應用生物傳感器檢測食品中食源性致病菌的研究進展

萬 峰，吳雅靜

（海軍勤務學院，天津 300450）

民以食為天，食以安為先，食品安全是目前政府和人們最關心的問題之一。近十年來，全世界的食品安全問題層出不窮，其中一個重要因素是來自于食源性致病菌的污染。這些能夠引起中毒或疾病的微生物包括沙門氏菌、大腸桿菌、單核細胞增生李斯特菌和金黃色葡萄球菌等常見致病菌，它們大多通過食物傳播，且有著非常強大的自我擴散能力[1]。食品在采集、加工、運輸、貯藏等環節極易受到這些微生物的污染。而剛被污染的食品通常沒有明顯的食品屬性變化，感官評價檢驗極難發現。人一旦攝入被污染的食品，較為典型的癥狀就是腹瀉，重則甚至會危害生命安全。由此可見，在攝食前，對于食品中的食源性致病菌的檢驗尤為重要。但傳統的菌落分離培養計數法不僅檢出速度慢，而且靈敏度低，不能實現有效的實時快速監控[2]。因此亟需尋找一種簡便、高效、快速的檢測方法。

目前較常用的手段有依賴DNA 體外擴增原理或利用相關細菌的特異性基因來實現對食源性致病菌快速檢驗的PCR 檢測、基因芯片等分子技術，以抗原與抗體的特異型反應為基礎建立的ELISA 檢測、膠體金免疫層析等免疫學技術[3]，這些現代化技術雖能不同程度改進傳統方式檢測的缺陷，但或多或少都存在不足之處，如試驗成本高、操作技術要求高、方法不成熟等問題。近年來，隨著高新科學技術和計算機的發展及新材料的介入，生物傳感器已成為越來越多科學家用來檢測和監控食品中食源性致病菌的一條有效途徑，該方法具有高特異性和高精度的同時又能高效實時監測微生物且成本較低廉，克服了上述方法的缺陷，聯合目前常用的分子技術或免疫學技術更是表現出優良的性能，在食品安全領域中具有廣闊的應用前景和市場價值，因此新型傳感器的開發吸引了眾多科研工作者的目光。

本文主要對生物傳感器原理、類型以及幾種目前常用生物傳感器在檢測食品中食源性致病菌的研究進展等方面進行系統綜述，闡述其在食品安全中的應用和重要價值，并針對當前生物傳感器存在的相關問題進行總結和展望，以期為開發新型生物傳感器和建立快速檢測食源性致病菌體系奠定一定的理論基礎。

1 生物傳感器簡述

生物傳感器是由生物感受器（識別元件）和換能器及信號放大裝置構成的一種分析檢測工具。其原理基于包含多種生物活性材料（酶、抗體、抗原、核酸等）的生物感受器與待檢測物質發生生物學反應產生的濃度信號，由換能器轉換成可定量處理的電信號等其他信號，經二次儀表放大輸出，從而獲得待檢物數量和濃度的信息[4]。具體來說就是目標分析物能夠與抗原或抗體、酶、核酸、受體或噬菌體等生物識別元件特異性結合后會產生生物信號經過基于電化學、光學、壓電、磁力和溫度等一種或多種技術結合而設計成的信號轉換器（即換能器）輸出可供檢測的電信號，信號再經過系統分析處理便可得到實驗數據。

生物傳感器按識別元件可分為酶傳感器、微生物傳感器、組織傳感器、細胞傳感器和免疫傳感器等，識別元件是傳感器的關鍵。按換能器類型不同又可分為電化學生物傳感器、壓電生物傳感器、熱學生物傳感器和光學生物傳感器（圖1）[5]。在各種類型的傳感器中，電化學生物傳感器、壓電生物傳感器和光學生物傳感器結合不同的識別元件在食品檢測中應用較為廣泛且具有良好的發展前景。

圖1 傳感器的組成和分類[5]Fig.1 Components and classification of biosensor[5]

2 生物傳感器在食源性致病菌檢測中的應用

2.1 電化學生物傳感器

電化學生物傳感器是生物傳感器發展歷史上第一個報告的商業化生物傳感器[6]。其原理是利用電極作為換能元件，通過生物識別元件捕獲目標分析物后在電極界面上進行的電化學反應從而引起生物傳感器表面發生電流、電位、阻抗或電導變化，根據監測這些電信號的變化來定量目標分析物的濃度（圖2）[7]。故按最終測量信號的不同可將電化學生物傳感器分為阻抗型、電流型、電勢型和電導型4 種類型，其中阻抗型和電流型生物傳感器在檢測細菌方面應用較多，而電勢型和電導型生物傳感器主要用于檢測病毒和微生物毒素，在實際應用并不是很廣泛。

圖2 電化學生物傳感器的示意圖[7]Fig.2 Schematic representation of the electrochemicalbiosensor[7]

由于電化學生物傳感器研究相對較早同時也較其他傳感器更加成熟，近年來，國內外學者對于研究開發各種類型生物傳感器做了大量的工作并取得了一些重要的成果，基于電化學的DNA 方法，基于電化學抗體的方法，基于使用適配體、抗菌肽（Antimicrobial Peptides,AMP）和噬菌體作為識別元件來檢測食源性致病菌的研究越來越多。如表1 所示列舉了近5 年來電化學生物傳感器的重要研究和應用。通過近年來的文獻可以發現，一方面，識別元件多集中在對核酸和抗體的研究上，同時AMP 和噬菌體由于穩定性高及對細菌的專一性強也越來越受到研究者的重視，具有潛在的開發應用價值；另一方面，根據實際需要，發展同時用于致病菌的多重檢測并能夠區分死細胞和活細胞的的電化學生物傳感器已成為新的趨勢。此外，如何提高電化學傳感器的靈敏度、特異性、高效性也是近年來研究的熱點問題之一，其關鍵在于固定在電極表面的電極材料是否能夠與生物識別元件完美結合，所以研究者們致力于研究和獲取固定在電極表面的新型材料，其中碳基電極及碳納米修飾材料是電化學分析科學家所熱衷研究的電極材料，如石墨烯、碳納米管等。還有報道關于對電化學生物傳感器的處理組件、分析系統、設備包裝等的設計和改進以提高對樣品檢測的特異性和準確度或通過附加操作賦予傳感器更多的功能性，為電化學生物傳感器的發展提供了更多的選擇[8]。如Wang 等[9]開發了一種基于磁珠與叉指型電極和酶反應系統結合的電化學阻抗免疫傳感器，用于大腸桿菌O157:H7 檢測，靈敏度和重復性較好。

表1 近五年來電化學生物傳感器在食品中的研究和應用Table 1 Research and application of electrochemical biosensors in food in the past five years

2.2 光學生物傳感器

光學檢測使用化學發光，顯色或熒光等光信號來定量目標化合物的濃度。目前常用的技術有比色、熒光、化學發光、表面等離子共振（Surface Plasmon Resonance,SPR）、表面等離子體共振成像（Surface Plasmon Resonance imaging,SPRi）技術和表面增強拉曼光譜（Surface-Enhanced Raman Scattering,SERS）等。比色生物傳感器可以使人們通過觀察反應液顏色的變化即時地檢測到致病菌的存在。利用樣品在濾紙或膜中因毛細作用流動擴散以及通過金納米顆粒（Au NPs）聚集而產生顏色的變化，杜邦公司生產的基于側流層析檢測（Lateral Flow Assay,LFA）的生物傳感器以及梅里埃生物公司設計的產品分別可以在10 min 內通過特異性抗體檢測大腸桿菌O157:H7、沙門氏菌、李斯特菌和在15 min內檢測出鏈球菌及嗜肺軍團菌[31]；Park 等[32]開發了一種集成的螺旋微流控系統，用于檢測污染的水和牛奶中的鼠傷寒沙門氏菌和副溶血性弧菌，在80 min內達到的最佳檢測限是50 CFU/mL。熒光生物傳感器是指通過熒光染料、量子點（Quantum Dot,QDs）或其他具有熒光效應的材料“標記”被檢測物體，并以熒光信號為檢測信號的一類生物傳感器。Wang等[33]將金黃色葡萄球菌和鼠傷寒沙門氏菌特異性的適配體修飾在NaYF4:Ce/Tb 和NaGdF4:Eu 納米材料以及納米磁珠上設計了一種生物傳感器以實現對兩種致病菌的定量檢測；化學發光生物傳感器是基于化學發光反應為換能反應而研發的，最常見的化學發光生物傳感器基于三磷酸腺苷（ATP）感應，幾乎所有生物都會產生ATP 作為主要能量存儲分子，通過生物發光或酶促反應來檢測ATP 發光。如Kim 等[34]建立了光熱裂解ATP 生物發光生物傳感器用于快速、靈敏地檢測多種致病菌；SPR 生物傳感器是依據光在棱鏡與金屬膜表面上發生反射形成的消逝波與介質表面等離子波發生共振，從而引起反射光強度的大幅度減弱且受介質界面折射率的影響，將生物識別分子結合在金屬表面，通過影響這種光學現象來實現檢測的目的。目前，已有多種商業傳感器研發上市，如SPREETA 和BIACORE 3000 等已被廣泛用于檢測食品中大腸桿菌、腸炎鏈球菌、鼠傷寒沙門氏菌和單核細胞增生李斯特菌。SERS 檢測原理主要是依賴于拉曼散射效應而產生的指紋圖譜被由特殊材料制備的樣品表面的電磁場增強信號而達到特定實時檢測的一種方法。

Yoo 等[35]綜述了2016 年以前已應用于檢測微生物的一些重要光學傳感器，討論了它們各自的優點和局限性并對未來的發展趨勢和開發策略提出建議。在最近的研究中，Zhou 等[36]設計了一種基于AMPs 的光纖SPR，可以檢測水、水果和蔬菜汁中大腸桿菌O157:H7。在這一研究中，均勻層的銀納米顆粒還原的氧化石墨烯（AgNPs-rGO）納米復合材料在金膜層之前被固定在光纖上，大大增強了SPR 響應。Masdor 等[37]研究了一種SPR 技術，使用特定的多克隆抗體作為識別元素，用于檢測食品樣品中的空腸彎曲桿菌。Tokel 等[38]開發了一種便攜式，多重且廉價的微流體集成SPR 平臺，可實現對大腸桿菌快速定量檢測。Aura 等[39]報道了一種金納米顆粒（AuNPs）增強的表面等離子體共振成像（SPRi）生物傳感器，用于快速靈敏地檢測金黃色葡萄球菌和單核細胞增生李斯特菌。相似地，Morlay 等[40]開發了一種基于SPRi 技術的生物傳感器用來特異性檢測單核細胞增生李斯特氏菌的免疫傳感器，30 min 內即可對完成萵苣樣品中病原菌的檢測。Duan 等[41]最近報道了一種基于納米金顆粒修飾聚二甲基硅氧烷（PDMS）膜作為增強拉曼散射的活性基質與適配體（Apt）結合后形成Apt-Au-PDMS 三明治夾心復合物為探針的新型SERS 傳感器方法可同時快速檢測的海鮮樣品中的副溶血性弧菌和沙門氏菌，檢測限分別為18 和27 CFU/mL，目標菌的回收率為82.9%～95.1%。

光學生物傳感器與電化學傳感器的主要識別元件大體相似，其中以抗體、核酸和酶報道居多，材料的折射率是提高SPR 傳感器靈敏度的關鍵，目前較理想的材料就是納米顆粒，通常選擇表面修飾Au 納米顆粒，能夠提高顆粒的分散性，增強光學傳感的表面積，提供更多的結合位點。較電化學生物傳感器來說，光學生物傳感器最顯著的優勢就是可開發用于現場即時檢測的可視化生物傳感器，微流控和光學一體化技術的不斷發展，使開發現場即時檢測系統變得更加可行。此外，前人已對基于智能手機系統研發的既有光源又有光檢測器的生物傳感器研究開發多年，既可以提供簡單使用界面又可以實現快速檢測[31]。由于不同類型的光學生物傳感器有各自的優勢，為了提高檢測的靈敏度和特異性，在實際應用中，開發的生物傳感器并不是使用單一技術，往往包含多種光學手段。可視化光學生物傳感器是今后研究和開發的重點。

2.3 壓電生物傳感器

壓電生物傳感器是指基于壓電效應設計的生物傳感器，由于其簡單和低成本而廣泛使用，其典型代表是聲表面波傳感器（Surface Acoustic Wave,SAW）和石英晶體微天平傳感器（Quartz Crystal Microbalance,QCM）。SAW 生物傳感器是利用材料的壓電效應以及聲表面波特性受環境因素影響這一原理而制成的；QCM 生物傳感器的原理是將分析物結合在晶體傳感器表面而引起石英晶體共振頻率的變化，共振頻率取決于與傳感器表面結合的分析物的質量，即可實現實時地檢測微量分析物濃度[42]。Shen 等[43]研究了基于免疫磁性納米粒子（Beacon Immunomagnetic Nanoparticles,BIMP）的QCM 傳感器，可以高特異性，高穩定性地成功檢測出牛奶中的大腸桿菌O157:H7，檢出限為53 CFU/mL，整個過程僅用了4 h。Masdor 等[44]設計納米粒子增強的QCM 生物傳感器用于檢測空腸彎曲桿菌，通過晶體表面固定的抗體來特異性識別空腸彎曲桿菌。Dong等[45]開發了基于AMPs 的QCM 方法進行檢測水體中的大腸桿菌O157:H7，檢出限為400 CFU/mL，10 min 之內即可完成快速檢測。Yu 等[46]構建了基于ssDNA 適配體的QCM 傳感器，能夠與大腸桿菌O157:H7 特異性結合，檢測限和檢測時間分別為1.46×103CFU/ml 和50 min。在對食源性致病菌檢測的研究中，大部分集中在QCM 生物傳感器上，SAW 在食品中的應用較少，盡管尚未報道便攜式SAW 生物傳感器，但基于SAW 的設備是用于病原體現場檢測是較有前途的工具，對其研究價值不可忽視。Xu 等[47]采用覆蓋膜材料對SAW 傳感器定量檢測金黃色葡萄球菌作了對比研究，結果表明勒夫波（Love Wave）檢測可以得到高靈敏度和低檢測限的結果，但諧振器損耗大、品質因數低。基于此種情況，齊曉琳等[48]采用叉指電極中間內置敏感區域的諧振器結構設計了一種新型SAW 傳感器來實現對金黃色葡萄球菌實時特異性檢測。

鑒于由壓電效應設計的生物傳感器具有較高的靈敏度，即使目前在食源性致病菌檢測領域應用較少，但有充分的理由相信它在未來食品安全中將占有一席之地。為了更好地提高檢測性能，在現有研究中，壓電傳感器常需要與其他技術結合，將各種方法的優點結合起來以發揮最優功效。例如，電化學、光學原理與壓電技術相結合可以獲得更多的樣品檢測信息。

2.4 其他生物傳感器

此外，還有一些其他生物傳感器如半導體感器、磁力傳感器、微流控系統集成的生物傳感器、核磁共振生物傳感器也在病原菌檢測方面得到廣泛應用[49]。這類生物傳感器基于最新的科技手段，具有靈敏度好、特異性強和快速高效等特點，其在致病菌檢測和監控應用方面的前景非常可觀。相信隨著生物技術的不斷進步，將不斷涌現出越來越多新型生物傳感器應用到食源性致病菌的檢測。

3 商業化生物傳感器

近年來，生物傳感器因具有優越性能而在食品以及醫療領域中展現出了巨大的應用潛力。在醫療方面，生物傳感器主要用作藥物分析、診斷和監測腫瘤、自動檢測血糖等；在食品工業中，與生物傳感器相關的主要集中在食品安全檢測和監管方面，包括致病菌的快速檢測和食品中農藥及毒素的殘留等，其中尤以在發酵乳制品、肉制品和蔬菜中的應用最為廣泛，主要是由于乳制品和肉制品富含微生物生長繁殖的蛋白質，因此極易受到污染引起腐敗變質，而在蔬菜中主要是檢測農藥或毒素的殘留。據報道，越來越多具有快速、靈敏、專一、高效的生物傳感器被成功研發并投放到市場，截至目前全球市場已有超過幾十余種產品，并根據食品的特點結合傳感器的不同類型以達到對致病菌的精準檢測。常見應用于檢測食源性致病菌的商業化生物傳感器見表2。

表2 用于食品檢測常見的商業化生物傳感器Table 2 Maincurrently commercial biosensors in food detection

4 各類傳感器的優缺點

雖然生物傳感器對于檢測食源性致病菌較傳統方法和其他一些檢測手段來說具有獨特的優勢，如靈敏度高、檢測快速等。但不可忽視的是它仍然存在著諸多問題，其中最重要和最關鍵的就是穩定性和精確度。不同類型的生物傳感器雖各有所長但同時也有一定的缺陷，其優缺點總結如下（表3）。總體來說，商業化的生物傳感器還是少之又少，目前正在研發和報道的傳感器仍然存在一些問題有待解決：區分死菌和活菌能力。傳統的平板菌落計數法反映的活菌的數量，而多數生物傳感器往往檢測的死細胞和活細胞總的數量；檢測樣品有限。大部分生物傳感器只適用于檢測液體樣品，如牛奶，果汁或肉湯等，應用于復雜食物可能會引起食物基質的嚴重干擾；目標菌的檢測較為單一，大部分生物傳感器只能檢測單一病原菌，而在食品質量監控中往往需要檢測多種微生物[53]。

表3 不同類型傳感器的比較Table 3 A comparison of the different types of biosensors

基于各類傳感器的特點和適用范圍，如何針對性地改進和完善傳感器的性能仍需科研工作者為此不懈努力，將各類傳感器的優勢更好地整合到一起需要進一步積極探索和研究。

5 前景與展望

相較于傳統方法，生物傳感器技術操作簡單，檢出速度快，已在食品檢測領域取得突破并日趨成熟，但由于抗干擾能力差，可靠性低及各種復雜的因素限制了其在病原菌檢測中的應用，影響了該技術的推廣和應用，尤其是對于起步和發展較晚的我國來說，許多方法仍處于實驗室階段，現今尚無可靠的商業化傳感器走向市場，大量的基礎研究工作仍有待開展。理想的傳感器的不僅要求靈敏度高，在短時間內提供實時可靠的結果，而且能夠特異性區分復雜食品中的目標細菌。如何提高傳感器的靈敏度和特異性、可重復性和穩定性、降低成本以及使其更加便攜化和智能化是當前亟需解決的問題也是未來的發展趨勢。

解決生物傳感器目前存在的一些主要問題的關鍵是要選擇更具體的受體和更靈敏的基質材料，大量的文獻報道有越來越多的新型材料，如石墨烯、金屬納米粒子、分子印跡聚合物被應用到生物傳感器上，結合當前先進的納米技術、3D 技術、CRISPR 技術、微流體技術等就可能成功地構建靈敏的生物分析工具，但同時還需要開展更深層次的理論研究，以更好地理解新興材料與生物分子的相互作用機制。如何區分死菌體和活菌體，目前AMPs 和免疫磁球是一種有效的手段，基于AMPs 和免疫磁球方法研制的生物傳感器均有報道。在實際應用中樣品組成非常復雜，為了避免干擾，用于檢測快速食品中病原菌的生物傳感器的開發必須依賴于食品的類型和食品中所含的營養物質，如脂肪、蛋白質和纖維。因此，在今后實際應用中，可能需要為每種食品開發特定的傳感器或特定的分析工具和取樣方法。關于樣品的預處理，多數文獻中沒有過多描述，需要明確的是大部分生物傳感器均需要對樣品進行預處理，只有少數生物傳感器無需對樣品進行預處理，液體樣本大多使用緩沖液稀釋、過濾或離心方法，更復雜的液體樣品也可能需要勻漿處理。動物性食品樣本需要額外的步驟，通常是要在合適的溶液中消化，然后進行離心、稀釋或過濾。因此，生物傳感器自動化或便攜式預處理系統同樣是未來研究的重要方向，檢測設備趨向于小型化、簡單化、成本低廉、高通量和集成多元化發展。此外，還有一些技術和手段尚處在起步階段，如納米顆粒碰撞電化學和智能包裝等，為開發新一代的智能生物傳感器提供了新的思路。

綜上所述，生物傳感器技術的發展勢必會引起食源性致病菌檢測方法的變革與創新，在食品安全領域中有著巨大的開發應用價值。