一種葡萄釀酒活性干酵母簡便制備法

李東歌，劉紅艷，葉冬青，秦 義,3，孫 悅，許引虎，劉延琳,3,

（1.西北農(nóng)林科技大學(xué)葡萄酒學(xué)院，陜西楊凌 712100；2.廣西壯族自治區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，廣西南寧 530007；3.中國葡萄酒產(chǎn)業(yè)技術(shù)研究院，寧夏銀川 750021；4.寧夏大學(xué)葡萄酒學(xué)院/寧夏葡萄與葡萄酒研究院，寧夏銀川 750021；5.湖北省酵母功能重點實驗室，湖北宜昌 443003）

釀酒活性干酵母是現(xiàn)代高新技術(shù)融合發(fā)展的一種生物活性制品，具有發(fā)酵性能優(yōu)良、細胞耐性強、絮凝性好、保存期長、運輸方便等優(yōu)點[1-2]。在葡萄酒生產(chǎn)中，釀酒活性干酵母是葡萄酒的關(guān)鍵輔料，優(yōu)良的釀酒活性干酵母能使葡萄酒發(fā)酵的過程穩(wěn)定易控，促進葡萄漿果優(yōu)良品質(zhì)在發(fā)酵過程中最大限度的表達，從而獲得高品質(zhì)的葡萄酒[2]。其性能的優(yōu)劣不僅決定了葡萄酒發(fā)酵能否順利進行，更會對葡萄酒的質(zhì)量，特別是葡萄酒口感和風(fēng)味產(chǎn)生顯著影響[3-4]。近年來隨著“微生物風(fēng)土”概念的提出和被葡萄酒行業(yè)普遍接受，亟需一種設(shè)備投入要求低、簡便的釀酒活性干酵母制備方法來進行特定釀酒活性干酵母的制備，以滿足具有地域特色風(fēng)格的葡萄酒產(chǎn)品開發(fā)需求[5]。

生產(chǎn)釀酒活性干酵母主要是對其培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件進行優(yōu)化，從而培養(yǎng)獲得活性強且生物量高的酵母，再采用較為溫和的方式進行干燥，以獲得高活性的干酵母制品。酵母菌在生長過程中受到巴斯德效應(yīng)（The Pasteur Effect）和克雷布特效應(yīng)（The Crabtrec Effect）的雙重調(diào)節(jié)，嚴格優(yōu)化培養(yǎng)基成分和含量對高生物量的獲得十分關(guān)鍵[6]，流加培養(yǎng)的關(guān)鍵在于對培養(yǎng)條件和補料方式進行優(yōu)化，以保證培養(yǎng)過程始終處在最佳的狀態(tài)[7]。發(fā)酵罐是酵母培養(yǎng)重要的生物反應(yīng)器，工業(yè)化活性干酵母的制備方法大多采用“發(fā)酵罐-流化床”體系進行制備。新型發(fā)酵罐基本上是圍繞傳氧效率、攪拌系統(tǒng)、使用材料三者的綜合考慮[8]，而搖瓶培養(yǎng)只需要控制轉(zhuǎn)速、溫度等簡單條件。生產(chǎn)釀酒活性干酵母干燥過程是將酵母細胞脫水使之進入一個新陳代謝臨時可逆、暫停的低濕休眠狀態(tài)[9]，其中熱風(fēng)干燥、真空干燥、噴霧干燥和流化床干燥等[10-11]是常用的方法。與其它干燥方法相比，熱風(fēng)干燥操作簡單、成本低，對于中小微企業(yè)來說能夠帶來更好的經(jīng)濟收益。熱風(fēng)干燥是將物料置于連續(xù)流動的空氣流中，使物料中的水分不斷蒸發(fā)的過程[12]。發(fā)酵罐生產(chǎn)對于小微企業(yè)生產(chǎn)活性干酵母成本相對較高，所以“搖瓶-烘箱”體系更加簡便、經(jīng)濟實惠。

為了滿足實驗室或大量中小型企業(yè)對小批量制備特定本土活性干酵母的需求，本研究以優(yōu)選釀酒酵母菌株wh-2-8 為試驗對象，進行基于“搖瓶-烘箱”平臺的釀酒活性干酵母的制備研究，優(yōu)化發(fā)酵工藝和干酵母制備工藝，得到最佳培養(yǎng)時間、酵母最佳鼓風(fēng)干燥時間，保護劑最佳添加量等，以期為小批量簡便制備活性干酵母提供技術(shù)方法和理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料與儀器

赤霞珠葡萄 2018 年采于寧夏，成熟度良好，總糖232.52 g/L，總酸（以酒石酸計）5.32 g/L，pH 3.48；釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)wh-2-8 保存于西北農(nóng)林科技大學(xué)葡萄酒學(xué)院釀酒微生物種質(zhì)資源室；搖瓶種子培養(yǎng)基、酵母浸出粉胨葡萄糖（Yeast Extract Peptone Dextros，YEPD）液體培養(yǎng)基、葡萄糖 天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；酵母浸粉、蛋白胨 北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；氫氧化鈉 四川西隴科學(xué)有限公司；果膠酶 沃爾森公司；亞硫酸 天津市天力化學(xué)試劑有限公司；海藻糖 上海源葉生物科技有限公司；葡萄糖、氫氧化鈉、果膠酶 均為分析純。

BK1301 生物顯微鏡 南京庚辰科學(xué)儀器有限公司；Cary60 紫外可見分光光度計 安捷倫科技有限公司；ELX800 酶標儀 美國Bio-Tek 公司；NRY-2110 恒溫搖床 上海南榮實驗室設(shè)備有限公司；HDS-16-5 鹵素電子水分儀 上海方瑞儀器有限公司；GNP-9080 隔水式恒溫培養(yǎng)箱 上海精宏實驗設(shè)備有限公司；TDL-40B 高速離心機 上海安亭科學(xué)儀器廠；CS1013 電熱鼓風(fēng)干燥箱 重慶試驗設(shè)備廠。

1.2 試驗方法

1.2.1 種子液培養(yǎng)菌種活化 將保存于-80 ℃冰箱的釀酒酵母wh-2-8 菌株于無菌狀態(tài)下用接種環(huán)挑取一環(huán)在平板培養(yǎng)基上劃線，用封口膜封口，置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h。

活化后接于裝有200 mL 種子培養(yǎng)基的搖瓶，在轉(zhuǎn)速250 r/min、溫度30±1 ℃的恒溫震蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至穩(wěn)定期，挑選穩(wěn)定期前期至對數(shù)期后期的節(jié)點作為接種時間點。

1.2.2 搖瓶增殖培養(yǎng) 將培養(yǎng)至最佳時間的種子液在無菌狀態(tài)下按搖瓶裝液量體積的10%進行接種，在轉(zhuǎn)速250 r/min、溫度30±1 ℃的恒溫震蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔4 h 取樣監(jiān)測，并及時加入400 g/L 葡萄糖溶液和1 mol/L NaOH 溶液進行補料，使葡萄糖含量維持在20 g/L 的水平，pH 維持在5～6 的水平。

1.2.2.1 搖瓶裝液量優(yōu)化試驗 在500 mL 錐形瓶中加入培養(yǎng)基的量分別設(shè)定為100、150、200、250 mL，測定OD600nm，分析不同裝液量對釀酒酵母生長的影響，并確定最佳搖瓶裝液量。

1.2.2.2 補料方式優(yōu)化試驗 以最佳搖瓶裝液量進行接種培養(yǎng)，設(shè)定3 組補料方式，A 組：進行碳源補加并調(diào)節(jié)pH 在5～6 的水平；B 組：只進行碳源補加；C 組：不進行補料。測定OD600nm，分析三種補料方式對釀酒酵母生長的影響，確定最佳補料方式。

1.2.3 菌體鼓風(fēng)干燥 將增殖培養(yǎng)完成后干重達到最大時的酵母培養(yǎng)液進行離心，在得到的酵母菌體中加入保護劑，分置于90 mm 的玻璃皿，放入鼓風(fēng)干燥箱進行干燥。將干燥完成的酵母活性干粉封藏于密封袋中，放于4 ℃冰箱貯存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3.1 保護劑添加量優(yōu)化試驗 離心獲得的酵母泥，以海藻糖為保護劑，添加量（以干重計）設(shè)定為5%、8%、10%，放置于36 ℃條件下進行干燥，每隔1 h 取樣進行水分含量的測定，以水分含量≤5.5%來確定干燥時間。分析不同保護劑添加量對酵母菌體的活菌率影響，確定最佳保護劑添加量。

1.2.3.2 鼓風(fēng)干燥溫度優(yōu)化試驗 在選定的最佳保護劑添加量的基礎(chǔ)上，設(shè)定干燥溫度分別為30、33、36、40、45 ℃，每隔1 h 取樣進行水分含量的測定，以水分含量≤5.5%來確定干燥時間。分析不同干燥溫度對酵母菌體活菌率的影響，確定最佳干燥溫度。

1.2.4 指標測定方法 采用3，5-二硝基水楊酸（DNS）法進行葡萄糖濃度的測定[13]；光密度測定：于600 nm波長處測定適當(dāng)稀釋的發(fā)酵液光密度值OD600nm；細胞干重測定：離心所得菌體恒溫烘干至質(zhì)量恒定；酵母細胞數(shù)檢測法：用顯微鏡血球計數(shù)法計數(shù)。復(fù)水活化活菌率按照公式（1）進行計算。

1.2.5 活性干酵母發(fā)酵性能檢驗 將赤霞珠葡萄進行除梗破碎，裝入2.5 L 玻璃容器中（設(shè)置3 組平行：罐號1、2、3），按照1 mg/L 的添加量添加6%亞硫酸并混合均勻，后于葡萄醪中加入30 mg/L 果膠酶，24 h后加入已用葡萄汁活化好的wh-2-8 釀酒活性干酵母粉，接種量為6.80×106個/mL，進行浸漬發(fā)酵。

在發(fā)酵過程中，每12 h 進行一次壓帽，每隔24 h進行一次殘?zhí)堑臏y定。在發(fā)酵結(jié)束后，進行殘?zhí)恰⒕贫取]發(fā)酸、pH 及總酸的測定。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用Microsoft Office 2010 進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計；Minitab 18 進行數(shù)據(jù)分析，多組間分析采用One-Way ANOVA 法；Origin 9.5 軟件進行作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 釀酒酵母wh-2-8 生長特征

釀酒酵母wh-2-8 的生長呈現(xiàn)典型的對數(shù)生長（圖1），從培養(yǎng)開始至10 h 為生長延滯期，10～20 h為生長對數(shù)期，20 h 后處于酵母的生長穩(wěn)定期。考慮到菌株的數(shù)量和活力，選擇處于生長對數(shù)期后期至穩(wěn)定期前期的22 h 作為釀酒酵母wh-2-8 種子液培養(yǎng)的最佳時間，此時的活細胞數(shù)為1.47 × 107個/mL。

圖1 釀酒酵母種子液生長曲線Fig.1 Growth curve of S.cerevisiaeseed liquid

2.2 搖瓶裝液量的選擇

比較不同裝液量對釀酒酵母wh-2-8 生長量的影響，其結(jié)果如圖2 所示。24～48 h 酵母處于對數(shù)生長期，生長較快；而在52～96 h 酵母生長開始出現(xiàn)衰亡，因為調(diào)節(jié)pH 和糖導(dǎo)致?lián)u瓶中溶氧越來越低，所以酵母生長量開始降低。通過對比可知：初始裝液量越少，相同時間內(nèi)菌體生長量越高。因此，綜合考慮菌體總積累量以及培養(yǎng)時間，確定在500 mL 錐形瓶中裝液量200 mL 作為搖瓶擴大培養(yǎng)的條件。

圖2 不同裝液量下酵母的生長曲線Fig.2 Growth curve of yeast with different liquid volume

2.3 補料方式與培養(yǎng)時間的選擇

搖瓶培養(yǎng)條件下，進行碳源分批補加以及發(fā)酵pH 控制（圖3）。進行碳源分批補料、pH 調(diào)節(jié)的（A 和B）生長量在48 h 達到穩(wěn)定期，而不進行碳源和pH 調(diào)節(jié)的（C）在32 h 達到穩(wěn)定期；200 mL 裝液量條件下，補加碳源并調(diào)節(jié)pH 時（A）的菌體生長量高于其它兩組補料方式（B、C），OD600nm最大可達到56.23；只補加碳源（B）的條件下，酵母生長低于補加碳源并調(diào)節(jié)pH 組（A），OD600nm最大值為52.22；不進行補料（C）組的菌體最大OD600nm僅為34.57。因此，有利于搖瓶擴大培養(yǎng)的補料方式為進行碳源補加并調(diào)節(jié)pH。

圖3 不同補料方式酵母生長曲線Fig.3 Curves of feeding ways on biomass of S.cerevisiae

在選定的補料方式的基礎(chǔ)上，以菌體濃度指標，選擇搖瓶培養(yǎng)的時間，以獲得在最佳生物活性狀態(tài)下的最大菌體濃度。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，酵母菌體干重在55 h達到最大值17.80 g/L，活菌數(shù)5.68×108個/mL，OD600nm達到54.95（圖4）。因此綜上所述，基于“搖瓶”的釀酒酵母較優(yōu)的培養(yǎng)條件為：YEPD 為發(fā)酵培養(yǎng)基、搖床轉(zhuǎn)速250 r/min、培養(yǎng)溫度30±1 ℃、間歇補料維持葡萄糖在20 g/L 水平、pH 5～6 水平，發(fā)酵時長為55 h。

圖4 搖瓶間歇補料培養(yǎng)生長曲線Fig.4 Growth curve of batch culture in shake flask

2.4 鼓風(fēng)干燥保護劑添加量的確定

選擇最常用的鼓風(fēng)干燥箱作為探究活性干酵母的干燥設(shè)備。干燥條件對酵母菌體活性影響較大，而保護劑可以在制備酵母活性干細胞過程中能起到保護作用，有效地提高活菌率[14]。相關(guān)研究表明海藻糖對酵母具有較好的保護效果[15]，本研究探究了三種濃度下海藻糖對干酵母的保護作用，結(jié)果如圖5 所示。保護劑的含量從5%提高到8%時，活菌率顯著提高（P＜0.05），而8%的添加量與10%的添加量的活菌率分別為70.16%和71.02%，并無明顯提高，考慮到生產(chǎn)中實際的經(jīng)濟效益，所以選擇保護劑的添加量是8%。

圖5 不同保護劑添加量的活菌率Fig.5 Livingcell rate of different protective agent additions

2.5 鼓風(fēng)干燥溫度和時間的確定

在確定保護劑用量為8%的基礎(chǔ)上，設(shè)定一系列溫度梯度，探究不同干燥溫度和時間對活性干酵母活菌率的影響，結(jié)果如表1 所示。在30～36 ℃條件下，活菌率隨著溫度的升高而有所升高；而超過36 ℃，溫度越高，活菌率反而越低。在36 ℃干燥12 h 的條件下，活菌率達到最大值71.05%，干粉水分含量在5.15%，符合國標GB/T 20886-2007[16]對活性干酵母含水量（≤5.5%）的要求。

表1 不同鼓風(fēng)干燥溫度下活菌率和含水量Table 1 Living cell rate and water content at different air drying temperatures

2.6 釀酒活性干酵母基本質(zhì)量指標

對所制備的活性干酵母的基本質(zhì)量指標進行檢測（表2）。制備的釀酒活性干酵母指標中除了活細胞率略低于國標GB/T 20886-2007 的80%外[16]，其它質(zhì)量指標符合國家標準，可達到實驗室階段簡便制備小批量活性干酵母的目的，具有實際使用價值。

表2 釀酒活性干酵母基本質(zhì)量指標Table 2 Quality indicators of active dry yeast

2.7 發(fā)酵性能檢測

使用制備的釀酒活性干酵母進行干紅葡萄酒的發(fā)酵試驗（圖6）。釀酒酵母wh-2-8 在啟酵后的24～96 h 內(nèi)能夠迅速將糖代謝轉(zhuǎn)化成酒精，啟酵迅速，且發(fā)酵過程平穩(wěn)，符合釀酒酵母發(fā)酵特性。發(fā)酵結(jié)束所得干紅葡萄酒基本理化指標如表3 所示。3 個酒樣之間理化指標穩(wěn)定性較好，殘?zhí)蔷∮? g/L，酒度達12%（V/V）以上，揮發(fā)酸遠低于國家標準（1.2 g/L）[17]，說明所制備的活性干酵母發(fā)酵性能良好，可用于實際葡萄酒的釀造生產(chǎn)。

圖6 發(fā)酵過程中還原糖變化Fig.6 Change of reducing sugar content during fermentation

表3 干紅葡萄酒基本理化指標Table 3 Basic physical and chemical indexes of dry red wine

3 結(jié)論與討論

本研究通過釀酒活性干酵母工藝的優(yōu)化，建立了對“搖瓶-烘箱”體系的釀酒活性干酵母簡便制備方法，對比“發(fā)酵罐-流化床”體系，“搖瓶-烘箱”體系滿足了試驗研究和普通小微企業(yè)簡便制備特色釀酒活性干酵母的需求。

在搖瓶增殖培養(yǎng)工藝上，通過補加碳源和控制發(fā)酵過程pH 的方式，使得酵母細胞干重最高可達17.80 g/L 的水平，明顯優(yōu)于前人搖瓶培養(yǎng)的結(jié)果[18-19]。趙小麗等[18]通過對釀酒酵母有氧發(fā)酵條件進行探究、優(yōu)化實驗室搖瓶發(fā)酵條件，優(yōu)化后的菌體干重為9.63 g/L；南博[19]通過對搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件的探究獲得的最終菌體量為11 g/L。上述研究中，菌體量較低的原因可能是在培養(yǎng)過程中搖床轉(zhuǎn)速為180 r/min，從而導(dǎo)致生產(chǎn)過程中溶氧較低，影響了酵母生長量[20]，同時也沒有進行補料，這也導(dǎo)致了后期酵母因營養(yǎng)缺失停止生長[21]。本文通過對轉(zhuǎn)速的控制提高，采用補料的方式，最終提高了釀酒活性干酵母的生物量。

在干燥階段工藝上，選擇了最常見的鼓風(fēng)干燥箱作為酵母菌體的干燥設(shè)備，所得到的較優(yōu)結(jié)果條件下的酵母活菌率已達71.05%，相較于同樣使用海藻糖做單一保護劑的研究結(jié)果[22-23]，本試驗雖略低于80%，但其發(fā)酵赤霞珠干紅葡萄酒殘?zhí)切∮? g/L，酒度達12%（V/V）以上，揮發(fā)酸遠低于國家標準（1.2 g/L）性能[24-25]，具有良好的發(fā)酵性能。多數(shù)的研究表明，復(fù)合保護劑的添加更有利于提高活菌率[26-30]，后續(xù)可進行不同保護劑的復(fù)配使用以進一步提高活菌率。綜上，本研究通過對活性干酵母制備工藝的優(yōu)化，為實驗室條件下進行小批量釀酒活性干酵母的簡便制備提供技術(shù)方法和理論依據(jù)。