利用玉米秸稈栽培香菇的品質及重金屬元素安全評價*

劉柱杉，徐 帥，孫曉仲，李 玉**，宋 冰

（1.吉林農業大學，食藥用菌教育部工程研究中心，吉林 長春 130118；2.吉林省質量檢測研究院，吉林 長春 130118）

香菇[Lentinula edodes（Berk.）Pegler]屬于擔子菌門 （Basidiomycota） 蘑菇亞門 （Agaricomycotina） 蘑菇綱 （Agaricomycetes） 蘑菇亞綱 （Agaricomcetidae） 蘑菇目 （Agaricales） 類臍菇科 （Omphalotaceae） 微香菇屬 （Lentinula）[1]。香菇在中國的栽培歷史悠久，最早可以追溯到南宋時期吳三公的“砍花法”[2]。香菇子實體的蛋白質含量高于水果蔬菜，且與肉類相當，可以為人體提供優質的健康蛋白質，且含有多種人體必需的氨基酸。香菇子實體含有的飽和脂肪酸含量遠遠低于非飽和脂肪酸的含量，且脂質含量較低，屬于天然的低卡路里食品[3]。另外香菇中麥角甾醇的含量豐富，麥角甾醇是維生素D的前體，可以在人體中促進鈣吸收，有效預防人體佝僂病。香菇子實體中含有大量的維生素B12，是唯一含有金屬元素的特殊維生素，人體不能合成。香菇含有的多糖和萜類物質可以增強人體免疫力，在臨床中用于治療腫瘤疾病[4]。因此，香菇逐漸成為一種重要的食藥同源菌類產品[5]。

根據中國食用菌協會統計[6]，我國香菇產量從2010年的400萬噸增長到2018年的1 000萬噸，成為我國第一大食用菌栽培品種，香菇主要是利用椴木和木屑作為栽培基質進行栽培生產，但近年來，我國修訂實施了森林資源利用的控制法規，香菇栽培基質的來源受到限制[7]。

通過香菇菌絲生長、利用農業廢棄物中的木質纖維素材料獲得高質量的副產品，非常適合作為綠色生態農業中的重要環節，這種栽培方法解決了香菇栽培基質的來源問題。在全世界范圍內栽培基質替換是香菇栽培的研究重點，但基質對香菇子實體的營養成分影響還未知，缺乏利用不同農林廢棄物種植秸稈的食品評價研究。Leifa等[8]在圍繞熱水預處理咖啡渣栽培香菇對其子實體營養特征的影響，發現使用熱水預處理咖啡渣會增加香菇子實體中蛋白質含量；Li等調查了在不同基質中添加甘蔗渣對香菇子實體風味的影響[9-10]，發現基質中的碳氮比能夠顯著影響香菇生長。之前的研究中已證明不同配方間的玉米芯與玉米秸稈粉含量能影響香菇子實體質量構成和營養成分[11]，利用農業廢棄物栽培香菇能夠顯著改善子實體營養特征。

香菇是藥食同源的食用菌，在基質中添加玉米秸稈是否會改變子實體的營養性質從而增加其與傳統栽培方式香菇的競爭力；玉米秸稈的混合添加是否會改變其子實體形態建成過程是迫切需要研究的問題。在玉米農業生產中除草劑、肥料等化學藥劑的使用會使玉米秸稈富集有害金屬元素，使用該類玉米秸稈栽培香菇的安全性評價同樣需要深入探究。通過利用玉米秸稈與玉米芯混合添加栽培中國南方地區（浙江、福建和湖北等）的香菇菌株，探討其廣泛適應性并提出了更加高效科學的配方篩選數學模型，對香菇子實體質量構成及營養成分進行測定，用于評價玉米秸稈栽培香菇的重金屬含量安全性，為玉米秸稈栽培香菇技術的廣泛推廣提供技術支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

供試菌株為香菇GW（吉林農業大學食藥用菌教育部工程研究中心，CCMJ2941）；玉米秸稈和玉米芯來自吉林農業大學玉米試驗田；木屑由延吉德康生物有限公司提供。香菇菌株母種保存在PDA培養基中（新鮮馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、蛋白胨3 g、酵母浸粉2 g、瓊脂20 g，蒸餾水定容至1 000 mL）[12]，栽培菌種保存于由木屑78%、麥麩20%、石膏1%和石灰1%制成的菌包中（菌包重750 g，含水量55%）。試驗中使用的聚乙烯內套袋（15 cm×55 cm×0.05 cm） 和聚丙烯外套袋（17 cm×55 cm×0.03 cm）由延吉德康生物有限公司提供。

1.2 儀器與設備

Spectra Max i3酶標儀，美國伯樂生物器材技術有限責任公司；KjeltecTM8000 FOSS Hilleroed凱式定氮儀，丹麥福斯有限責任公司；2050型FOSS Hilleroed自動脂肪分析儀，丹麥福斯有限責任公司；T6型可見分光光度計，中國北京普析通用儀器有限責任公司；7700×icp-ms型電感耦合等離子體質譜儀，美國安捷倫科技有限責任公司；日立L8900型氨基酸分析儀，日本日立有限責任公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 配方設計

配方模型設置遵循如下規則：0≤玉米芯+玉米秸稈粉≤50.00%，10.00%≤玉米芯≤40.00%，10.00%≤玉米秸稈粉≤40.00%，30.00%≤木屑≤60.00%，玉米芯+玉米秸稈粉+木屑為80.00%，麥麩為18.00%，石膏為1.00%，石灰+白糖為1.00%。滅菌后從各個配方中取500 g基質，在智能干燥箱中65℃烘干至樣品恒重后測量基質碳氮比，碳氮比測量試驗于吉林省質量檢測研究院完成。使用單純型格子法對混合秸稈配方進行設計，配方見表1。

表1 配方成分及碳氮比Tab.1 Cultivation materials of Lentinula edodes and C/N ratio

1.3.2 栽培方法及酶學活性調查

依照栽培配方表將特定比例的干燥原料與水混合，且保持含水量在55.00%～60.00%，pH自然。將濕重為2 000 g的基質裝入聚乙烯菌袋后121℃度高壓環境下滅菌3 h。根據中國農業部頒布的NY/T 1061-2006香菇等級標準[10]，采收開傘度小于6分的鮮香菇子實體（菌蓋卷邊的內邊緣直徑與菌蓋直徑的比值，開傘度以“分”表示，比值為1時，即菌蓋平展時的開傘度為10分），記錄產量并計算生物效率 （BE，%）[13]。

式中：W為收獲香菇子實體后鮮菇的重量（g）；S為基質干物質重量（g）。

在香菇菌絲透壁后使用劃線法測定菌絲生長速率，每12小時劃線1次。菌絲滿袋后取每24小時的菌絲平均生長速率 （GR，cm·d-1）[14]。

式中：L表示每24小時香菇菌絲生長的長度（cm）。

在菌絲滿袋期（60 d），轉色完成期間（90 d）和出菇期（100 d）測量羧甲基纖維素酶、漆酶和酸性木聚糖酶的酶活性。樣品在液氮中快速冷凍并保存在-80℃下待測；測量酶活性時，基質在4℃下解凍，在冰浴中快速粉碎后于 6 000 r·min-1、4℃離心10 min，取上清液待測。根據蒽酮比色法測定纖維素酶活性，漆酶活性通過ABTS（2，2’-聯氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）自由基增加速率法測定[15]，酸性木聚糖酶在酸性條件下會將木聚糖還原為單糖，DNS（3,5-二硝基水楊酸） 與單糖在水溶液中的顯色反應可用于計算酸性木聚糖酶活性，3種酶的活性測定均使用商業測試試劑盒（中國蘇州科銘生物科技有限公司）[16]。

1.3.3 干香菇營養成分檢測

在50℃智能恒溫培養箱內將采集到的新鮮子實體烘干至恒重，將其粉碎后于4℃保存待用。采用凱氏定氮法測定蛋白質含量[17]；采用索氏提取系統分析脂肪；總糖使用瓦特和美林法[18]。用電感耦合等離子體質譜儀測定香菇子實體中8種微量元素和4種有害金屬元素含量[19]。用氨基酸分析儀于吉林省質量檢驗所分析了干燥子實體粉中的氨基酸組成。

1.4 數據統計與分析

采用 Miccrosoft Excel 2013和DPS 9.50進行數據處理與Duncan’s法單因素分析。每組試驗重復3次，所得結果以（±s） 的形式表示。

2 結果與分析

2.1 不同配方間菌絲生長速率和產量的回歸分析

不同配方香菇菌絲生長速率和產量回歸分析結果見表2。

表2 菌絲生長速率和產量回歸分析Tab.2 Model analysis on mycelial growth rate and yield

由表2所示，不同配方間菌絲生長速率的F值為3.18，說明模型顯著。模型只有4.67%的幾率是由誤差造成的，R2=0.57，菌絲生長速率Y=0.28A+0.24B+0.33C+0.13AB+0.13A C－0.031BC。產量模型的 F值為8.54，模型只有0.12%的幾率是由誤差造成的，R2=0.78， 單 棒 重 y=474.44A+492.11B+476.66C －209.67AB+361.99AC－12.43BC。玉米秸稈粉與木屑的混合添加不利于菌絲生長速率和產量的形成因素，在產量結果中玉米芯在混合栽培料中的混合比例占主要比重時對產量影響小，玉米秸稈粉不利于產量形成。

在優化配方的參數設定內，把玉米芯（A）的目標值設定在10%～40%，玉米秸稈粉（B） 10%～40%，木屑（C） 30%～60%，菌絲生長速率的目標為0.28 cm·d－1～0.38 cm·d－1，單棒重目標設定最大值。模型篩選出的配方如下：配方Ⅰ：玉米芯25%、玉米秸稈粉10%、木屑45%（預測單棒重550.02 g，生長速率0.31 cm·d－1，準確度 92.40%）；配方Ⅱ：玉米芯 25%、玉米秸稈粉20%、木屑35%（預測單棒重478.90 g，生長速率 0.30 cm·d－1，準確度 47.50%）。基質中木屑含量與菌絲生長速率的關聯系數最高且成正相關，配方的單型格子法篩選結果表明，過量的玉米秸稈粉不適宜混合在基質中栽培香菇，而玉米芯可以與木屑混合作為栽培香菇的基質主料。

2.2 混合基質對香菇子實體農藝形狀的影響

通過比較不同配方的農藝性狀，觀察不同配方間香菇子實體形態特征以獲得不同配方對子實體農藝性狀的影響，探究一種或多種添加基質對子實體形態的影響[20]。各配方的農藝性狀平均值為采集三潮菇后的平均統計數值。其中，一等菇的菌蓋直徑大于 5.5 cm，二等菇的菌蓋直徑大小為 4.5 cm～5.5 cm，三等菇菌蓋直徑小于4.5 cm。香菇菌株在不同混料配方中的農藝性狀結果統計見表3及圖1。

表3 香菇菌株在不同混料配方中的農藝性狀Tab.3 Fruiting body traits of Lentinula edodes in different formulas

圖1 香菇菌株在不同混料配方中的農藝性狀Fig.1 Fruiting body traits of Lentinula edodes in different formulas

由表3及圖1所示，不同配方香菇的生物學效率的大小順序為配方3＜配方6＜配方4＜配方5＜配方1＜CK＜配方 2，配方 2的 C/N 較高 （46.27） 其生物學效率最高。配方4，配方5和配方6的生物效率差值為±1%，但是C/N的差值為±5%，C/N值較低的配方3生物學效率最低。配方2的生物學效率比CK組高6.22%，且在菌蓋厚度、菌蓋直徑，菌柄長度、菌柄直徑的數值最高。不同配方間僅在菌蓋厚度上表現為差異顯著。香菇不同混料配方的鮮菇等級面積和潮次柱狀圖見圖2。

圖2 不同配方對香菇子實體等級分布率的影響Fig.2 Effects of different formulas on the grade distribution of fruiting bodies

由圖2所示，配方2的二等菇率最高（60%），配方5的一等菇率（38%）高于二等菇率和三等菇率。配方內的結果均表現為二等菇率最高，配方4和配方5的一等菇率大于三等菇率。

混合配方基質的不同添加量對產量生物學效率的影響顯著。在單一考慮玉米芯，木屑和玉米秸稈粉作為基質栽培香菇菌株時，3種基質對產量影響小，而玉米芯與木屑混合添加的比例對生物學效率有增益作用。香菇是一種好氧的大型真菌[21]，菌包內的孔隙度也會影響菌絲生長，傳統的木屑配方中含有80%粗木屑，使得菌包內的通氣度高，而本試驗中混料秸稈配方中混有顆粒度較小的玉米秸稈粉，降低了菌包內的孔隙度從而影響香菇的生長。Ma等[4]在使用特殊材料栽培食用菌時發現基質的低保水性會導致基質縫隙中含有過量水，水中的離子鍵限制了真菌生長過程中的物質合成，從而影響食用菌的生長。香菇混合栽培基質中玉米秸稈粉的低保水性同樣影響了菌絲的生長發育，說明玉米秸稈粉不適合作為混料中的主料栽培香菇。

2.3 不同生長階段的酶學活性分析

菌絲生長過程中會分泌漆酶，纖維素酶和木聚糖酶等用于降解基質來獲得生長發育的營養。試驗對香菇固態發酵過程中產生的漆酶，酸性木聚糖酶和羧甲基纖維素酶進行評價，其中菌絲分泌的漆酶主要分解基質中的木質素；酸性木聚糖酶主要分解基質中的木聚糖，酸性木聚糖酶的作用環境為pH 3.5～6.5，僅有少數在酸性條件下生長的真菌可分泌；羧甲基纖維素酶主要將基質中的纖維素分解成菌絲能夠直接利用的寡糖[22]。不同時期香菇所分泌的酶活性統計見圖3。

圖3 不同時期酶活性Fig.3 Enzyme activity in different stages

圖3結果表明，漆酶在3個時期（菌絲滿袋期、轉色完成期、出菇期） 的變化為滿袋期漆酶活性最高，轉色完成期活性最低，當處于出菇期時，漆酶活性上升卻未達到滿袋期水平，其中漆酶活性最高為配方3滿袋期（11.07 U·g－1）。羧甲基纖維素酶活性表現與漆酶相似，配方4出菇期的羧甲基纖維素酶活性最高達到0.91 U·g－1。與漆酶和羧甲基纖維素酶相比，酸性木聚糖酶活性在香菇栽培過程不同時間段內，沒有觀察到與漆酶和羧甲基纖維素酶相似的變化趨勢；在轉色完成期的酸性木聚糖酶酶活性最低，配方1（12.75 U·g－1）、配方2（10.35 U·g－1）、CK（9.73 U·g－1）和配方5（11.50 U·g－1）在出菇期的活性最高，而配方3（14.64 U·g－1）在轉色完成期的酶活性最高。

3種酶的酶活性結果表明，漆酶和羧甲基纖維素酶對香菇的出菇階段最重要，菌絲分泌酶分解木屑和玉米秸稈中的木質素和纖維素促進生長[23]。在菌絲滿袋時期內，大量的菌絲繁殖并聚集[24]，因此該期間漆酶和羧甲基纖維酶活性高。

在香菇菌絲轉色過程中，菌絲體的活性較弱，說明菌絲體產生的酶只用于維持表面菌絲的生理結構變化[25－26]。出菇期間，為了獲取子實體生殖生長過程所需營養，菌絲活動增強，酶活性同時增加。不同配方內的基質導致了菌包內纖維素、半纖維素等物質含量有所差異，造成不同配方內酶活性的差異。另一方面，木屑、玉米芯和玉米秸稈3種主料的物理特性使菌包內的孔隙度不同。酶活性受到pH、溫度和氧氣等因素的影響[27－28]，因此造成不同配方酶活力的差異。但是，為了完成香菇的整個生長周期[29]，定量的營養需要在基質中獲取，因此盡管受到基質的物理、化學因素的影響，菌絲在滿袋期、轉色完成期、出菇期分泌漆酶和羧甲基纖維素酶的變化趨勢相同，均表現為滿袋期酶活性最高，轉色完成期有所降低，出菇期酶活性雖上升但是低于滿袋期這一高、低、高的變化趨勢。

2.4 混合基質對鮮菇中礦物質及有害金屬成分的影響

香菇可以通過固態發酵來富集多種礦物質元素[30－31]，混合秸稈栽培香菇是否會影響子實體內的礦物質元素和營養元素，是研究的主要重點之一。種植玉米時，化肥和除草劑等化學藥劑會增加玉米秸稈中有害元素的含量，從而影響滑子蘑（Pholiota microspora） 子實體的元素和營養組成（氮和磷）[19]。不同配方子實體礦物質含量統計見表4。

表4 子實體礦物質含量Tab.4 Mineral composition of Lentinula edodes fruiting bodies

由表4所示，主要元素中配方3的鈉元素（125.62 mg·kg－1）、鎂元素（1 171.642 mg·kg－1）和鈣元素（175.55 mg·kg－1）含量最高。傳統配方與混合基質配方子實體微量元素沒有顯著差異。玉米秸稈粉含量最高的配方1的銅元素和鋅元素含量最高，其中銅元素比CK組高37.29%；而配方2的硒元素含量最高達到 0.15 mg·kg－1。各配方香菇子實體有害元素的含量低于GB 2762－2017食品安全國家標準－食品中污染物限量中的標準。配方3的鈣、鈉、鎂元素的平均含量比傳統的木屑配方高20.00%。鎂元素參與人體多種生命代謝，配方1中的鎂元素遠高于一般蔬菜（如豆角、西紅柿和胡蘿卜等）且與蘇子葉鎂元素含量相當 （1 140.00 mg·kg－1）[32－34]，是一種天然的鎂庫。除了在蔬菜中常見的鐵、銅和鋅元素，使用秸稈栽培香菇中檢測到的硒元素也高于CK配方。大多數食用菌均可從基質中富集金屬元素，香菇生長周期長因此其富集金屬元素的能力比一般真菌強[35]。結果表明，使用混合秸稈基質栽培香菇不會使子實體的有害元素增加，香菇的高富集金屬特性使其礦物元素較傳統木屑配方有明顯優勢。

2.5 不同配方對鮮菇中營養元素及氨基酸含量的影響

不同配方對香菇子實體及氨基酸含量的影響見表5。

表5 子實體營養和氨基酸含量Tab.5 Nutritional and mineral composition of Lentinula edodes fruiting bodies

由表5可知，香菇子實體的脂肪含量低，但是粗蛋白和總糖含量高，香菇栽培基質碳元素、氮元素含量的不同會影響其子實體總糖和氨基酸含量[36]。研究表明，隨著玉米秸稈比例的增加，滑子蘑生長過程中總氨基酸和必需氨基酸含量先增加后減少[18]。表5各配方總糖含量變化趨勢為：配方4＞配方1＞CK＞配方2＞配方6＞配方3＞配方5。雖然CK配方的碳氮比適合香菇生長，但其碳元素、氮元素含量較低，使子實體營養成分低于其他配方。碳氮比較高的配方2在脂肪、總糖和粗蛋白含量依然有明顯優勢，碳含量最低的CK配方總糖含量為38.80%，比碳含量最高的配方4的總糖含量低9.15%。玉米芯含量最高的配方6粗蛋白含量最低。不同混合秸稈配方的氨基酸類型相同，但其豐富度不同。Pro和Phe的含量在各配方的差異不顯著，配方4比其余配方高，在Arg、His、Lys、Tyr、Ala含量上均有優勢。香菇子實體氨基酸中含有4種人體必需氨基酸，其中含量最高的是Val（1.18 g·100－1g－1）。

有研究表明在香菇栽培基質中碳和氮含量對子實體氨基酸含量有一定影響[11]。菌絲利用酶分解基質中的元素來合成氨基酸并未受到混合基質特性的影響，當基質作為營養庫提供原料時，香菇僅攝取了必需的合成元素，從而使混合秸稈配方間的氨基酸含量并無明顯差距。混合玉米秸稈配方生產的子實體與CK配方組相比保持了低脂肪和高蛋白質含量的優良特性，從而保持了混合配方的優勢。

3 結論

農業、林業廢棄物與菌絲固體發酵結合，不僅能高效處理廢棄物，還能生產珍貴的可食用真菌，是綠色農業發展的必然趨勢。香菇作為典型的木腐真菌，為其生產尋找更加綠色環保的木質纖維素基質為目前研究熱點；為了評價子實體食用安全性；探究香菇生長過程中基質的木質纖維素降解規律；基質對香菇子實體質量的影響還需更深入研究。在香菇生長過程中，漆酶和羧甲基纖維素酶的活性在菌絲生長階段最高，轉色完成期下降，在出菇期又上升。玉米秸稈混合配方栽培香菇的優化比例為玉米芯25%、玉米秸稈粉10%、木屑45%，經過中試試驗回歸驗證，該配方栽培香菇的實測產量529.71 g/棒，生長速率0.31 cm·d-1，準確度92.40%，適合在中國高溫地區（浙江、福建和湖北等）推廣。

過量的玉米秸稈粉不適宜栽培香菇，混合添加玉米秸稈粉不利于香菇產量的提高，玉米芯可以與木屑混合作為栽培香菇的基質主料并提高香菇的質量等級。混合秸稈配方所表現的優勢主要有子實體總糖含量更高，有害金屬元素未超標，子實體氨基酸含量豐富且基質中的含碳量和含氮量更高。