茶樹CsLOG基因家族的鑒定和表達模式分析

田松群，姚新轉，張寶會，呂立堂,*

(1.貴州大學農業生物工程研究院/生命科學學院，山地植物資源保護與保護種質創新教育部重點實驗室/山地生態與農業生物工程協同創新中心，貴州 貴陽 550025；2.貴州大學茶學院，貴州 貴陽 550025)

茶樹是一種重要的經濟作物[1]，側枝上的芽葉是其主要的生產器官，豐富的葉芽數量是獲得高產量和高質量的關鍵因素[2]。茶樹的頂端優勢很明顯，抑制了側芽的生長，且茶樹生長發育受干旱、冷脅迫等環境影響，制約茶園生產發展[3]。

細胞分類素(CKs)在消除頂端優勢、促進腋芽生長和促進枝條生長發育中有重要作用[4]。LONELY GUY(LOG)是植物激素細胞分裂素(CK)激活酶，在植物的生長發育、響應環境脅迫中有重要作用[5,6]。研究表明，LOG酶指導莖節細胞分裂素的合成，促進腋芽生長[7]。植物細胞分裂素在植物中以具有生物活性的游離堿形式存在，如iP、tZ形式[8,9]，結合物則活性較低或無活性，充當儲存來源[10]。內源性細胞分裂素的合成酶有異戊烯基轉移酶(IPT)和特異性磷酸氫水解酶(LOG)[11]，IPT首先合成CKs初始產物異戊烯基腺苷和順式玉米素核苷-5-磷酸，轉化為沒有生理活性前體物質；LONELY GUY(LOG)是一種在細胞分裂素特異性磷酸酯水解酶反應中將N6位修飾的腺嘌呤AMP衍生物轉化為腺嘌呤游離堿(細胞分裂素)和5-磷酸核糖的酶[12]，從而把前體物質轉化為具有活性的細胞分裂素[13]。

目前，已鑒定9個擬南芥LOG基因、11個水稻LOG基因[14]，13個毛白楊LOG基因家族成員[8]。通過qRT-PCR對擬南芥莖、莖生葉等組織器官LOG表達情況分析，發現7個LOG基因在根和莖中表達，LOG8表達量最高[14]。基因功能研究表明，擬南芥LOG7抑制細胞分裂素的激活，影響莖尖分生組織的生長，LOG7、LOG3和LOG4則對初生根生長發揮作用；有研究表明：LOG多突變體使得芽和根系生長嚴重受阻，其具有維持根尖缺陷分生組織的作用[15]；Chickarmane等研究表明AtLOG4在頂端和花序分生組織的表皮層中表達，AtLOG7在結節原基中表達，表明LOG可能起到在分生組織中指導細胞分裂素合成作用[16]；在水稻中，LOG功能的缺失會迅速終止側生分生組織的產生[17]；紫花苜蓿MtLOG1、MtLOG2與根瘤原基發育和側根形成有關[18]；Filippo Moramarco等研究結果推測，BP1253新型LOG響應氧脅迫[19]。但目前對LOG響應生物及非生物脅迫的研究還很少。

茶樹生長受到干旱、低溫等多種逆境脅迫。關于茶樹LOG家族基因及其逆境相關的研究尚未報道。本試驗對茶樹LOG家族基因進行基因組鑒定，并用鑒定到的茶樹、擬南芥以及楊樹LOG基因構建進化樹，進一步對其基因結構和啟動子順式作用元件等生物信息進行分析，分析各組織及其逆境下的表達差異，為茶樹LOG家族基因及其抗逆響應中的功能研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 茶樹 LOG 家族基因的篩選與序列分析

從茶樹(http://tpia.teaplant.org/)和擬南芥(https://www.arabidopsis.org/)數據庫中獲取茶樹和擬南芥的全基因組數據、DNA、CDS、啟動子序列、染色體定位信息[14]。以擬南芥9個LOG基因蛋白序列作為種子序列在TPIA數據庫中進行BLASTP比對，篩選并獲得假定的茶樹LOG基因家族序列[11,14]。利用Pfam數據庫(http://pfam.janelia.org/)和NCBI保守域數據庫(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)將所有獲得的推定的茶樹LOG基因序列進行保守結構域的鑒定，剔除冗余序列，最終得到茶樹LOG基因。LOG基因的命名基于其與擬南芥基因同源度及染色體順序命名。用ExPASy Compute pl/Mw工具(http://web.expasy.org/compute_pi/)計算蛋白質的分子量(Mw)和等電點(pI)[20]。用PSORT工具(http://psort1.hgc.jp/form.html)植物來源預測蛋白質亞細胞定位。

1.2 系統進化樹和蛋白質保守基序分析

在MEGA-X軟件中，使用近鄰連接方法(Boostrap=1000)構建系統發育樹[13,14]。通過MEME(http://meme-suite.org/)進行保守結構域分析，motif數目設置為15個，motif寬度范圍設置為6～50氨基酸[21]。

1.3 染色體分布和啟動子順式作用元件分析

利用 HMM 3.0 軟件中的 perl 腳本從茶樹的基因組注釋信息中獲取CsLOG基因在染色體上的起始位置信息。在茶樹數據庫截取CsLOG基因上游2kb基因序列，并通過PlantCare(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)對順式作用元件進行分析[22]，最后利用 Tbtools 進行可視化。

1.4 表達模式分析

根據鑒定出的茶樹CsLOG基因的編號，在TPIA(http://tpia.teaplant.org)數據庫上下載它們在茶樹不同組織(包括頂芽、嫩葉、成熟葉、老葉、花、莖、根)、鹽脅迫、PEG誘導的干旱脅迫、茉莉酸甲酯處理和冷脅迫后的轉錄組數據(TPM值)，利用TopHat和Cufflinks進行轉錄組reads的全基因組映射(Mapping)，計算各個CsLOG基因的FPKM值歸一化處理并使用Office軟件制圖[23]。

2 結果與分析

2.1 茶樹LOG基因家族成員鑒定及理化性質預測

將比對的候選基因提交到SMART、Pfam、NCBI-CDD等在線網站進行保守結構域驗證，共鑒定到13個茶樹LOG基因，并根據基因在染色體的位置及其同源關系將其命名。進一步對茶樹LOG基因編碼的蛋白質進行理化性質分析(表1)，結果顯示：茶樹LOG蛋白平均含有210個氨基酸殘基，其中CsLOG2a最短，含有153個氨基酸殘基；相對分子量為17.1(CsLOG2a)～24.52(CsLOG6a)kD之間；理論等電點(pI)介于4.62(CsLOG1a)～8.38(CsLOG1b)之間，同時發現 pI<7的CsLOG蛋白達到 84.6%(11個)，表明大部分CsLOG蛋白富含酸性氨基酸。11個基因成員定位在細胞質和細胞核中，另外，LOG7a同時定位到細胞質和線粒體基質中，其余2個基因CsLOG5b和CsLOG5c定位到線粒體基質外，表明這3個基因可能在細胞中行使不同的功能。

表1 茶樹CsLOG基因家族基因的特征

2.2 茶樹LOG系統進化、基因結構和保守結構域分析

為明確茶樹LOG家族成員的分類，將擬南芥LOG基因和楊樹LOG基因的蛋白序列和茶樹CsLOG蛋白進行多序列比對并構建進化樹。結果發現茶樹CsLOG基因和擬南芥、楊樹同源性很高，表明LOG基因物種分化非常保守，蛋白序列的相似性表明這三個物種的LOG基因可能具有相似的生物學功能。根據擬南芥和楊樹的同源基因分類，將茶樹LOG家族分為兩個亞族(G1、G2)(圖 1)。CsLOG6a、CsLOG8a、CsLOG9a和擬南芥AtLOG8、AtLOG9為一簇(G1)，具有很高的同源性，其余基因成員為一簇(G2)。根據系統進化樹分析，LOG基因不僅在茶樹、擬南芥及楊樹中都存在，且同源性較高，表明LOG基因在物種分化過程中具有較高的保守性，進化時間也要早于茶樹、擬南芥和楊樹的分化時間。

圖1 茶樹，楊樹和擬南芥LOG基因家族的系統進化樹Fig.1 Phylogenetic tree of LOGs in tea, poplar and arabidopsis

為深入了解茶樹LOG家族基因的功能，利用茶樹LOG基因組DNA序列和CDS序列對其基因結構進行分析(圖 2)。利用MEME軟件對茶樹LOG家族基因的保守基序組成和數目進行分析，鑒定到7個比較保守的motif(motif 1～7)，另外每個基因都含有motif 1、motif 3、motif 4和motif 6。

圖2 茶樹LOG基因的系統進化(A)，保守功能結構域(B)，保守蛋白基序(C)和基因結構(D)Fig.2 Phylogenetic relationships (A), conserved functional domain(B), the conserved protein motif(C), and basic gene structure (D) of LOGs in tea

2.3 染色體定位和啟動子順式作用元件分析

根據茶樹基因組染色體注釋信息，將鑒定到的CsLOG基因進行染色體定位(圖3)。結果顯示，茶樹LOG基因未分布到7條染色體(1、2、5、6、7、8和15號)；2個CsLOG(CsLOG5b，CsLOG5c)基因不能定位到染色體上，其它11個CsLOG基因不均等地定位到不同染色體上，染色體最多含有3個LOG基因，為10號染色體，11號染色體含有2個，其余均僅含有1個CsLOG基因。說明CsLOG基因在染色體上并非均勻分布。

圖3 茶樹CsLOG基因在染色體上的定位Fig.3 Localization of CsLOGs in chromosome of tea plant

本研究利用茶樹LOG基因上游2000 bp的基因組序列，對CsLOG基因順式作用元件進行分析(圖4)。結果顯示，CsLOG啟動子中鑒定出含有多個與光相關的元件，如G-box、Box 4、MYB類和TGACG-motif等。同時，與激素響應相關元件的種類較多，如脫落酸(ABA)、茉莉酸甲酯(MeJA)，生長素(auxin)等。另外還預測到大量響應非生物脅迫的順式作用元件：干旱響應元件MBS，厭氧誘導ARE，低溫，鹽脅迫DRE元件，低溫響應元件LTR和防御和應激反應元件TC-rich repeats(圖4)，這些元件的存在表明LOG是植物反應的重要調控因子。CsLOG3a、CsLOG1a、CsLOG2a和CsLOG9a等中呈多個富集現象，如CsLOG5b有干旱響應元件兩個。對它們啟動子中所含的順式作用元件進行統計分析，可以看出，CsLOG中富含大量響應激素類及非生物脅迫等的作用元件，說明CsLOG與茶樹的生長發育及逆境脅迫響應密切相關。

圖4 CsLOG 基因的順式作用元件分析Fig.4 Prediction on cis-acting elements in CsLOGs注：low-temperature低溫脅迫；auxin生長素響應；anaerobic induction厭氧誘導；light responsive光響應；salicylie acid水楊酸響應；abscisic acid脫落酸響應；gibberellin赤霉素響應；MeJA茉莉酸甲酯響應；dehydration, low-temp, salt stresses脫水低溫鹽脅迫；defense and stress防御與應激脅迫；drought干旱誘導。

2.4 CsLOG基因在茶樹中的表達模式分析

為進一步明確CsLOG在茶樹中的組織表達特異性，我們從TPIA中下載它們在茶樹頂芽、嫩葉、成熟葉、老葉、根、莖、花和果等8個組織轉錄組TPM表達數據，并對它們進行分析。結果顯示(圖5)，CsLOG1(a/b/c)、CsLOG5a、CsLOG8a及CsLOG9a、在各個組織中表達較為顯著。在老葉中CsLOG1(a/b/c)表達高；嫩葉及成熟葉CsLOG5a表達量最高；頂芽CsLOG5a、CsLOG6a和CsLOG9a相對表達量高；花CsLOG(8a、9a)表達較顯著，莖中CsLOG(5a、9a)表達高。以上結果表明，LOG基因在芽、葉和花中表達差異明顯。CsLOG2a、CsLOG3a、CsLOG4a及CsLOG7a等4個基因具有花表達特異性，CsLOG5(b/c)、CsLOG3a、CsLOG4a、CsLOG2a及CsLOG7a在成熟葉中檢測不到表達。這說明不同的CsLOG基因可能在茶樹的不同組織部位發揮作用。

圖5 茶樹 CsLOG基因在頂芽、花、果、幼葉、成熟葉、老葉、根和莖表達模式Fig.5 Expressions of CsLOGs in apical buds, flowers, fruits, young leaves, mature leaves, old leaves, roots, and stems of tea plant

對CsLOG基因在干旱、鹽、冷及茉莉酸甲酯脅迫處理后的表達數據進行分析，結果顯示，在干旱脅迫下，與其他基因的表達水平相比，CsLOG5a、CsLOG8a和CsLOG9a的表達量較高，其中上調基因(CsLOG5a和CsLOG9a)，下調有CsLOG1(a/b/c)，CsLOG6a和CsLOG8a；CsLOG2a和CsLOG7a不受干旱脅迫處理的調控(圖6A)。

在鹽處理下，CsLOG5a、CsLOG9a基因的表達量在鹽脅迫中上調，CsLOG8a上調，在處理48h后下調，CsLOG1(a/b/c)、CsLOG6a個基因下調；CsLOG2a、CsLOG7a不受鹽脅迫的調控(圖6B)。

在冷處理下，CsLOG5a和CsLOG8a的表達量被誘導微下調再上調，CsLOG1(a/b/c)持續下調，CsLOG2a、CsLOG3a、CsLOG4a和CsLOG7a不受冷處理的調控(圖6C)。

在茉莉酸甲酯誘導下，7個基因CsLOG1(a/b/c)、CsLOG3a、CsLOG4a、CsLOG5a、CsLOG6a表達量被誘導上調，而CsLOG5b、CsLOG5c和CsLOG9a表達水平下調，其中CsLOG8a在處理24 h前被下調，48 h上調。同時發現CsLOG2a和CsLOG7a表達變化不受MeJA處理的調控(圖6D)。

圖6 CsLOG基因在不同脅迫處理的表達模式Fig.6 Expressions of CsLOGs under various stress treatments

3 討論與結論

LOG基因家族已在多個物種中被鑒定。其中，楊樹13個[8]，桃7個成員[8]，水稻有10個[12]，大白菜17個[13]，擬南芥9個[14]，紫花苜蓿有6個[18]，草莓9個基因成員[25]。本研究基于全基因組共鑒定出13個茶樹CsLOG基因。11個基因成員定位在細胞質和細胞核中，與擬南芥AtLOG定位結果一致[14,24]，LOG7a同時定位到細胞質和線粒體基質中，其余兩個基因CsLOG5b和CsLOG5c定位到線粒體基質外，說明這三個基因可能在細胞中行使不同的功能。基因結構和保守基序分析發現，除LOG2a保守基序所在位置靠近N端以及內含子數少外，LOG基因結構高度保守。motif1為MHxRKAxMxFxALPGGYGTxxEE是LOG保守結構域[14,22]，為LOG蛋白特征序列，決定LOG蛋白功能[26]。

本研究表達模式分析發現茶樹CsLOG基因表現組織特異性。CsLOG9a、CsLOG5a、CsLOG8a、CsLOG1(a/b/c)在各個組織中表達較高。相對于其他組織CsLOG6a頂芽中表達最高，具有明顯的組織特異性；嫩葉及成熟葉中CsLOG5a表達量最高；老葉終CsLOG1(a/b/c)表達最高；花中CsLOG8a和CsLOG9a表達最高。綜上表明，LOG基因在頂芽、葉和花表達較高，結果與擬南芥大部分基因在根和莖中表達有差異[14]，芽的生長會促進后期花的發育，茶樹LOG基因可能參與芽及葉的生長，而后促進茶樹花生成。研究表明，細胞分裂素激活酶LOG是植物芽及根尖分生組織活性的重要調節劑[16]。組織特異性分析結果表明，CsLOG5a、CsLOG6a分別在葉及芽中特異性表達可能參與茶樹葉芽的發育及調控作用。

茶樹CsLOG基因參與響應干旱、冷脅迫、鹽脅迫和茉莉酸甲酯脅迫響應等。研究證明LOG與環境脅迫響應相關，微生物中與LOG二型蛋白同源的結核分枝桿菌BpLOG酶與氧化應激負調控相關，BpLOG突變菌株對氧化應激敏感性低于野生型[19]。高等植物中，草莓FvLOG9個基因家族成員受干旱、高溫和高鹽脅迫調控，其中FtLOG1、FtLOG2、FtLOG5、FtLOG6和FtLOG9在各個組織中表達量均顯著高于其他基因[25]。CsLOG基因啟動子順式作用元件分析CsLOG基因含有多種光調控相關元件，與草莓LOG基因家族一致[25]，可以推測光照與茶樹細胞分類素的含量密切相關[27]；CsLOG5a和CsLOG9a含有低溫，防御與應激等非生物脅迫響應相關元件，在不同脅迫處理下，除低溫處理外CsLOG5a和CsLOG9a的相對表達量高。茶樹CsLOG基因不同脅迫的差異表達，推測CsLOG基因參與干旱、冷脅迫、鹽脅迫和茉莉酸甲酯脅迫響應。這些結果表明CsLOG廣泛參與茶樹的生長發育和非生物逆境脅迫響應。

生物化學研究明確LOG基因編碼細胞分裂素激活酶，植物研究表明LOG基因在植物芽發育中具有重要調節作用[15,16]，本研究基于茶樹基因組鑒定出13個CsLOG基因，并分析其生物信息學特征，表達模式分析顯示CsLOG5a，CsLOG6a可能參與茶樹葉芽發育，CsLOG5a、CsLOG9a在不同脅迫下相對表達量較高，它們可能在茶樹生長發育及逆境脅迫響應中發揮重要功能。然而茶樹LOG基因家族對激素及其逆境脅迫響應的具體機制尚不明確，需要進一步探究其原理。