素

真菌色素是真菌發(fā)酵產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物，其生產(chǎn)安全性高且易于大規(guī)模生產(chǎn)，具有廣闊的市場的發(fā)展前景[31-32]。在過去的二十年里，關(guān)于陸地和海洋生態(tài)系統(tǒng)中微生物色素有了深入的研究，包括微生物色素和癌癥相關(guān)性的研究[33]。到目前為止，微生物，包括細菌、真菌和藻類，都已經(jīng)被證明是天然色素的良好替代來源。方瓊等[34]通過Plackett-Burman 試驗篩選出影響遠東疣柄牛肝菌（Leccinum extremiorientale（L.Vass.）Sing.）發(fā)酵產(chǎn)色素的影響因素主要是裝液量和培養(yǎng)時間，并通過響應(yīng)面設(shè)計優(yōu)化出色素的最佳發(fā)酵條件是麥芽糖20 g/L、玉米漿干粉5 g/L、KH2PO43 g/L、MgSO4·7H2O 1.5 g/L、VB10.01 g/L、培養(yǎng)溫度27 ℃、培養(yǎng)時間141.85 h、裝液量87.70 mL，此條件下發(fā)酵液的吸光度為0.532，比優(yōu)化前提高了11.37 倍。

真菌的次生代謝物色素是食品天然色素和食品添加劑的良好來源，包括紅曲黃素（ankaflavin）、β-胡蘿卜素（β-carotene）、角黃素（canthaxanthin）、核黃素（riboflavin）、番茄紅素（lycopene）、紅斑素（rubropunctatin）及黑色素（melanin）等，具有抗氧化、抑菌、抗癌及抗細胞毒性等多種生理功能[35-36]。目前，雖然對牛肝菌科真菌發(fā)酵產(chǎn)色素的研究相對較少，但由于其安全性高、生產(chǎn)周期短且具有較高的營養(yǎng)價值和藥理活性，必將成為牛肝菌科真菌中天然色素生產(chǎn)的新途徑。

2.3 其他

三萜類化合物（triterpenoids）是真菌中除了多糖外最重要的生物活性成分，是由數(shù)個異戊二烯去掉羥基后首尾相連構(gòu)成的萜類化合物，具有預(yù)防心腦血管疾病、增強免疫力及抗腫瘤等多種生理功能[37-38]。近年來已對靈芝（Ganoderma lucidum(Leyss.ex Fr.)Karst.）[39]、粗毛纖孔菌（Inonotus hispidus(Bull.)Pat.）[40]及樺褐孔菌（Fascoporia oblique（Pers.Fr.））[41]等藥用真菌液態(tài)發(fā)酵菌絲的三萜類化合物進行了提取和生物活性研究。但截止到目前，對牛肝菌子實體及發(fā)酵菌絲中的三萜類化合物都沒有相關(guān)報道，因此對于牛肝菌三萜類化合物的發(fā)酵培養(yǎng)、誘導(dǎo)合成及生物活性研究是牛肝菌活性成分研究和資源開發(fā)利用的重要方向。

殼聚糖（chitosan）是唯一的天然堿性陽離子多糖，因其獨特而優(yōu)越的成膜性、抗菌性、生物相容性及安全性等而受到國內(nèi)外學(xué)者的廣泛關(guān)注，已應(yīng)用到食品、藥品和化妝品等多個行業(yè)[42-43]。李昊[44]篩選出葡萄糖和酵母浸出粉是影響美味牛肝菌發(fā)酵產(chǎn)殼聚糖的主要因素，通過響應(yīng)面優(yōu)化出最佳的發(fā)酵條件是葡萄糖30.53 g/L、酵母浸出粉7.02 g/L、溫度28 ℃，裝液量77.42 mL，初始pH 5.64，發(fā)酵6 d，此條件下殼聚糖產(chǎn)量可達3.81 g/L，占菌絲體干重的15.43%，且具有較高的脫乙酰度和純度，對大腸桿菌也具有較好的抑制活性。

L-茶氨酸（L-theanine）是茶葉中特有的非蛋白氨基酸，也是茶葉的重要活性成分，因其具有抗氧化、改善情緒與認知及減輕焦慮等生理作用，于2014 年被我國批準(zhǔn)其為新食品原料[45-46]。L-茶氨酸也存在于牛肝菌科真菌中，李健[47]通過毛細管電泳分析出褐絨蓋牛肝菌（Xerocomus badius（Fr.）Kiihner ex Gilb.）、粘蓋牛肝菌、黃柄牛肝菌和茶褐牛肝菌（Boletus brunneissimusChiu）的L-茶氨酸含量分別是29.86、27.35、25.61 和15.60 mg/100 g,并研究獲得了褐絨蓋牛肝菌液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)L-茶氨酸的最佳條件是29.17 g/L 葡萄糖、6.38 g/L 酵母膏，裝液量61.43 mL和初始pH5.63，L-茶氨酸產(chǎn)量達到17.22 mg/mL。粘蓋牛肝菌產(chǎn)L-茶氨酸的液態(tài)發(fā)酵組合是30.12 g/L葡萄糖、6.77 g/L 酵母膏，裝液量60.10 mL 和初始pH5.58，在此條件下L-茶氨酸的產(chǎn)量達到15.15 mg/L，研究結(jié)果為牛肝菌液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)L-茶氨酸提供了一條新路徑。

利用液態(tài)發(fā)酵技術(shù)生產(chǎn)牛肝菌代謝物質(zhì)已經(jīng)是獲取生物活性成分的有效途徑，通過改變培養(yǎng)基組成和發(fā)酵條件來獲取不同的牛肝菌代謝物，進一步分析代謝物質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能，為保健食品和藥品的研發(fā)提供了新的依據(jù)，也牛肝菌資源的開發(fā)與利用指出了新的研究方向。

3 牛肝菌液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物的誘導(dǎo)培養(yǎng)

在真菌液態(tài)發(fā)酵的過程中，胞外多糖、三萜類化合物、酚類化合物及生物堿等多種具有生物活性的代謝產(chǎn)物也隨之產(chǎn)生，這些代謝產(chǎn)物生物活性強，毒副作用低，成為安全、有效、低毒且來源豐富的天然活性物質(zhì)來源。近年來，為了促進真菌液態(tài)發(fā)酵過程中生物活性代謝成分的生成，常通過紫外光照射、添加茉莉酸甲酯、水楊酸、金屬離子及真菌誘導(dǎo)子等物理、化學(xué)和生物外源誘導(dǎo)技術(shù)手段進行調(diào)控，進而誘導(dǎo)真菌液態(tài)發(fā)酵過程中代謝產(chǎn)物的生成，己成為真菌活性成分及其藥物研究領(lǐng)域的新熱點。

3.1 物理誘導(dǎo)培養(yǎng)

光照、紫外光照射、溫度變化、機械損傷、超聲、X 射線及電磁處理等是影響真菌液態(tài)發(fā)酵的物理誘導(dǎo)方式，其中紫外光照射會對真菌次生代謝產(chǎn)生重要影響，尤其會顯著提高黃酮類化合物的產(chǎn)量[48-49]。紫外輻射作為一種危害性脅迫，可以激發(fā)植物體產(chǎn)生一系列的防御性反應(yīng)，這些反應(yīng)增加了大量黃酮類化合物及其它能夠吸收紫外光的化合物，能夠抵御照射到植物的大部分紫外光，減輕了植物被紫外光傷害的程度，同時也促進了大量類胡蘿卜素的產(chǎn)生，保護了植物的光合體系[50-51]。

陽飛[52]首次采用原生質(zhì)體紫外線-氯化鋰（UVLiCl）復(fù)合誘變的方法選育出美味牛肝菌EPS 高產(chǎn)菌株，并對誘變株（UL-7）發(fā)酵工藝進行了研究，在相同液體培養(yǎng)基下EPS 產(chǎn)量可達到4.361 g/L，高出未經(jīng)誘導(dǎo)的EPS 產(chǎn)量的37.8%。隨著次生代謝活性成分研究的不斷的發(fā)展，物理誘導(dǎo)也為促進牛肝菌代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生開辟出一條新途徑。

3.2 化學(xué)誘導(dǎo)培養(yǎng)

化學(xué)誘導(dǎo)劑如中藥、中藥提取物、油脂類物質(zhì)及金屬元素都是提高真菌代謝產(chǎn)物的重要手段，它能改變真菌代謝途徑中關(guān)鍵酶的活性，通過快速、專一和選擇性地誘導(dǎo)真菌特定基因的表達而促進細胞的合成和特定代謝產(chǎn)物的積累，從而達到促進真菌代謝產(chǎn)物產(chǎn)生的目的[53]。

王明慧等[54]研究培養(yǎng)基中水楊酸對褐環(huán)粘蓋牛肝菌菌絲生長量的影響，發(fā)現(xiàn)水楊酸濃度在（4.76×10-10）～（4.76×10-6）g/mL 之間對菌絲產(chǎn)量有促進作用，當(dāng)水楊酸濃度在2.38 × 10-10g/mL 時，菌絲生物量達到最大值420 g/L 左右，遠高于沒有經(jīng)過化學(xué)誘導(dǎo)的菌絲產(chǎn)量91.86 g/L。苗廷廷[55]研究了磚紅絨蓋牛肝菌菌絲在含有大米和麩皮的培養(yǎng)基中的生長狀況，發(fā)現(xiàn)在接種7～10 d 后，菌絲在含有大米的培養(yǎng)基上生長速度快，而在添加麩皮的培養(yǎng)基上，直到20～25 d 后才表現(xiàn)出了極好的生長趨勢，且菌絲粗壯致密，菌絲在添加大米或者麩皮的培養(yǎng)基上的生長性狀更好。

目前，將化學(xué)誘導(dǎo)劑添加到牛肝菌發(fā)酵培養(yǎng)基中來調(diào)控次生代謝產(chǎn)物的合成還未見報道，但在其他真菌方面有過報道，如在靈芝液體發(fā)酵液中加10 mmol/L Ca2+后，多糖含量比對照提高34%，三萜含量比對照提高64%，而在發(fā)酵液中加150 μmol/L水楊酸后，多糖含量比對照提高57.54%，三萜含量比對照提高37.19%，靈芝液體發(fā)酵12 d 時加10 mmol/L Ca2+和150 μmol/L 水楊酸，三萜含量比對照可以提高46.9%[56]。在樺褐孔菌液態(tài)培養(yǎng)第6 d 時添加50 mmol/L 茉莉酸甲酯（添加量為2 μL/mL）時，總?cè)飘a(chǎn)量在發(fā)酵第9 d 時，最大達81.74 mg/100 mL，比對照的總?cè)飘a(chǎn)量（60.76 mg/100 mL）提高了34.5%。而亞油酸、油酸和軟脂酸也能促進樺褐孔菌在發(fā)酵過程中總?cè)频姆e累[57]。由此說明，通過化學(xué)誘導(dǎo)促進牛肝菌三萜類化合物的合成是完全可行的，也為藥物研究者指明了開發(fā)高效、低毒的抗癌藥物新的研究方向。

3.3 生物誘導(dǎo)培養(yǎng)

生物誘導(dǎo)子是指微生物或者來源于微生物的成分，包括細菌、真菌（孢子和菌絲體）、酵母、微生物細胞壁成分、微生物蛋白質(zhì)及脂類成分、微生物代謝產(chǎn)物、酵母提取物等[50]，采用真菌誘導(dǎo)子誘導(dǎo)特定次生代謝產(chǎn)物已成為近年來的研究熱點。真菌誘導(dǎo)子（fungal elicitors）是一類來源于真菌且能夠誘導(dǎo)細胞生長和次生代謝產(chǎn)物合成的化學(xué)物質(zhì)，包括有真菌菌體、菌液濃縮物、菌絲和菌液提取物、菌絲體高溫處理后的可溶性成分、細胞壁降解成分、肽類和蛋白質(zhì)等[58]。

段慧[59]分析了平菇汁不同處理方式對褐環(huán)粘蓋牛肝菌菌絲生長量的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)添加10%平菇汁的培養(yǎng)基在發(fā)酵15 d 時菌絲生長速度最快，菌絲干重比對照提高了158%。平菇汁75%乙醇萃取后得到的沉淀進行脫蛋白分離得到粗多糖，將不同濃度粗多糖溶液添加到培養(yǎng)基后發(fā)酵12 d，并在粗多糖溶液添加量為0.2 g/50 mL 時，菌絲干重高于對照達98%。趙磊[60]研究得出平菇汁乙醇透析液中的多肽含量與褐環(huán)粘蓋牛肝菌菌絲生長量呈正相關(guān)，促進菌絲生長的真菌誘導(dǎo)子為透析液中的非脂溶性蛋白質(zhì)或多肽。

在真菌液態(tài)培養(yǎng)基中加入外源誘導(dǎo)因子可以改善代謝途徑中的基因表達與酶活，進而提高真菌代謝產(chǎn)物的生成量，具有較強的特異性[61]。目前，雖然對于誘導(dǎo)子的篩選及在真菌液態(tài)發(fā)酵中的應(yīng)用方面有一定的研究，但對新型誘導(dǎo)子的研究特別是真菌誘導(dǎo)子篩選、誘導(dǎo)機理及調(diào)控機制方面，還存在很多的研究空白。因此，深入研究誘導(dǎo)子的誘導(dǎo)機理，篩選出高效誘導(dǎo)子加入到牛肝菌液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中，提高目標(biāo)代謝產(chǎn)物及其生物合成產(chǎn)量，實現(xiàn)牛肝菌資源的高值化利用，具有重要的科學(xué)研究價值。

4 結(jié)論

采用真菌液態(tài)發(fā)酵方式培養(yǎng)菌絲及生物活性成分，不受自然資源環(huán)境限制，具生產(chǎn)周期短、便于精確控制等優(yōu)點，能夠進行大批量生產(chǎn)。另外，通過改變液態(tài)培養(yǎng)基基質(zhì)組成、發(fā)酵培養(yǎng)條件、外源誘導(dǎo)等手段優(yōu)化真菌次生代謝產(chǎn)物的生成，已成為食品及醫(yī)藥行業(yè)獲取功效成分的新途徑，具有重要的科學(xué)研究意義。牛肝菌資源來源豐富、營養(yǎng)價值和藥用價值高，在液態(tài)發(fā)酵過程中利用外源誘導(dǎo)技術(shù)促使其產(chǎn)生豐富且生物活性好的代謝產(chǎn)物，不僅為牛肝菌科真菌液態(tài)發(fā)酵制備生物活性成分奠定一定的理論基礎(chǔ)，也將成為牛肝菌科真菌資源高效利用的新方向。