基于ISSR和SRAP分子標記的22株雞腿菇遺傳多樣性和親緣關系分析*

高 傲，劉 宇，宋慶港，谷彤彤，廖燕玲，榮成博**

（1.北京市農林科學院植物保護環境保護研究所北京市食用菌工程技術研究中心，北京100097；2.百色學院農業與食品工程學院，廣西百色533000）

雞腿菇（Coprinus comatus） 學名毛頭鬼傘，屬于層菌綱 （Hymenomycetes） 傘菌目 （Agaricales） 鬼傘科 （Psathyrellaceae） 鬼傘屬 （Coprinus）[1]。雞腿菇子實體潔白、肉質細嫩可口、營養豐富，同時雞腿菇還具有較好的保健和藥用價值[2]。研究表明，雞腿菇具有抗氧化、降血糖、降血脂、防止肝損傷、抗腫瘤、提高免疫力、抑菌等功效，是一種藥食同源并極具開發前景的食用菌[3－6]。段懿涵等[4]研究發現，雞腿菇多糖對鏈脲佐菌素（STZ）誘導的糖尿病大鼠具有較好的抗氧化活性，可起到降血糖作用。秦楠等[6]研究表明雞腿菇菌絲發酵液具有抗枯草芽孢桿菌的能力，同時還具有抗氧化活性。崔旻等[7]研究發現，雞腿菇多糖可以增加T淋巴細胞數量，并對人肝癌細胞SMMC－7721的體外增殖有一定抑制作用。另外雞腿菇由于其外形獨特，在觀光采摘園區也備受青睞，因此雞腿菇是近年開發的較具商業潛力的珍稀菌品，被譽為“菌中新秀”。

鑒于雞腿菇在食用菌產業中具有重要潛力，該品種的育種也逐漸受到重視。食用菌種質資源是優良品種育種的基礎材料，育種成效除了取決于種質資源的數量，還很大程度取決于對種質資源多樣性的遺傳特性掌握。分子標記作為食用菌遺傳多樣性研究中的重要手段，其應用越來越廣泛[8]。

簡單重復序列間擴增（inter－simple sequence repeats，ISSR） 是Zietkiewicz等[9]于1994年創建的一種新型分子標記技術，根據基因組中廣泛存在的微衛星序列，設計通用引物對基因組DNA進行 PCR擴增，從而檢測基因組中微衛星序列的變異，該技術具有重復性高和穩定性好的優點，在食用菌中得到廣泛應用。相關序列擴增多態性（sequence related amplified polymorphism，SRAP） 技術通過對外顯子區域和內含子、啟動子區域進行特異性擴增，從而使個體間產生多態性，近年來廣泛應用在種群遺傳多樣性的分析中[10]。

由于不同的分子標記技術通過聚類分析產生的結果有所差異，因此本研究采用ISSR和SRAP兩種分子標記技術進行綜合運用以優化聚類分析結果，將收集到的22個雞腿菇樣本進行遺傳多樣性和親緣關系研究，為雞腿菇的鑒定、遺傳育種及分類提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗材料

本試驗所用雞腿菇菌株的名稱及相關信息見表1。

表1 雞腿菇樣本及其來源Tab.1 Coprinus comatus samples and sources

1.1.2 試驗試劑

葡萄糖、MgSO4購自國藥集團化學試劑有限公司；KH2PO4購自西隴科學股份有限公司；瓊脂粉、大豆蛋白胨購自北京奧博星生物技術有限責任公司；VB1購自天津市光復精細化工研究所；三氯甲烷購自北京化工廠；2X Taq PCR Master mix購自北京永澤浩嘉生物技術發展中心；瓊脂粉購自Life Technologies公司；試驗引物由中美泰和生物技術（北京）有限公司合成。

1.1.3 儀器

Bio－Rad S1000 PCR 儀、Bio－Rad ChemiDocTMMP紫外凝膠成像系統、北京六一DYY－III－12B電泳儀、奧豪斯FR224CN電子分析天平、Eppendorf 5430R臺式高速冷凍離心機等。

1.1.4 培養基

PDA綜合培養基（1 L）：馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、KH2PO43 g、MgSO41.5 g、瓊脂粉 20 g、大豆蛋白胨 5 g、VB110 mg，ddH2O 1 000 mL。

1.2 試驗方法

1.2.1 PCR 擴增

在PDA綜合培養基平板上活化22個雞腿菇菌種7 d～10 d，使用天根生化科技（北京） 有限公司植物DNA提取試劑盒（DP305） 進行DNA的提取。ISSR擴增體系以及擴增方法參照武海月等[8]的方法，ISSR－PCR 反應總體積 20 μL，體系為：10 μL2×Taq PCR Master mix，10 μL 的 ddH2O，引物為 1 μL，模板為1 μL。將反應液加入PCR管進行擴增，引物序列見表2。

表2 ISSR引物序列Tab.2 ISSR Primer sequence

ISSR-PCR程序設定：94℃預變性4 min，后94℃變性30 s，以低于引物退火溫度5℃復性45 s，72℃延伸 2 min，共 35個循環；72℃延伸 7 min，4℃保存。

SRAP-PCR擴增體系及擴增方法參照武海月等[8]方法，其中Me為正向引物，Em為反向引物，SRAP-PCR反應總體積20 μL，體系為：10 μL的2×Taq PCR Master mix，10 μL的 ddH2O，引物 F為 1 μL，引物R為1 μL，模板為1 μL。將反應液加入PCR管進行擴增，引物序列見表3。

表3 SRAP引物序列Tab.3 SRAP Primer sequence

SRAP-PCR程序設定：94℃預變性7 min，后94℃變性 1 min，35℃退火 1 min，72℃延伸 2 min，5個循環；后 94℃變性 1 min，50℃退火 1 min，72℃延伸 90 s，共38個循環；最后 72℃延伸 10 min，4℃保存。

使用1×Tris-乙酸（TAE） 配置的2%瓊脂糖凝膠，130 V瓊脂糖凝膠電泳約40 min，用紫外凝膠成像系統進行拍照。

1.2.2 數據統計及分析

將上述電泳圖中同一水平上的可見條帶標記為“1”，未擴增出條帶標記為“0”，用NTSYSpc 2.10軟件分析。

2 結果分析

2.1 ISSR引物擴增結果

以濃度一致的22株供試雞腿菇菌株的基因組DNA為模板，通過對不同引物的篩選最終選出24條ISSR引物在供試菌株上擴增效果良好，每個菌株均可擴增出多條DNA條帶，條帶清晰、穩定、重復性好。ISSR引物842對22個雞腿菇菌株的擴增結果見圖1。

由圖1所示，以引物842的擴增結果為例，不同的引物擴增條帶數不同，擴增出的DNA片段的分子量大多為200 bp～2 000 bp，包含了豐富的多態性信息。

圖1 引物842的22株雞腿菇菌株擴增結果Fig.1 The amplification results of 22 Coprinus comatus strains with primer 842

2.2 SRAP引物擴增結果

以濃度一致的22株供試雞腿菇菌株的基因組DNA為模板，通過對不同引物的篩選最終選出24對SRAP引物在目標菌株上擴增效果良好，每個菌株均可擴增出多條DNA條帶。引物Me1/Em4對22株雞腿菇菌株的擴增結果見圖2。

由圖2所示，篩選出的引物擴增出條帶為3條～13條，擴增出的DNA片段的分子量大多為200 bp～2 000 bp。

圖2 引物Me1/Em4的22株雞腿菇菌株擴增結果Fig.2 The amplification results of 22 Coprinus comatus strains by primer Me1/Em4

2.3 多態性分析

統計32個電泳圖的條帶，記錄為0或者1。根據統計結果計算出每種引物擴增出的條帶總數、每種DNA擴出的條帶數量、每種引物對應的多態性條帶數量、多態性條帶數量比例。24條ISSR引物和24對SRAP引物的多態性分析結果見表4、表5。

表4 24條ISSR引物的多態性表Tab.4 Polymorphism table of 24 ISSR primers

由表4、表5可知，24條ISSR引物共擴增出條帶219條，其中多態性條帶204條，多態性占比93.1%。24對SRAP引物共擴增出條帶149條，其中多態性條帶127條，多態性占比85.2%。24條ISSR引物和24對SRAP引物共擴增出368條DNA片段，其中多態性條帶有331條，多態性比例為50%～100%，說明22株雞腿菇遺傳多樣性比較豐富；不同引物擴增出每種DNA的條帶數量為2條～13條，擴增出的DNA片段的分子量大多為200 bp～2 000 bp，包含了豐富的多態性。

表5 24對SRAP引物的多態性表Tab.5 Polymorphism table of 24 pairs of SRAP primers

2.4 聚類分析結果

根據ISSR和SRAP的結果綜合進行聚類分析，結果見圖3。

圖3 22株雞腿菇菌株聚類分析圖Fig.3 Cluster analysis diagram on 22 Coprinus comatus strains

根據圖3聚類分析結果可知，在相似系數為0.8水平上，可將22株供試雞腿菇菌株分為4大類，表明22株供試雞腿菇菌株間具有較大的遺傳差異，第1 類 包 括 JZB2108001、 JB2108007、 JB2108009、JB2108003、 JB2108006、 JB2108010、 JB2108011、JB2108013、 JB2108014、 JB2108019、 JB2108005；第 2類包括 JB2108015、JB2108016、JB2108020、JB2108022、 JB2108025、 JB2108030、 JB2108028、JB2108029；第 3類包括 JB2108017；第 4類為JB2108012、JB2108023。而在0.97的相似系數水平上，除JB2108015和JB2108016兩個菌株未區分開外，其余20株菌株均可單獨分開。

2.5 主坐標分析

將條帶統計結果用NTSYSpc 2.10軟件進行主坐標分析，結果見圖4。

由圖4可知，通過對22株雞腿菇的相似系數矩陣進行中心化處理，主成分分析表明二維圖前2個主坐標分別解釋總遺傳變異的27.28%、15.15%，占總遺傳變異的42.43%。主坐標分析與聚類分析相一致，將22株雞腿菇分為了四類。

圖4 22株雞腿菇聚類散點圖Fig.4 Clustering scatter diagram on 22 Coprinus comatus strains

2.6 不同雞腿菇的遺傳相似系數和遺傳距離分析

22株雞腿菇樣本個體間的遺傳距離為0.030 0～0.850 3，平均值為 0.316 9。其中，JZB2108017 與JZB2108023之間遺傳遺傳距離最大為0.850 3，其次是JZB2108020與JZB2108023遺傳距離為0.826 9，而JZB2108015與JZB2108016遺傳距離最小為0.030 0，其次為 JZB2108007與 JZB2108009的遺傳距離為0.149 7。22雞腿菇樣本中個體間的遺傳相似系數為 0.149 7～0.970 0，平均值為 0.683 0。其中，JZB2018015與JZB2108016之間遺傳相似系 數最大為 0.970 0， 其次是 JZB2108007與JZB2108009遺傳相似系數為0.945 9，而JZB2108017與 JZB2108023遺傳相似系數最小為 0.149 7，其次為JZB2108023與JZB2108011遺傳相似系數為 0.155 6。

綜上所述，JZB2108015與JZB2108016親緣關系最近，JZB2108017與JZB2108023親緣關系最遠。

3 討論與結論

目前食用菌行業里菌種混亂，同種異名和同名異種現象嚴重，這極大地限制了食用菌行業的發展。傳統的鑒別主要是在子實體層面對子實體的顏色、大小、外形等形態特征及其生理生化特征、生長速度等進行鑒別，該方法耗費時間長，準確率較低，易受外界環境因素影響，只能鑒定屬內種水平[8]。

隨著分子生物學技術的飛速發展，已有多種分子標記方法被應用到食用菌的分類鑒定當中。朱靜嫻等[11]利用38對引物對23株大球蓋菇基因組DNA進行SRAP擴增分析，當遺傳相似系數為0.84時，23株大球蓋菇供試菌株被分為3個類群，多個地理位置相距較近的菌株在同一進化支上，表明遺傳相似性與其地理位置有一定的相關性。李紅等[12]利用9條引物對16個滑菇菌株基因組DNA進行ISSR擴增，在遺傳相似系數為0.69時，16個滑菇菌株被分成五大類。目前分子標記技術在其他食用菌方面已經廣泛運用，但在雞腿菇中報道較少。王守現等[13]利用SRAP技術對6個雞腿菇菌株進行了遺傳性分析，在遺傳相似系數為0.877 0的水平，可將6個菌株分成三類。由于不同的分子標記方法會有一定差異，因此將2種或多種分子標記方法結合使用會有效的減少差異，使結果更加準確而有說服力。

試驗利用ISSR和SRAP兩種分子標記技術，對22株不同來源雞腿菇樣本開展試驗。使用篩選出的24條ISSR引物和24對SRAP引物，以這22株雞腿菇樣本的基因組DNA為模板，共擴增出條帶368條，其中含有多態性條帶331條，多態性條帶占總條帶比為89.9%，說明22株雞腿菇樣本具有較為豐富的遺傳多樣性，可優化的菌株種類多，有利于進行雜交選育獲得優勢品種。

經聚類分析發現在相似度為0.80水平上，可將22株供試雞腿菇菌株分為四大類，表明22株供試雞腿菇菌株間具有較大的遺傳差異。其中JZB2108023與JZB2108025雖然均采集于北京海淀區鳳凰嶺，但是2種菌株并不屬于一類；JZB2108017號與JZB2108023遺傳相似系數為0.149 7親緣關系最遠，二者分別來自北京大興區和海淀區鳳凰嶺，由此可以說明北京地區尤其是鳳凰嶺具有較豐富的生物多樣性。JZB2018025與JZB2018030兩個菌株分別來自北京鳳凰嶺、新疆和田，2株菌株生長的地理位置及氣候條件相差甚大，但是經聚類分析，兩者在同一分支，親緣關系接近，說明雞腿菇有異地引種，相互交流菌株的情況出現。綜上，本研究明確了22株雞腿菇的遺傳多樣性和親緣關系，為雞腿菇的種質資源鑒定和分子育種提供了理論依據。