電化學生物傳感器及其檢測大腸桿菌的研究

曹卓松，孫飛龍，李辰宇，楊曉波，王尚，薛斌，趙辰，張曦，諶志強，王景峰，邱志剛*

（1.西安工程大學環境與化學工程學院，陜西 西安 710600；2.軍事科學院軍事醫學研究院環境醫學與作業醫學研究所，天津 300050）

電化學生物傳感器是通過測量電化學信號檢測微生物的生物傳感器，這種傳感器是以生物敏感材料（如抗體等）作為識別元件特異性識別待測物，以電極（如玻碳固體電極等）作為轉換元件將物理或化學變化轉換為電信號，通過信號放大并處理從而實現定性或定量分析待測物[1]。近年來電化學生物傳感器隨著材料、生物、電化學等學科的快速發展也取得了巨大進步，各領域學者也報道了大量新型電化學生物傳感器。

大腸桿菌是廣泛存在于水體中的一類致病菌，人體感染其可引起闌尾炎、膽囊炎等疾病，嚴重情況甚至可導致死亡[2-3]。傳統檢測大腸桿菌的方法主要有操作復雜、檢測耗時長的濾膜法、多管發酵法等，其缺點是很難滿足污染源快速檢測的需求。近年來發展的許多檢測方法[如聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）[4-5]、免疫學檢測[6-7]等]均具有獨特優勢，但仍達不到現場檢測的時間要求。因此，電化學生物傳感器因其靈敏度高、特異性強、耗時短的優勢迅速發展起來。

本文介紹了電化學生物傳感器的檢測原理及常用的檢測技術，探討了電化學生物傳感器在大腸桿菌檢測方面的傳感原理及應用成果，并對電化學生物傳感器發展前景進行了展望。

1 大腸桿菌

1.1 生物學特性及致病性

大腸桿菌，又稱大腸埃希氏菌（Escherichia coli），是一種兩端鈍圓的短桿菌，屬腸桿菌科、埃希氏菌屬，革蘭氏陰性菌種，大量存在于恒溫動物腸道內，是腸道內正常棲息菌，可隨糞便排出后在自然界廣泛散播，因此環境內檢出大腸桿菌則表明被糞便感染。所以從大腸桿菌被發現開始，其就被作為食品類糞源污染的衛生學指標及水體衛生學檢測的微生物指標[8]。

大部分大腸桿菌無致病性，少部分菌種可產生腸毒素，能導致腸胃炎等疾病，是食物中毒主要原因之一[9]。若人體其他組織器官遭到大腸桿菌侵染，還可引起尿道炎、膀胱炎等疾病，甚至還能導致免疫力較弱人群引起敗血癥[10]。

1.2 檢測方法研究現狀

目前世界普遍采用的大腸桿菌檢測方法有稀釋平板計數法、多管發酵法和濾膜法[11]。其中前兩者適用范圍廣，但操作繁瑣耗時長；而濾膜法僅適用于雜質較少的水樣，較前兩者操作相對簡單；這幾種傳統方法在檢測周期、檢測效率等方面都存在不足，無法滿足快速檢測的需求[12]。近年來除了傳統的檢測方法外，在各界學者的大量研究下也發展了許多檢測大腸桿菌的新方法，如PCR法、免疫法、酶底物法、電化學法等。

PCR技術，在檢測大腸桿菌方面具有快速靈敏等優勢，其原理是以擴增的目標DNA為模板，將與模板互補的寡核苷酸片段作為引物，在DNA聚合酶作用下沿著模板延伸至完成新的DNA的合成，目前大腸桿菌PCR技術主要是針對致病性大腸桿菌的致病基因[13]。但該方法也存在反應效率差異大、擴增產物長度有限等不足。

免疫法是基于抗原抗體之間特異性反應進行檢測的一種方法，其通過對反應物進行示蹤物標記，利用抗原或抗體進行快速定量檢測。免疫法在檢測大腸桿菌方面主要方法有免疫磁珠法、酶聯免疫吸附法、熒光免疫法等[14]。免疫法具有特異性強、耗時短、靈敏度高等優勢，但待測物抗體的制備較為復雜。

酶底物法基于微生物代謝過程中產生的特異性酶可以專一地催化底物的原理對微生物進行檢測，大腸桿菌較其他微生物特有的酶是β-D-葡萄糖醛酸糖苷酶，該酶通常作為大腸桿菌標志酶[15]。基于β-D-葡萄糖醛酸糖苷酶檢測大腸桿菌的方法被廣泛應用，也研究了多種可用于顯色反應或熒光反應的催化底物。雖然該方法在特異性方面有出色表現，但技術本身的局限性導致了其靈敏度不高。

電化學法是通過制備電化學生物傳感器，利用微生物的物理、化學或電學變化及獨特的電化學性質進行分析的研究方法。電化學檢測大腸桿菌的方法常分為3類：基于標記的間接檢測方法、基于無標記的直接檢測方法、基于微生物代謝的檢測方法。電化學方法得以廣泛研究應用的主要原因在于其具有較高的準確度和靈敏度，且檢測范圍廣、特異性強、耗時短，重要的是其可以通過與其他技術聯用以滿足不同的需求。

2 電化學生物傳感器技術研究進展

2.1 檢測原理

電化學檢測原理是復相化學反應，一般反應形式如公式（1）所示。

式中：O為化合物的氧化態，R為還原態，ne為氧化還原反應轉移的電子。電極表面反應過程主要為：O從溶液中遷移至電極/溶液界面→O在電極表面吸附→O得電子還原為R→R從電極表面解析→R從電極/溶液界面遷移至溶液中，該過程為法拉第過程。電極表面的雙電層結構（電極/溶液界面）相當于一個電容器，其具有電容特性，當電極電位改變時雙電層充電或放電，該過程電子轉移產生電信號，通過對電信號的采集處理即可實現對樣品的檢測。

穩態測量技術：電化學穩態是指電化學系統的參數（如電極界面狀態、電流密度、電極電勢等）沒有變化或變化可忽略的狀態。穩態系統的特點是穩態電流全部用于電化學反應，且電極界面上擴散層范圍不變，擴散層厚度恒定。穩態法檢測的是電極過程達到穩定狀態后電流密度與電極電勢的關系，此時電流密度與電極電勢不隨時間改變，外電路即代表速率。Rocchini等[16-17]學者利用穩態技術論述了極化曲線動力學計算對掃描速率的影響。值得注意的是，在使用固體電極時，隨著測量時間的延長，電極表面狀態及其表面積的變化情況逐漸累積，不可忽略。

暫態測量技術：暫態是當系統極化條件改變時電極經歷的一段不穩定、變化的階段，是電極從一個穩態向另一個穩態轉變的過渡狀態。暫態過程具有雙電層充電電流，且電極附近液層中的電極電勢、雙電層結構、擴散層厚度、濃度梯度等參數均隨時間變化。暫態法主要研究手段依據施加擾動信號的大小分類，小幅度擾動信號（濃差極化可忽略）采用等效電路研究，電極過程處于傳荷過程控制，大幅度擾動信號（濃差極化不可忽略）采用方程解析法研究。暫態法主要可用于測量 i、k 等動力學參數[18-20]，雙電層電容[21-22]、溶液電阻[23-25]等電化學參數，電沉積[26-27]、金屬腐蝕[28-29]等表面狀態變化快的體系。

2.2 技術分類

線性電勢掃描法，在電化學分析中又稱伏安法，是通過控制電極電勢以恒定速率變化來測量電極電流的方法，其中常用的檢測手段包括薄層伏安法、循環掃描法、循環伏安法等。一般情況下線性掃描有以下特點：測得的電流是電極雙電層充電電流和放電電流之和；由于電勢不斷變化，因此雙電層充電電流不為零；雙電層電容隨著電勢變化而改變；而電勢變化也導致反應速率改變。特別的是，如果電極表面在電勢變化范圍內不發生電化學反應，則相當于理想極化電極，測得曲線反映的即是雙電層電容和電勢的關系。

脈沖伏安法是通過消除充電電流進行研究的一種極譜技術，其具有分辨率高、靈敏度強等特點。該技術方法被廣泛應用于痕量分析[30-32]的原因是其通過充分減少充電電流和毛細管噪聲電流，提高了信噪比，使其達到極高的靈敏度。脈沖技術又可細分為常規脈沖伏安法、微分脈沖伏安法、差示脈沖伏安法、方波伏安法等，其中差示脈沖伏安法和方波伏安法是靈敏度最高的檢測方法。

電化學阻抗法是屬于暫態電化學技術的一類檢測方法，其原理也是向電化學系統施加一個擾動信號，通過觀測系統電信號響應分析系統電化學性質，特別的是其施加的電信號是不同頻率的振幅較小的正弦電勢波，測量的信號是電勢與電流信號的比值（即阻抗）。由于電化學阻抗法向電極施加的是小振幅交流電信號，因此當頻率足夠高時其表面狀態化和濃差極化不至太嚴重，且不會導致極化累積，避免了對電化學體系產生過大的影響。

3 電化學生物傳感器檢測大腸桿菌的進展

電化學生物傳感器用于直接檢測大腸桿菌的技術根據制造傳感器的檢測策略分為依賴標記的檢測技術和無標記檢測技術，其中依賴標記的電化學生物傳感器采用間接檢測法，一般情況下采用生物分子或其他理化分子（如酶、金屬納米顆粒等）對目標細菌進行標記，用于誘導電化學信號進行測量。而無標記檢測技術是在電極表面固定生物受體（如抗體、核酸等）用于特異性識別，在不進行標記的條件下，通過細菌的附著引起電化學參數變化，從而直接檢測目標細菌。除上述兩種直接檢測大腸桿菌的技術外，還有一種采用通過對大腸桿菌代謝產物進行定量分析從而間接檢測大腸桿菌的技術，即基于微生物代謝的檢測技術。

3.1 基于標記的間接檢測傳感器

Gehring等[33]基于酶聯免疫法制備了酶聯免疫磁電化學生物傳感器，將大腸桿菌固定在免疫磁珠和酶結合抗體之間制成三明治結構，多孔板磁化石墨電極用于吸附被捕獲的大腸桿菌，該傳感器在緩沖溶液中檢測限為3.3×103cfu/mL。由于傳感器檢測的電信號是由標簽轉換而來，則還有一種檢測思路是采用多個不同的標簽進行標記，從而實現對多個細菌進行同時檢測。Viswanathan等[34]制備了一種可以同時檢測大腸桿菌、沙門氏菌和彎曲桿菌的傳感器，他們將這3種細菌分別用 Cd、Cu、Pb 標簽標記為 E.coli-CdS、Salmonella-CuS、Campylobacter-PbS，并將這3種細菌的抗體功能化多壁碳納米管-聚烯丙基胺修飾到絲網印刷電極表面，被標記的細菌被捕獲后與特定的抗體結合并釋放標記物金屬離子，通過對不同金屬離子的測定實現對不同細菌的定量檢測，3種細菌檢測限分別為0.8×103、0.4×103、0.4×103cfu/mL。

基于標記的電化學傳感器優勢在于其通過標記實現了對電信號的放大，從而降低了檢測限、提高了特異性。但是，這類電化學傳感器由于標記過程的復雜性而延長了檢測時間、增加操作難度。

3.2 基于無標記的直接檢測傳感器

根據Wang等[35]的報道，天然細菌細胞膜厚度為5 nm～10 nm，因為膜的選擇透過性所以細菌電阻為102Ωcm2～105Ωcm2，電容為 0.5 μF/cm2～1.3 μF/cm2，因此細菌在電極表面的附著可以引起電化學參數的變化。Zelada-Guillén等[36]制備了一種簡單直接有效的傳感器用于檢測大腸桿菌，該傳感器通過在修飾有單壁碳納米管的玻碳電極表面固定適配子實現了對大腸桿菌的特異性檢測，經過對食品樣液預處理后，該傳感器在牛奶中檢測限達到6 cfu/mL，在蘋果汁中達到26 cfu/mL。Li等[37]利用石英晶金電極制備了一種免疫傳感器，該傳感器先用蛋白A對電極進行簡單修飾，然后用抗大腸桿菌抗體進行功能化，由于該傳感器的電極表面積較大，從而可以捕獲更多細菌，增大了電阻變化，該傳感器檢測限為103cfu/mL。

相較于基于標記的電化學傳感器，無標記電化學傳感器最大的優勢在于檢測時間短、檢測過程簡單，但是也存在檢測限不夠低、靈敏度不夠高、電極再生困難等不足。

3.3 基于微生物代謝的檢測傳感器

活的微生物在生長代謝過程中加入某些特定介質后，能通過代謝時發生的氧化還原反應產生電信號，目前該技術主要基于傳感器上的pH值、離子濃度、電阻等電化學參數的變化對細菌進行檢測，多年來，依據對微生物代謝過程進行檢測從而實現定量檢測的傳感器已不在少數[38-39]。

Sippy等[40]依據大腸桿菌在代謝過程中能產生分解過氧化氫的過氧化氫酶[41]的原理，通過檢測大腸桿菌代謝消耗的過氧化氫的量實現了對大腸桿菌的定量檢測，該傳感器檢測范圍為20cfu/mL～2.0×107cfu/mL。程欲曉[10]通過對大腸桿菌溶液進行預處理，使代謝產物β-D-半乳糖苷酶釋放到溶液中，再向溶液添加底物氨基酚-β-D半乳糖苷酶，利用代謝產物水解底物產生對氨基酚的反應，制備了大腸桿菌電化學傳感器，傳感器檢測范圍為50 cfu/mL～1.0×105cfu/mL。

基于微生物代謝的檢測傳感器在檢測大腸桿菌方面具有方便快捷的獨特優勢，但仍存在特異性不高、靈敏度低等不足。

4 展望

由于大腸桿菌作為重要的環境監測指標且其在食品領域零容忍的政策，因此對大腸桿菌的檢測有著較嚴格的標準，在電化學生物傳感器方面也有靈敏度、特異性、穩定性、檢測時間等指標的要求。近年來，隨著納米技術、小型芯片技術、絲網印刷技術在電化學領域的應用，電化學生物傳感器也得到了迅速的發展，且逐漸被認為是微生物現場檢測最具前景的檢測方法。電化學生物傳感器雖然有小型化、成本低、受樣品影響小等優勢，但在穩定性、易保存性、可再生性及批量生產實現商品化方面仍有較大發展空間，而且目前尚缺少對于電化學生物傳感器的官方統一標準。因此，實現電化學生物傳感器商業化仍任重道遠。