桑黃發(fā)酵培養(yǎng)不同時(shí)期菌絲體胞內(nèi)單糖組成比較*

王 皓，劉 迪，2**，陳功鑫，王 璐，尹鈺涵，滕成龍，郭建峰，王楚航

[1.延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院，吉林延吉133002；2.延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院食（藥）用真菌研究所，吉林延吉133002]

藥用真菌桑黃（Sanghuangporus spp.）是隸屬于銹革菌目 （Hymenochaetales） 銹革菌科 （Hymenochaetaceae） 的大型多孔菌[1]。桑黃生于桑樹(shù)、白樺樹(shù)、楊樹(shù)等樹(shù)種，其質(zhì)地較硬、背面黑褐色、腹面黃色或淡黃色，分布于我國(guó)華南、西北、華北及東北等地[1－3]。桑黃多糖作為一種天然活性物質(zhì)，具有來(lái)源廣泛、毒副作用極小的優(yōu)點(diǎn)，且具有抗癌、抗氧化、調(diào)節(jié)免疫、抑菌、降血糖等功效[4－6]，成為國(guó)內(nèi)外醫(yī)學(xué)、藥學(xué)、食品科學(xué)等研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)。雖然國(guó)內(nèi)對(duì)桑黃人工栽培的研究起步較晚[7－8]，但發(fā)展勢(shì)頭很好。

目前，我國(guó)對(duì)于桑黃藥理價(jià)值的研究有一定進(jìn)展，桑黃多糖提取、純化工藝已較為成熟[9-11]，且多用于抗癌領(lǐng)域，但由于桑黃種質(zhì)資源匱乏，人工栽培桑黃仍存在產(chǎn)量不穩(wěn)和栽培難度大等問(wèn)題[12]。

對(duì)于桑黃單糖，張艷杰、牟珍珍、葛青等[13-15]分別利用薄層色譜儀、氣相色譜儀、薄層色譜聯(lián)合氣相儀等儀器分析其子實(shí)體單糖組成；劉作喜、許謙、魏靜、韓霄雁等[16-19]分別利用薄層色譜儀、氣相色譜儀、示差或紫外檢測(cè)器的高效液相色譜儀、氣相質(zhì)譜聯(lián)用儀、核磁共振儀等儀器分析其菌絲單糖組成。

HPLC（高效液相色譜儀）是在多糖研究中應(yīng)用較多的一種方法[20]，具有成本低、分離效能高、操作簡(jiǎn)易、檢測(cè)靈敏、分析速度快，應(yīng)用范圍廣等特點(diǎn)[21]。目前利用蒸發(fā)光檢測(cè)器測(cè)量不同時(shí)期桑黃菌絲單糖組成的詳細(xì)報(bào)道較少，本次研究結(jié)果可為其他相關(guān)研究的學(xué)者提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

楊樹(shù)桑黃（Sanghuangporus vaninii）菌株（ST）由延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院食（藥）用真菌研究所提供，將菌株轉(zhuǎn)接到液體種子菌種培養(yǎng)基中，7 d后轉(zhuǎn)至發(fā)酵培養(yǎng)基培養(yǎng)，再將發(fā)酵培養(yǎng)基的菌絲分為1/2發(fā)酵時(shí)期Y1（7 d）菌絲以及完全發(fā)酵完成時(shí)期Y2（14 d）菌絲。

乙腈（色譜純）、甲醇（色譜純），賽孚瑞提供；D-葡萄糖、D-木糖、L-鼠李糖、D-果糖（標(biāo)準(zhǔn)品），由上海源葉科技有限公司提供；乙醇、正丁醇、氯仿、三氟乙酸（分析純），由天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司提供。

1.2 主要儀器與設(shè)備

GD-2-500型電熱鼓風(fēng)干燥箱，湖北黃石市醫(yī)療器械廠；HVA-85高壓滅菌器，株式會(huì)社平山制作所；JL102N型電子天平，上海精天電子儀器有限公司；HF-150A型數(shù)控電熱恒溫培養(yǎng)箱，金壇市恒豐儀器廠；ZHTY-70振蕩培養(yǎng)箱，上海知楚儀器；HDL-4自動(dòng)平衡離心機(jī)，上海鴻科有限公司；RE-52減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海青浦瀘西儀器廠；日立Primaide系統(tǒng)高效液相色譜儀及工作站；3300蒸發(fā)光檢測(cè)器，長(zhǎng)春埃文森科技有限公司；HH-6數(shù)顯恒溫水浴鍋，金壇市科析儀器有限公司；KQ2200DB型數(shù)控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司。

1.3 液體培養(yǎng)桑黃菌絲

液體種子培養(yǎng)基配方：玉米粉20 g·L-1、黃豆粉1 g·L-1、葡萄糖 20 g·L-1、KH2PO41 g·L-1、MgSO40.5 g·L-1。優(yōu)化培養(yǎng)條件：溫度28℃、裝液量100 mL、用打孔器取培養(yǎng)7 d的平板母種4塊接入三角瓶、初始pH 6.0、搖瓶轉(zhuǎn)速 190 r·min-1，發(fā)酵時(shí)間（發(fā)酵周期） 7 d。

發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化配方：葡萄糖15 g·L-1、玉米粉25 g·L-1、黃豆粉 0.5 g·L-1、麩皮 5 g·L-1、KH2PO42 g·L-1、MgSO40.5 g·L-1。優(yōu)化培養(yǎng)條件為：溫度28℃、裝液量150 mL、接種量30%、搖瓶轉(zhuǎn)速190 r·min-1，發(fā)酵時(shí)間 14 d。

1.4 桑黃菌絲樣品粗多糖提取及初步純化

1.4.1 水提法

試驗(yàn)稱(chēng)取桑黃菌粉10 g，進(jìn)行熱水提取，物料粒度為50目，設(shè)定浸提時(shí)間為2.5 h，浸提溫度為90℃，料液比為1∶30，濾掉濾渣，收集濾液。再次向?yàn)V渣中加入蒸餾水，同樣條件下再次提取，合并濾液，即為粗多糖提取液，共提取2次。

1.4.2 醇沉分級(jí)

將粗多糖提取液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至1/5體積，在粗多糖提取液中加入95%乙醇，使乙醇終濃度為80%，-4℃過(guò)夜，3 000 r·min-1離心20 min，棄上清液，取沉淀。

1.4.3 Sevag法脫蛋白

將醇沉沉淀物蒸干，用研缽磨成粉末，溶解于20 mL去離子水中，加入0.2倍體積的試劑（氯仿∶正丁醇為 4∶1），震蕩 3 000 r·min-1，離心 30 min 后試劑共分為3層，上層為水層，中層為蛋白層，下層為有機(jī)層；取上清液，向上清中再加入試劑，重復(fù)操作數(shù)次，直至水層同有機(jī)相之間沒(méi)有蛋白層為止。

1.4.4 水解

將上述得到的粗多糖溶液再次蒸干，取桑黃粗多糖粉末2 mg放入10 mL安瓿瓶中，加入2 mol·L-1的三氟乙酸3 mL，封管，在烘干箱110℃下水解3 h后，取安瓿瓶?jī)?nèi)溶液，加入3 mL甲醇減壓蒸干，重復(fù)多次，完全除去三氟乙酸，用去離子水定容至2 mL，用0.22 μL濾膜過(guò)濾后，待測(cè)。

1.5 高效液相色譜儀測(cè)量單糖含量變化

1.5.1 色譜條件的確定

通過(guò)對(duì)流動(dòng)相比例、柱溫、漂移管溫度、增益值、進(jìn)樣量的優(yōu)化，建立測(cè)定桑黃菌絲單糖條件。

1.5.2 標(biāo)準(zhǔn)品制備

將D-葡萄糖、D-木糖、L-鼠李糖、D-果糖分別精確稱(chēng)取20 mg，加去離子水1 mL，配制成20 mg·mL-1單標(biāo)溶液，將4種單標(biāo)溶液混合，成為4 mg·mL-1混標(biāo)溶液，用0.22 μm濾膜過(guò)濾后，待測(cè)。

1.5.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

將上述混標(biāo)溶液加入不同劑量去離子水，依次稀釋成 3.0 mg·mL-1、2.5 mg·mL-1、2.0 mg·mL-1、1.5 mg·mL-1、1.0 mg·mL-1、0.5 mg·mL-1、0.2 mg·mL-1的混標(biāo)溶液，用0.22 μm濾膜過(guò)濾后，待測(cè)。

1.5.4 重復(fù)性試驗(yàn)

將Y1（培養(yǎng)7 d） 和Y2（培養(yǎng)14 d） 樣品各連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定6次，計(jì)算相對(duì)偏差值（RSD1、RSD2）。

1.5.5 精密度試驗(yàn)

將不同濃度混標(biāo)溶液分別重復(fù)上樣6次，計(jì)算相對(duì)偏差值（RSD3）。

1.5.6 回收率試驗(yàn)

精確稱(chēng)取同一濃度樣品6份，將不同質(zhì)量濃度的混標(biāo)溶液向2個(gè)樣品中加入0.3 mL，與各待測(cè)液混合后，用0.22 μm濾膜過(guò)濾，平行測(cè)定6次，根據(jù)加入標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度與檢出質(zhì)量濃度計(jì)算回收率，以及回收率相對(duì)偏差（RSD4）。

1.5.7 數(shù)據(jù)分析

各單糖組分含量（mg·g-1）通過(guò)樣品峰面積帶入相應(yīng)回歸方程中計(jì)算。所有試驗(yàn)均為3次生物學(xué)重復(fù)。采用Excel 2013處理原始數(shù)據(jù)并用于平均值、相對(duì)偏差的計(jì)算。采用SPSS對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行配對(duì)T檢驗(yàn)，分析數(shù)據(jù)間的顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 桑黃菌絲發(fā)酵情況

桑黃液體種子及不同時(shí)期桑黃菌絲發(fā)酵情況見(jiàn)圖1。

圖1 不同時(shí)期菌絲圖Fig.1 Mycelium in different periods

由圖1所示，a為液體種子。b為培養(yǎng)7 d的桑黃菌絲（Y1期），發(fā)酵液呈淡黃色或白色。c為培養(yǎng)14 d的桑黃菌絲（Y2期），發(fā)酵更為完全，發(fā)酵液呈啤酒色。

2.2 桑黃菌絲單糖的HPLC分析

2.2.1 柱溫的確定

在流動(dòng)相為乙腈和水 （90∶10）、流速 1.0 mL·min-1、增益值1、進(jìn)樣量10 μL、漂移管溫度80℃的一致條件下，設(shè)置柱溫為30℃、35℃、50℃，不同柱溫的混標(biāo)色譜圖見(jiàn)圖2。

圖2 不同柱溫的混標(biāo)色譜圖Fig.2 Mixed standard chromatogram of different column temperatures

由圖2可知，3種柱溫條件下桑黃菌絲單糖分離度均較好，柱溫溫度的變化對(duì)木糖和鼠李糖的響應(yīng)值影響較大。隨著柱溫升高，單糖峰面積會(huì)隨之升高，但到了50℃，除果糖之外的其他3種單糖的峰面積則顯著變小。綜合對(duì)4種單糖的影響情況，選擇柱溫為35℃。

2.2.2 流動(dòng)相比例的確定

在柱溫35℃、流速1.0 mL·min-1、增益值1、進(jìn)樣量10 μL、漂移管溫度80℃的條件下，設(shè)置乙腈和水體積比為 85∶15、90∶10、95∶5。不同體積比乙腈和水的混標(biāo)色譜圖見(jiàn)圖3。

圖3 乙腈和水不同體積比的混標(biāo)色譜圖Fig.3 Mixed standard chromatogram of acetonitrile and water with different volume ratio

由圖3可知，乙腈比例越大，桑黃單糖的分離度越高。隨著乙腈比例的增大，分離時(shí)間由20 min增長(zhǎng)為50 min，且個(gè)別峰面積也會(huì)變小，綜合考慮，選擇乙腈和水體積比為90∶10。

2.2.3 進(jìn)樣量的確定

在乙腈和水體積比90∶10、柱溫35℃、流速1.0 mL·min-1、增益值1、漂移管溫度80℃的條件下，設(shè)置樣品進(jìn)樣量為 5 μL、10 μL 和 20 μL，不同進(jìn)樣量的混標(biāo)色譜圖見(jiàn)圖4。

圖4 不同進(jìn)樣量的混標(biāo)色譜圖Fig.4 Mixed standard chromatogram of different injection quantity

由圖4可知出，進(jìn)樣量為20 μL時(shí)出現(xiàn)了平峰，將10 μL與5 μL相比，雜峰更小，峰面積分離更好且穩(wěn)定。考慮出圖效果，選擇進(jìn)樣量為10 μL。

2.2.4 ELSD參數(shù)的確定

在流動(dòng)相乙腈和水的體積比90∶10、流速1 mL·min-1、柱溫35℃、進(jìn)樣量10 μL、漂移管溫度80℃的條件下，對(duì)增益值1和增益值2進(jìn)行比較，不同增益值的混標(biāo)色譜圖見(jiàn)圖5。

從圖5可以看出增益為1時(shí)，鼠李糖與木糖峰偏低，考慮到出圖效果，故上述最佳條件確定后對(duì)漂移管溫度進(jìn)行考查，選擇增益值為2。上述最佳條件確定后對(duì)漂移管溫度進(jìn)行考查，60℃和80℃漂移管溫度的比較見(jiàn)圖6。

圖5 不同增益值的混標(biāo)色譜圖Fig.5 mixed standard chromatogram of different gain values

由圖6可知，漂移管溫度為60℃時(shí)，單糖的分離度不夠，使得糖的響應(yīng)值變低，而80℃時(shí)，相鄰峰之間分離度效果較好，綜合考慮，選擇漂移管溫度為80℃。

圖6 不同漂移管的混標(biāo)色譜圖Fig.6 Mixed standard chromatogram of different drift tubes

因此，色譜條件選擇氨基柱（安捷倫）；蒸發(fā)光散射檢測(cè)器（ELSD）；流動(dòng)相乙腈和水體積比90∶10、柱溫35℃、進(jìn)樣量10 μL、增益值2、漂移管溫度80℃；氮?dú)饬魉?1.0 mL·min-1；壓力 2.0×105Pa。

2.2.5 不同時(shí)期桑黃菌絲單糖定性分析

將不同濃度鼠李糖、木糖、果糖、葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品的混標(biāo)溶液，以及2個(gè)時(shí)期樣品，按照色譜條件進(jìn)樣后，色譜圖見(jiàn)圖7，含量及組成見(jiàn)圖8。

圖7 標(biāo)準(zhǔn)品和樣品色譜圖Fig.7 Chromatogram of standards and samples

圖8 單糖組成及含量圖Fig.8 Composition and content of monosaccharides

由圖7可知，桑黃菌絲主要含有鼠李糖、木糖、果糖、葡萄糖，可能還含有半乳糖，但由于含量過(guò)低，本次試驗(yàn)忽略。由圖8可知，Y1期與Y2期4種可溶性糖含量變化趨勢(shì)一致，均為葡萄糖＞果糖＞木糖＞鼠李糖。經(jīng)計(jì)算，Y1期總糖含量為 22.501 2 mg·g－1，Y2 期總糖含量為 26.817 8 mg·g－1。

2.3 HPLC方法的可行性

2.3.1 線性回歸方程、重復(fù)性、精密度

桑黃單糖組分的線性回歸方程及重復(fù)性和精密度變化見(jiàn)表1。

表1 單糖組分的線性回歸方程及重復(fù)性和精密度Tab.1 Linear regression equation,repeatability and precision of monosaccharide components

由表1可以看出，根據(jù)不同濃度梯度的混標(biāo)溶液出峰情況，各可溶性糖組分的線性相關(guān)系數(shù)為0.993 8～0.999 1，表明峰面積與單糖含量線性關(guān)系良好。RSD1在 1.08%～2.05%，RSD3在 0.66%～1.69%，RSD3在 0.41%～2.49%，符合試驗(yàn)測(cè)定要求。

2.3.2 回收率試驗(yàn)

回收率試驗(yàn)對(duì)結(jié)果的準(zhǔn)確性有重要意義，桑黃單糖組分回收率測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 糖組分回收率的測(cè)定結(jié)果Tab.2 Recoveries of sugar determination

由表2可知，Y1期各糖的回收率在94%～106%，Y2期各單糖的回收率在90%～103%，兩者回收率水平相當(dāng)，表明方法準(zhǔn)確率高，符合標(biāo)準(zhǔn)，結(jié)果可信度高。

3 討論

羅建光、竇茜茜、徐雙陽(yáng)等[22－24]研究發(fā)現(xiàn)桑黃菌絲單糖主要成分是葡萄糖，這與本次結(jié)果一致。而Kim等[25]發(fā)現(xiàn)桑黃菌絲水溶性多糖主要由葡萄糖、甘露糖、鼠李糖、半乳糖、樹(shù)膠醛糖和木糖組成，且以甘露糖為主。桑黃菌絲單糖種類(lèi)及構(gòu)成多糖主要組分的不同，可能是由于不同地區(qū)不同品種桑黃的成分有所差別。Y2期菌絲總糖明顯高于Y1期，可能是由于葡萄糖含量在第二時(shí)期顯著增多引起，果糖含量的增加也有一定影響。宋吉玲等[26]對(duì)3種桑黃菌種進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)發(fā)酵時(shí)期為15 d時(shí)，多糖含量均最高。而方白玉、駱冬青[27-28]研究發(fā)現(xiàn)，桑黃菌絲多糖產(chǎn)量最高是在發(fā)酵期為7 d時(shí)，這可能是由于不同菌株需要不同的發(fā)酵時(shí)間才能達(dá)到該菌株最高的多糖產(chǎn)量。因此，初步考慮是由于在同一培養(yǎng)條件下的同一批桑黃菌絲，其發(fā)酵培養(yǎng)時(shí)間的長(zhǎng)短會(huì)影響桑黃菌絲多糖分泌，從而影響多糖產(chǎn)量。王偉科等[29]將桑黃菌絲體和子實(shí)體進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析，發(fā)現(xiàn)子實(shí)體對(duì)比菌絲體呈現(xiàn)上升表達(dá)的基因有β-葡萄糖苷酶等可合成葡萄糖的酶。

因此，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，菌絲內(nèi)部糖代謝途徑發(fā)生次數(shù)的增加可能導(dǎo)致多糖含量的積累，但其具體原因有待進(jìn)一步研究。今后可以深入探討研究桑黃生長(zhǎng)發(fā)育機(jī)理，這樣既有助于選育高產(chǎn)及高活性成分的桑黃新品種，又為桑黃栽培技術(shù)研究提供理論指導(dǎo)。

目前，很少有人將不同時(shí)期菌絲的多糖含量進(jìn)行對(duì)比，本試驗(yàn)證明不同時(shí)期菌絲的多糖含量具有差異性，為保證多糖產(chǎn)量，可以考慮篩選最適發(fā)酵時(shí)間。如今真菌多糖由于其藥理價(jià)值越來(lái)越被重視，利用更短的時(shí)間生產(chǎn)更多的多糖將成為之后發(fā)展的重點(diǎn)。而對(duì)于不同時(shí)期桑黃菌絲單糖組成及含量的變化研究，可以為研究多糖代謝途徑、發(fā)現(xiàn)并克隆能夠調(diào)控多糖合成的基因提供理論依據(jù)。不同的單糖具有不同的藥理價(jià)值，通過(guò)試驗(yàn)設(shè)計(jì)提高某一單糖產(chǎn)量還有待學(xué)者進(jìn)一步挖掘研究。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)將液體培養(yǎng)桑黃菌絲分為1/2發(fā)酵期（Y1期） 和完全發(fā)酵期（Y2期），通過(guò)熱水浸提法提取粗多糖溶液，并對(duì)其進(jìn)行初步純化。水解成單糖后，利用高效液相色譜儀上樣測(cè)定，桑黃菌絲主要含有鼠李糖、木糖、果糖以及葡萄糖4種單糖，4組單糖組分的含量Y2期均高于Y1期。通過(guò)對(duì)樣品中的可溶性含量進(jìn)行分析計(jì)算，鼠李糖含量由Y1期的 3.688 6 mg·g-1上升到 Y2 期的 3.920 9 mg·g-1，木糖含量由 Y1 期的 4.027 1 mg·g-1上升到 4.614 5 mg·g-1，果糖含量由Y1期的6.003 2 mg·g-1上升到Y(jié)2期的6.883 8 mg·g-1，葡萄糖含量由 Y1 期的 8.782 3 mg·g-1上升到Y(jié)2期的11.399 1 mg·g-1，桑黃菌絲多糖主要以葡萄糖為主，且2個(gè)時(shí)期菌絲差異最大的也是葡萄糖，其次為果糖。經(jīng)過(guò)計(jì)算，Y1期總糖含量為22.501 2 mg·g-1，Y2 期總糖含量為 26.817 8 mg·g-1，Y2期總糖含量顯著高于Y1期。