釀酒酵母F15 和CC17 共接種發(fā)酵對(duì)赤霞珠葡萄酒品質(zhì)及感官特性的影響

金洪偉，梁恒宇 ，郭 坤5,，蘇 寧，王加友，田 甜

（1.深圳市光明區(qū)疾病預(yù)防控制中心，廣東深圳 518106；2.中國(guó)中化集團(tuán)有限公司沈陽(yáng)化工研究院生物與醫(yī)藥研究所，遼寧沈陽(yáng) 110021；3.武漢生物技術(shù)研究院湖北省合成微生物技術(shù)工程實(shí)驗(yàn)室，湖北武漢 430075；4.武漢大學(xué)藥學(xué)院組合生物合成與新藥發(fā)現(xiàn)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北武漢 430071；5.齊齊哈爾市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)中心，黑龍江齊齊哈爾 161005；6.中糧華夏葡萄酒有限公司，河北昌黎 066600）

釀酒酵母是決定葡萄酒品質(zhì)的關(guān)鍵因素之一[1]。然而，工業(yè)上長(zhǎng)期使用少數(shù)商業(yè)酵母菌株不僅降低了葡萄酒加工環(huán)境中微生物的多樣性[2]，還減少了葡萄酒的特色和復(fù)雜性[3]，造成產(chǎn)品“同質(zhì)化”問(wèn)題[4]。為了適應(yīng)不斷變化的市場(chǎng)和消費(fèi)者對(duì)不同風(fēng)格葡萄酒的追求，葡萄酒制造商需要通過(guò)釀造出品質(zhì)卓越而風(fēng)格獨(dú)特的酒來(lái)吸引日益擴(kuò)大的消費(fèi)群體，并在激烈的競(jìng)爭(zhēng)中保持市場(chǎng)地位[5]。

葡萄酒地域性差異得到廣泛研究，越來(lái)越多的結(jié)果表明葡萄酒釀造過(guò)程中使用本土優(yōu)良酵母是強(qiáng)化成酒個(gè)性風(fēng)味的有效方法之一[6-7]。遺傳背景不同的菌種或菌株因代謝框架差異賦予葡萄酒不同的風(fēng)味和官感[8-9]，近年來(lái)通過(guò)釀酒酵母與非釀酵母（non-Saccharomyces）或不同釀酒酵母菌株混合發(fā)酵釀造葡萄酒成為人們的關(guān)注熱點(diǎn)[10-11]。然而非釀酵母的安全性、可控性及其功能特性尚需大量研究[12]。因此，利用具有不同代謝框架釀酒酵母菌株進(jìn)行共接種發(fā)酵，以改善葡萄酒的風(fēng)味和香氣成分，是當(dāng)前的研究重點(diǎn)。研究表明混合發(fā)酵過(guò)程中不同釀酒酵母菌株之間的相互作用會(huì)影響菌株代謝[13]。Cheraiti 等發(fā)現(xiàn)葡萄酒混合培養(yǎng)過(guò)程中不同釀酒酵母屬菌株間的相互作用能影響生物量、發(fā)酵模式、代謝物積累以及氧還電勢(shì)水平，表明不同菌株之間存在著代謝流交換[14]。而這些相互作用和物質(zhì)交換是使所釀葡萄酒產(chǎn)生與單一菌株發(fā)酵不同代謝框架的基礎(chǔ)[15]。最近研究表明，高氮源同化速率可能是混合發(fā)酵時(shí)不同釀酒酵母菌株強(qiáng)化自身競(jìng)爭(zhēng)能力的一種額外策略，因此在選擇混合發(fā)酵的菌種時(shí)應(yīng)將氮源利用能力作為篩選標(biāo)準(zhǔn)之一[16]。研究證明利用不同的釀酒酵母菌株進(jìn)行共發(fā)酵可以調(diào)整或改變葡萄酒的香氣組成[17]，并在一定程度上避免因單菌株發(fā)酵產(chǎn)生的一些發(fā)酵缺陷[18]。朱娟娟等對(duì)F9 和F33 兩株商業(yè)釀酒酵母菌株單發(fā)酵和混合發(fā)酵過(guò)程中理化指標(biāo)、顏色色調(diào)、香氣組分和抗氧化特性進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)混菌接種后發(fā)酵啟動(dòng)速率較單菌種快，顯著降低總糖含量，且抗氧化性顯著提升[19]。然而，對(duì)不同釀酒酵母菌株共接種發(fā)酵釀造葡萄酒仍需更多深入研究，關(guān)于該模式對(duì)葡萄酒代謝框架和感官品質(zhì)影響的認(rèn)識(shí)也十分有限[20]。現(xiàn)有的研究集中在商業(yè)釀酒酵母之間的混合發(fā)酵，而尚未見(jiàn)利用商業(yè)酵母與中國(guó)本土優(yōu)良釀酒酵母菌株進(jìn)行共發(fā)酵的報(bào)道。

F15 是我國(guó)葡萄酒釀造行業(yè)常用的商業(yè)釀酒酵母菌株，F(xiàn)15 菌株的廣泛使用造成葡萄酒產(chǎn)品品質(zhì)趨同且缺乏個(gè)性[21]。CC17 是從我國(guó)河北省昌黎縣葡萄酒產(chǎn)區(qū)自然發(fā)酵葡萄汁中篩選得到的優(yōu)良本土釀酒酵母[21]。此前研究業(yè)已證明F15 和CC17 具有明顯不同的遺傳背景[21]和代謝特點(diǎn)[22]。而通過(guò)與本土酵母進(jìn)行共接種發(fā)酵可能會(huì)改善葡萄酒的品質(zhì)和感官特性。本研究以F15 和CC17 單獨(dú)發(fā)酵為對(duì)照，對(duì)F15 和CC17 共接種發(fā)酵釀造赤霞珠葡萄酒酒精發(fā)酵過(guò)程中比重、溫度、殘?zhí)恰⒁掖肌⒖偹帷H、花青素、單寧、總酚、色度和色調(diào)的變化進(jìn)行了監(jiān)測(cè)，發(fā)酵結(jié)束后又分別對(duì)酒的香氣成分和感官特性進(jìn)行了測(cè)評(píng)，旨在為工業(yè)上開(kāi)展商業(yè)酵母與本土野生釀酒酵母共接種發(fā)酵研發(fā)和生產(chǎn)提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

赤霞珠葡萄 取自2018 年河北省昌黎縣，接種前葡萄汁的基本理化指標(biāo)為：總糖含量203.2±1.4 g/L，總酸為9.13±0.21 g/L，初始pH 為3.37，色度為5.29±0.64，花青素為0.31±0.02 g/L，單寧為0.66±0.03 g/L，總酚0.98±0.05 g/L；釀酒酵母CC17（CGMCC3284）

中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心；商業(yè)釀酒酵母F15、果膠酶（AR2000，活力＞20000 U/g）法國(guó)Laffort 公司；4-甲基-2-戊醇（色譜純，含量≥99%）美國(guó)Sigma 公司；甲醇、乙腈 德國(guó)Merck 公司（色譜純，含量≥99%）；YEPD 培養(yǎng)基 葡萄糖20 g/L、蛋白胨20 g/L、酵母抽提物10 g/L，固體添加15 g/L 瓊脂，實(shí)驗(yàn)室自制。

頂空固相微萃取（head space solid-phase microextractions，HS-SPME）操作平臺(tái)、磁力恒溫加熱攪拌器、57330-U 型SPME 手動(dòng)進(jìn)樣手柄、57348-U 型固相微萃取頭 美國(guó)Supelco 公司；GCMS 6890-5975B 氣相色譜-質(zhì)譜（gas chromatographymass spectrometry，GC-MS）聯(lián)用儀、HP-INNOWax Polyethylene Glycol（60 m×250 μm×0.25 μm）毛細(xì)管色譜柱 美國(guó)Angilent 公司；紫外可見(jiàn)分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；1.2 噸雙層不銹鋼發(fā)酵罐 昌黎縣金馬不銹鋼經(jīng)銷處；ALFA7 除梗破碎機(jī) 意大利Siprem 公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 種子的活化和培養(yǎng) 取出凍存菌株于YEPD固體培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)48 h，挑取單菌落接種50 mL 液體培養(yǎng)基，200 r/min 振蕩培養(yǎng)12 h，再以1%接種量轉(zhuǎn)接于1 L YEPD 液體培養(yǎng)基中靜置培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度均為30 ℃。接種前用血球計(jì)數(shù)板對(duì)種子液進(jìn)行酵母細(xì)胞計(jì)數(shù)，確定接種量。

1.2.2 酒精發(fā)酵 葡萄除梗破碎后以300 kg/罐的量分裝發(fā)酵罐中，添加果膠酶（20 mg/L）和SO2（60 mg/L），接種釀酒酵母并用泵打循環(huán)混勻。F15 和CC17 分別以2×106CFU/mL 的量接種進(jìn)行單菌株發(fā)酵；F15 和CC17 按1:1 比例共接種發(fā)酵，總接種量也為2×106CFU/mL。每日早、晚兩次打循環(huán)后取樣監(jiān)控發(fā)酵液的比重和溫度。當(dāng)比重不再下降時(shí)視為酒精發(fā)酵結(jié)束。每組有兩個(gè)平行發(fā)酵罐。

1.2.3 主要理化指標(biāo)測(cè)定 發(fā)酵過(guò)程中每12 h 使用比重計(jì)和溫度計(jì)測(cè)定發(fā)酵液的比重和料液溫度；每24 h 按GB/T 15038-2006 所述方法對(duì)發(fā)酵液的殘?zhí)恰⒁掖肌⒖偹岷蚿H 進(jìn)行監(jiān)測(cè)[23]；每48 h 對(duì)發(fā)酵液的色度、色調(diào)、花青素、單寧和總酚含量進(jìn)行測(cè)定。酒樣經(jīng)0.45 μm 濾膜過(guò)濾，用pH3.0 的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液稀釋10 倍后待用[24]。色度測(cè)定是將稀釋樣品倒入1 cm 比色皿中，在波長(zhǎng)420、520、620 nm下分別測(cè)定其吸光值，三者之和即為該樣品的色度[25]。色調(diào)為420 nm 與520 nm 吸光值之比[26]。花青素、單寧和總酚分別按亞硫酸脫色法、Folin-Denis比色法和Folin-Ciocalteu 比色法進(jìn)行測(cè)定[24-26]。

1.2.4 揮發(fā)性香氣物質(zhì)測(cè)定 利用HS-SPME 提取香氣物質(zhì)[7]。GC 條件為：手動(dòng)進(jìn)樣，不分流模式，40 ℃保持5 min，再以3 ℃/min 的速度升溫至200 ℃，保持2 min，氦氣載氣流速為1 mL/min[7]。MS 條件為：質(zhì)譜接口溫度為280 ℃，離子源溫度為230 ℃，電離方式EI，離子能量70 ev，質(zhì)量掃描范圍為20～350 u[7]。利用NIST 107 標(biāo)準(zhǔn)譜庫(kù)自動(dòng)檢索各組分質(zhì)譜數(shù)據(jù)，根據(jù)化合物結(jié)構(gòu)特征與NIST11s.lib 譜庫(kù)中標(biāo)準(zhǔn)化合物的圖譜進(jìn)行比較判別化合物類型。采用內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行定量分析[21]。

1.2.5 感官評(píng)價(jià) 感官評(píng)價(jià)參照文獻(xiàn)[21]進(jìn)行。感官評(píng)價(jià)室溫度在19±1 ℃，8 名感官評(píng)價(jià)員（4 男4 女）分別對(duì)葡萄酒樣品的顏色、香氣（花香、果香）、口感（酸感、酒體和收斂性）和滋味（典型性、協(xié)調(diào)性和復(fù)雜性）按8 個(gè)檔次1 至10 分（1～3 分，可排除；3～4 分，有缺陷；4～6 分，普通；6～7 分，良好；7～8 分，好；8～9，非常好；9～10，卓越）進(jìn)行隨機(jī)感官評(píng)價(jià)和打分。感官評(píng)價(jià)結(jié)束后收集打分卡結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

采用SPSS 16.0 軟件（SPSS Inc.,USA）對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 比重和溫度的變化

釀酒酵母酒精發(fā)酵致使葡萄汁比重持續(xù)下降，而溫度則先持續(xù)上升而后持續(xù)降低（圖1）。圖1 表明共發(fā)酵比重的變化曲線介于F15 和CC17 單菌株發(fā)酵之間。接種24 h 后，比重下降和溫度上升幅度加快，尤其是CC17。在前72 h，共發(fā)酵組比重下降與溫度上升趨勢(shì)與F15 相近，而與CC17 差異明顯；而72 h 后，共發(fā)酵組的比重和溫度變化曲線開(kāi)始介于F15 和CC17 之間，并逐漸靠近CC17。共發(fā)酵組和CC17 單發(fā)酵組在120 h 后比重停止下降，表明這兩組乙醇發(fā)酵結(jié)束；而F15 單發(fā)酵組比重直到144 h后才停止下降，其發(fā)酵結(jié)束的時(shí)間較CC17 和共發(fā)酵組晚24 h。三組發(fā)酵液最高溫度均達(dá)到23.5±0.2 ℃，CC17 發(fā)酵溫度峰值出現(xiàn)在60 h，比共發(fā)酵和F15 單發(fā)酵組早12 h。

圖1 酒精發(fā)酵過(guò)程中比重和溫度的變化Fig.1 Changes of specific gravity and temperature during fermentations

2.2 殘?zhí)呛鸵掖己康淖兓?/h3>

圖2 顯示酒精發(fā)酵過(guò)程中殘?zhí)呛砍掷m(xù)下降而乙醇含量持續(xù)增加。在24 h 至120 h 之間，對(duì)所有采樣節(jié)點(diǎn)殘?zhí)呛繙y(cè)定結(jié)果均為F15＞F15+CC17＞CC17，相反的乙醇含量均為F15＜F15+CC17＜CC17；發(fā)酵144 h 后所有組殘?zhí)窍陆岛鸵掖荚黾臃让黠@趨穩(wěn)；發(fā)酵168 h 之后三組發(fā)酵液中殘?zhí)呛烤抵?.0 g/L 以下，而乙醇含量均達(dá)到11%左右；192 h 后F15、F15+CC17 和CC17 三組葡萄酒中殘?zhí)呛糠謩e為2.7、2.5 和3.4 g/L，而乙醇含量分別達(dá)到11.06%、11.11%和11.23%。從圖2 可知，共發(fā)酵組殘?zhí)呛鸵掖甲兓€均介于F15 和CC17 單發(fā)酵之間，這表明采取共發(fā)酵模式酵母碳源利用速率以及主代謝產(chǎn)物乙醇積累速率介于兩種單菌株之間。

圖2 酒精發(fā)酵過(guò)程中殘?zhí)呛鸵掖己康淖兓疐ig.2 Changes of sugar and ethanol contents during fermentations

2.3 總酸和pH 的變化

葡萄汁中主要包括酒石酸、蘋果酸和檸檬酸，而經(jīng)過(guò)酵母菌代謝常使葡萄酒中積累琥珀酸和丙酮酸。酸的含量和組成對(duì)葡萄酒的pH、色度、酸度、口味平衡性及發(fā)酵過(guò)程中微生物的活力均有非常重要和直接的影響[1]。

從圖3 中可以看出，發(fā)酵48 h 后，F(xiàn)15 單發(fā)酵與CC17 單發(fā)酵和雙菌株共發(fā)酵中總酸含量差異顯著。酒精發(fā)酵24 h 后，三個(gè)發(fā)酵組總酸均略有增加。在前72 h，各組總酸含量均呈升高趨勢(shì)，但F15 單發(fā)酵組總酸增加幅度低于共發(fā)酵組和CC17 單發(fā)酵組，在72 h 時(shí)F15 單發(fā)酵組總酸含量達(dá)到最大（10.03 g/L）；在發(fā)酵至96 h 后CC17 單發(fā)酵組和共發(fā)酵組總酸也均達(dá)到峰值，此后略有下降但幅度不大，而F15 則開(kāi)始持續(xù)緩慢下降。共發(fā)酵組總酸的變化趨勢(shì)與CC17 基本一致，但在24 h 后共發(fā)酵組每個(gè)采樣節(jié)點(diǎn)的總酸均顯著低于CC17 單發(fā)酵組（P＜0.05）。192 h 時(shí)，F(xiàn)15、F15+CC17 和CC17三個(gè)發(fā)酵組總酸含量分別為9.11、11.31 和12.11 g/L。此前研究證明本土釀酒酵母CC17 和商業(yè)菌株F15在葡萄酒釀造過(guò)程中非揮發(fā)性有機(jī)酸的代謝框架區(qū)別明顯[21]，CC17 產(chǎn)琥珀酸較高是該菌株的特點(diǎn)之一[22]。上述數(shù)據(jù)表明混合發(fā)酵下調(diào)了CC17 單發(fā)酵時(shí)的產(chǎn)酸能力。

圖3 發(fā)酵過(guò)程中總酸的變化Fig.3 Changes of total acids during fermentations

發(fā)酵過(guò)程中pH 變化波動(dòng)較大（圖4），這與前人結(jié)論類似[5]。F15 單發(fā)酵組pH 在發(fā)酵的前24 h 無(wú)變化，48 h 升高至3.66，72 h 時(shí)又降至3.61，96 h 時(shí)又再次升高至3.66，隨后pH 緩慢上升至144 h 時(shí)最高的3.77，168 h 后又微降至3.72 并穩(wěn)定至192 h。CC17 單發(fā)酵組pH 變化情況與F15 不同，在前72 h其pH 呈緩慢下降趨勢(shì)（從0 h 的3.63 降至72 h 的3.58），96 h 時(shí)其pH 又回升至3.63，120 h 又微降至3.61，而 144 h 又增至3.66，168～192 h 穩(wěn)定在3.64。F15+CC17 共發(fā)酵pH 變化模式與CC17 相似，0～72 h 該組pH 從3.63 降至3.57，96 h 時(shí)陡增至3.66，120 h 又降至3.63，144 h 為3.67 并穩(wěn)定至192 h 實(shí)驗(yàn)結(jié)束。整個(gè)過(guò)程中，除24 和72 h 外，共發(fā)酵組pH 均值均處于F15 和CC17 兩組pH 之間，這應(yīng)該是雙菌株共發(fā)酵組總酸介于兩種釀酒酵母單菌株發(fā)酵之間引起的。而整個(gè)酒精發(fā)酵過(guò)程中pH 變化的波動(dòng)很有可能是不同時(shí)期菌株有機(jī)酸代謝產(chǎn)物差異造成的，具體原因需深入研究。

圖4 發(fā)酵過(guò)程中pH 的變化Fig.4 Changes of pH during fermentations

2.4 色度和色調(diào)的變化

色度監(jiān)測(cè)結(jié)果表明，在整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中F15 單發(fā)酵組和CC17 單發(fā)酵組存在差異，而共發(fā)酵組色度變化則與CC17 更為相似（圖5）。在發(fā)酵144 h 前三個(gè)發(fā)酵組色度均穩(wěn)定上升，F(xiàn)15 單菌株組、F15+CC17 共發(fā)酵組和CC17 單菌株組的色度分別為7.96、9.13 和9.56；但192 h 的測(cè)定結(jié)果顯示F15 單菌株組色度出現(xiàn)了明顯降低（7.82），而共發(fā)酵組與CC17 單發(fā)酵組色度值則分別繼續(xù)上升至9.57 和10.26。與葡萄汁相比，192 h 后F15 單發(fā)酵組、F15+CC17 共發(fā)酵組和CC17 單發(fā)酵組的色度分別提高了1.40、2.05 和2.11 倍。

圖5 發(fā)酵過(guò)程中色度的變化Fig.5 Changes of color intensity during fermentations

色調(diào)是檢測(cè)葡萄酒樣品色度時(shí)420 nm 波長(zhǎng)（黃色）與520 nm 波長(zhǎng)（紅色）測(cè)定值的比值，該值越高表明酒的色調(diào)越偏向黃色，越低酒的色調(diào)越偏向于紅色[26]。從感官評(píng)定的角度分析，消費(fèi)者更青睞偏向紅色調(diào)的酒[27]。圖6 結(jié)果顯示，以48 h 為時(shí)間節(jié)點(diǎn)，三組發(fā)酵葡萄汁色調(diào)變化均呈現(xiàn)先下降再緩慢上升的趨勢(shì)。這表明在48 h 后發(fā)酵葡萄汁的色調(diào)逐漸偏向黃色。48 h 后共發(fā)酵組色調(diào)均低于F15 和CC17 兩個(gè)單發(fā)酵組，而CC17 單發(fā)酵組則低于F15 單發(fā)酵組。這一結(jié)果表明，采用商業(yè)酵母F15 和野生酵母CC17 共發(fā)酵能夠使葡萄酒趨向紅色調(diào)。這可能是因?yàn)楣舶l(fā)酵組花青素含量較高[28]。

圖6 發(fā)酵過(guò)程中色調(diào)的變化Fig.6 Changes of color hue during fermentations

2.5 花青素、單寧和總酚含量的變化

不同的酵母菌株對(duì)葡萄皮中花青素的溶出率和葡萄酒中吡喃花青素的降解能力不同[28]。如圖7 所示，在發(fā)酵的前96 h 三組中花青素含量變化均不明顯，但144 h 后三組中花青素含量均出現(xiàn)明顯上升。發(fā)酵至192 h 時(shí)，花青素含量均值的高低順序分別為：F15+CC17 共發(fā)酵組（0.60 g/L）、F15 單發(fā)酵組（0.56 g/L）和CC17 單發(fā)酵組（0.53 g/L），統(tǒng)計(jì)結(jié)果看三者之間無(wú)顯著性差異（P＞0.05）。這在一定程度上解釋了為什么共發(fā)酵組色調(diào)偏向紅色的內(nèi)在原因。

圖7 發(fā)酵過(guò)程中花青素含量的變化Fig.7 Changes of anthocyanins contents during fermentations

葡萄酒中的單寧含量不僅與酒體、收斂性等感官屬性高度相關(guān)，而且在葡萄酒的釀造過(guò)程中對(duì)酒的顏色和口感起重要影響[26]。不同釀酒酵母菌株所釀酒中單寧含量存在差異，而這種差異會(huì)影響成酒的色度、色調(diào)和收斂性[29]。本研究結(jié)果（圖8）顯示，發(fā)酵至48 h，三組中單寧含量變化均不顯著且組間差異不大（P＞0.05）。發(fā)酵至96 h，F(xiàn)15 單發(fā)酵組單寧含量仍無(wú)明顯變化，而共發(fā)酵組和CC17 單發(fā)酵組單寧含量明顯增加，且后者增加幅度更明顯。發(fā)酵至144 h，三組單寧含量均出現(xiàn)大幅增加，按含量高低排序?yàn)镃C17組＞F15+CC17 組＞F15 組。至192 h 時(shí)，三組單寧含量均進(jìn)一步增加，高低次序仍為CC17 組＞F15+CC17 組＞F15 組，此時(shí)三組葡萄酒中單寧含量分別為2.13、1.92 和1.43 g/L，較0 h 相比分別增加3.18、2.95 和1.97 倍。

總酚含量變化趨勢(shì)與單寧基本一致，均隨時(shí)間延長(zhǎng)而增加（圖9）。初始0 h 時(shí)葡萄汁總酚含量均值為0.98 g/L。發(fā)酵至48 h，三組中總酚變化不大且組間差異不顯著（P＞0.05）。至96 h，F(xiàn)15 單發(fā)酵組總酚含量均值略有增加，而共發(fā)酵組和CC17 單發(fā)酵組總酚含量有不同程度增加，同樣CC17 組增加幅度更明顯。144 h 后，三個(gè)發(fā)酵組的總酚含量均出現(xiàn)明顯增加，按高低排序?yàn)镃C17 組＞F15+CC17 組＞F15 組。發(fā)酵至192 h，三個(gè)組總酚含量均略微增加，但高低次序仍為CC17 組＞F15+CC17 組＞F15組，此時(shí)三組葡萄酒中總酚含量分別為2.71、2.37 和2.05 g/L，與0 h 相比分別增加了2.77、2.42和2.09 倍。

圖9 發(fā)酵過(guò)程中總酚含量的變化Fig.9 Changes of total phenol contents during fermentations

2.6 發(fā)酵結(jié)束后主要香氣物質(zhì)分析

乙醇發(fā)酵結(jié)束后，利用HS-SPME GC-MS 對(duì)所有葡萄酒樣品進(jìn)行香氣物質(zhì)分析。表1 展示了對(duì)38 種香氣物質(zhì)的定量結(jié)果，其中包括20 種酯（乙醇酯9 種、乙酸酯6 種及其他酯類5 種）、12 種高級(jí)醇、4 種揮發(fā)性有機(jī)酸和2 種羰基化合物。

表1 發(fā)酵結(jié)束后葡萄酒中主要香氣物質(zhì)的含量Table 1 Aroma contents of wines after fermentations

除月桂酸乙酯外，共發(fā)酵組樣品中其他直鏈脂肪酸乙酯含量均略高于CC17 和F15 單菌株發(fā)酵。三組發(fā)酵中丁酸乙酯、己酸乙酯和總乙醇酯含量無(wú)顯著差異；F15 單發(fā)酵組和共發(fā)酵組辛酸乙酯含量顯著高于CC17；共發(fā)酵組壬酸乙酯、癸酸乙酯和3-羥基-丁酸乙酯的含量顯著高于單菌株發(fā)酵組，而9-癸烯酸乙酯的含量卻顯著低于單菌株發(fā)酵（P＜0.05）。共發(fā)酵組所有乙酸酯類物質(zhì)的含量均處于F15 和CC17 單菌株發(fā)酵組之間。但是從統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果看，共發(fā)酵組乙酸酯的組成框架與CC17 單發(fā)酵更為接近。共發(fā)酵組乙酸乙酯、乙酸己酯、乙酸異戊酯和總乙酸酯的含量與CC17 單發(fā)酵無(wú)差異，而與F15 單發(fā)酵差異顯著（P＜0.05）；乙酸辛酯、乙酸異丁酯和乙酸苯乙酯的含量則與CC17 和F15 均有顯著差異。F15 菌株總乙酸酯的產(chǎn)生能力（68972.3 μg/L）明顯高于共發(fā)酵（34630.6 μg/L）和CC17（31101.6 μg/L）。其他酯類中，共發(fā)酵組除己酸異戊酯和辛酸異丁酯的含量顯著高于CC17 外，其他組分之間并無(wú)明顯差異。

從表1 可以看到，共發(fā)酵組中庚醇、辛醇和癸醇的含量均介于F15 和CC17 單發(fā)酵之間且與單菌株發(fā)酵無(wú)明顯差異；而F15 單發(fā)酵組這三種直鏈脂肪醇含量顯著高于CC17。共發(fā)酵組中丁醇和異戊醇的含量顯著低于F15，卻與CC17 無(wú)差異。共發(fā)酵組甲硫基丙醇的含量與F15 無(wú)差異，但顯著高于CC17。異丁醇含量為F15 組＞F15+CC17 組＞CC17組，且兩兩之間差異顯著（P＜0.05）。其他幾種高級(jí)醇包括總高級(jí)醇的含量，三組樣品無(wú)顯著差異（P＞0.05）。

雙菌株共發(fā)酵與F15 單發(fā)酵相比乙酸含量顯著降低（P＜0.05），這一結(jié)果與此前研究不同[13]。但雙菌株共發(fā)酵產(chǎn)生的己酸和辛酸的量顯著高于F15，而與CC17 無(wú)顯著差異。共發(fā)酵組癸酸含量均值高于F15 和CC17 單發(fā)酵，但差異不顯著。共發(fā)酵組總揮發(fā)性有機(jī)酸含量顯著高于F15，而與CC17 差異不顯著（P＞0.05）。共發(fā)酵組2,6-二甲基-4-庚酮的含量顯著高于F15 和CC17。而另外一種羰基類化合物庚醛，共發(fā)酵組則顯著低于單發(fā)酵組（P＜0.05）。

2.7 感官評(píng)價(jià)結(jié)果

從圖10 可以看出三組葡萄酒感官特性具有差異。顏色評(píng)分結(jié)果，F(xiàn)15+CC17 雙菌株發(fā)酵組介于兩單菌株發(fā)酵之間。統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明，CC17 單發(fā)酵組與共發(fā)酵組顏色特性評(píng)價(jià)均為“卓越”，而F15 單發(fā)酵評(píng)價(jià)為“非常好”。這一結(jié)果與CC17 單發(fā)酵組和共發(fā)酵組色度較高相對(duì)應(yīng)。三組發(fā)酵果香和花香兩項(xiàng)香氣特性指標(biāo)均為“卓越”。果香評(píng)分均值F15+CC17＞CC17＞F15，這可能是共發(fā)酵組部分乙醇酯和揮發(fā)性有機(jī)酸含量較高造成的；花香評(píng)分F15＞F15+CC17＞CC17，這可能是F15 單發(fā)酵組乙酸酯含量較高引起的。口感特性有酒體、酸味和收斂性三項(xiàng)指標(biāo)。三組葡萄酒酒體的評(píng)價(jià)均為“非常好”且組間無(wú)明顯差異，均值比較結(jié)果為F15+CC17＞CC17＞F15，這可能是共發(fā)酵組和CC17 單發(fā)酵組總酸和單寧含量較高引起的。三組樣品酸味評(píng)分差異顯著（P＜0.05），CC17 單發(fā)酵組僅為“好”，而共發(fā)酵組和F15 單發(fā)酵組均為“非常好”。這也證明通過(guò)共發(fā)酵能夠有效改善CC17 菌株酒酸味較重的缺陷。對(duì)三組葡萄酒收斂性的評(píng)價(jià)結(jié)果均為“卓越”，但CC17 和共發(fā)酵組的評(píng)分高于F15，這可能是因?yàn)榍皟烧呖偡雍蛦螌幒枯^高。

圖10 葡萄酒感官評(píng)價(jià)得分Fig.10 Score plot for sensory evaluation of wines

對(duì)葡萄酒的整體評(píng)價(jià)有典型性、協(xié)調(diào)性和復(fù)雜性三項(xiàng)指標(biāo)。F15 所釀葡萄酒的典型性評(píng)分顯著低于CC17 單發(fā)酵和共發(fā)酵組（P＜0.05）。從圖10 上也可以看出，對(duì)CC17 單發(fā)酵組和共發(fā)酵組典型性這一感官特性的評(píng)價(jià)均為“卓越”，而F15 僅為“好”。協(xié)調(diào)性評(píng)分均值排序?yàn)镕15+CC17＞F15＞CC17，三組酒的協(xié)調(diào)性評(píng)價(jià)結(jié)果分別為“卓越”、“非常好”和“好”。而對(duì)復(fù)雜性的評(píng)分均值排序?yàn)镕15+CC17＞CC17＞F15，三組葡萄酒復(fù)雜性的評(píng)價(jià)結(jié)果分別為“卓越”、“非常好”和“非常好”。

3 結(jié)論

F15 和CC17 菌株釀造特性具有顯著差異。菌株CC17 較F15 起酵快、發(fā)酵能力強(qiáng)，所釀葡萄酒總酚、單寧含量高，顏色、收斂性和典型性明顯好于F15，但CC17 單發(fā)酵時(shí)酒中總酸較高，導(dǎo)致所釀酒口味較酸。商業(yè)酵母F15 所釀葡萄酒雖無(wú)明顯缺陷，但因總酚、單寧含量較低，典型性、復(fù)雜性和收斂性均顯著遜于CC17。采用F15+CC17 共接種發(fā)酵，葡萄汁比重和溫度變化模式在72 h 前與F15 相似，而72 h 后則與CC17 趨近；殘?zhí)恰⒁掖肌⒖偹帷H、單寧、總酚和色度的變化始終介于兩種單發(fā)酵監(jiān)測(cè)值之間。經(jīng)雙菌株共發(fā)酵后，葡萄酒的香氣輪廓也發(fā)生改變，某些酯類、高級(jí)醇、揮發(fā)性酸和羰基類化合物變化顯著。與F15 單發(fā)酵相比，共發(fā)酵能夠提高葡萄酒中單寧、總酚、部分揮發(fā)性香氣物質(zhì)含量和色度，提升葡萄酒顏色、酒體、收斂性和典型性等感官特性；與CC17 單發(fā)酵相比，共發(fā)酵能明顯降低總酸，提高pH，增加大部分香氣組分，改善了酒的酸味和協(xié)調(diào)性。此外，共發(fā)酵對(duì)葡萄酒的色調(diào)和香氣起到調(diào)諧作用，對(duì)葡萄酒整體的協(xié)調(diào)性和復(fù)雜性有顯著改善。本研究數(shù)據(jù)和分析為今后在生產(chǎn)實(shí)踐中開(kāi)展商業(yè)酵母和本土釀酒酵母菌株共接種發(fā)酵釀造葡萄酒工藝研究提供了參考。