枸杞子中玉米黃素雙棕櫚酸酯及枸杞酸的測定

周慧吉，彭 博，李廷釗,，陳 亮，李 波,,

（1.安利（中國）研發中心，上海 201203；2.安利（中國）植物研發中心，江蘇無錫 214145）

枸杞子為茄科植物寧夏枸杞（Lycium barbarumL.）的干燥成熟果實，主要分布在我國西北的青海、寧夏、甘肅和新疆等地。枸杞子是我國傳統藥材，具有滋補肝腎，益精明目的作用[1]。現代藥理研究證實其具有調節免疫、保肝[2?3]、抗氧化損傷[4]、保護視力[5]等作用。枸杞子中的化學成分分為脂溶性和水溶性成分。脂溶性成分主要是類胡蘿卜素類等[6?7]，又以玉米黃素雙棕櫚酸酯（C72H116O4，ZDP）為主以及少量玉米黃素[8?9]等。ZDP 在體內代謝轉化成玉米黃素[10?11]，是預防黃斑病變和保護肝臟的主要成分[12?14]。枸杞子中的水溶性成分主要是2-O-β-D-葡萄糖基-L-抗壞血酸（C12H18O11，枸杞酸，AA2βG）、甜菜堿[15]和枸杞多糖[16]等物質。其中枸杞酸是天然的維生素C 前體物質[17?18]，具有美白、抗氧化、抗衰老、保肝等功效[19?21]。

枸杞子原料的產地來源多，質量也存在較大差異。目前，市場上枸杞聲稱以枸杞多糖為主要成分，且藥典中以多糖和甜菜堿作為指標。然而，一方面枸杞中多糖檢測繁瑣，專屬性不強，誤差大；另一方面，甜菜堿的合成價格便宜，且甜菜根中含有大量甜菜堿[22?23]，專屬性較差，不能很好的用于枸杞子品質評價。ZDP 和枸杞酸在枸杞子中含量豐富，且枸杞酸僅存在枸杞子中[24?25]。兩種成分的含量均隨著枸杞子成熟度升高而增高，其含量高低也是枸杞子品質的最直接反映[26?27]。已有文獻報道過ZDP 檢測方法[28]，前處理步驟多，易產生系統誤差，且流動相體系復雜。枸杞酸已用于枸杞子提取物的品質評價[16]，但未應用于枸杞子原藥材的研究。

由于ZDP 和枸杞酸的極性相差太大，暫不適合一起制備和分析（結構圖見圖1）[29]。針對ZDP 成分，本文采用先去除枸杞子水溶性成分再提取ZDP的方法，減少轉移次數，且流動相僅為丙酮及甲醇，前處理和液相條件均相對簡單。另外，本文采用UPLC檢測枸杞原料中枸杞酸的含量，分析速度快，分離度好，可在很大程度上縮短實驗時間，提高實驗效率。本實驗以ZDP 和枸杞酸作為枸杞子藥材的指標成分進行品質評價，既兼顧脂溶性和水溶性成分，又體現了活性和特征性成分，還能有效檢測枸杞子藥材染色、摻假等情況，為日后提高枸杞子及其制劑的質量標準提供參考。

圖1 玉米黃素雙棕櫚酸酯（1）和枸杞酸（2）結構圖Fig.1 Structure of zeaxanthin dipalmitate (1) and 2-O-(β-D-Glucopyranosyl) ascorbic acid (2)

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

枸杞子 共22 批，分別采自寧夏、甘肅、青海，具體信息見表1，經上海安利研發中心中藥學專業陳亮博士鑒定為茄科植物寧夏枸杞（Lycium barbarumL.）的干燥成熟果實；正己烷、乙腈、甲醇 色譜級，美國Fisher 公司；丙酮 AR 級別，Greagent 公司；對照品枸杞酸（批號8030，CAS 號562043-82-7） 上海詩丹德標準技術服務有限公司；玉米黃素雙棕櫚酸酯（批號12） 上海甄選生物；醋酸銨 分析純，上海泰坦科技有限公司。

表1 22 批枸杞子信息Table 1 Information of 22 batches of Lycium barbarum

超純水系統 上海技舟化工科技有限公司；WF-600EHT 型超聲波清洗機 寧波海曙五方超聲設備有限公司；XS2051/10 萬分之一電子天平、MS3002S 型電子分析天平 梅特勒-托利多國際貿易有限公司；高效液相色譜儀HPLC（配PDA 檢測器）、超高效液相色譜儀UPLC（配PDA 檢測器） 美國Waters 公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 溶液制備

1.2.1.1 對照品溶液的制備 精密稱取ZDP 標準品5 mg，加正己烷-丙酮（1:1）混合溶劑制成5 mg/mL對照品儲備液。精密稱取枸杞酸對照品5 mg 左右，用水溶解，制成5 mg/mL 枸杞酸對照品儲備液。

1.2.1.2 供試品溶液的制備 ZDP 提取方法參考文獻[29]并進行調整。將枸杞子放在液氮中迅速冷凍后打粉，取枸杞子粉末（過40 目篩）約500.000 mg，精密稱定，加蒸餾水50 mL，超聲處理20 min。樣品溶液高速離心后棄去上清液。殘渣中加正己烷-丙酮（1:1）混合溶劑20 mL，超聲處理5 次至殘渣無色，每次20 min，過濾，合并濾液，用正己烷-丙酮混合溶劑定容至100 mL，搖勻，0.45 μm 濾膜過濾，即得枸杞子提取液。注意提取過程在避光條件下進行。

枸杞酸提取方法參考文獻[19]并進行調整。將枸杞子在液氮中迅速冷凍后打粉，取枸杞子粉末（過40 目篩）約500.000 mg，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入蒸餾水25 mL，稱定重量，超聲處理40 min，放冷至室溫，用蒸餾水補足減失重量，搖勻。取清液1 mL 至25 mL 容量瓶中，用流動相定容，0.45 μm 濾膜過濾，即得枸杞酸提取液。

1.2.2 色譜條件 ZDP 檢測：Luna C18（2）色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動相丙酮:甲醇=55:45，等度洗脫，流速1 mL/min，柱溫25 ℃，檢測波長450 nm，進樣量10 μL。

枸杞酸檢測：Waters 二醇基柱Torus TM Diol Column（100 mm×3 mm，1.7 μm）；進樣量2 μL；流動相為乙腈?66.7 mmol/L 醋酸銨（體積比85:15），等度洗脫，流速為0.4 mL/min，柱溫40 ℃，檢測波長260 nm。

1.2.3 含量計算

1.2.3.1 標準曲線的制作 用正己烷-丙酮（1:1）混合溶劑稀釋“1.2.1.1”項下ZDP 的對照品儲備液，分別配制成10、20、40、60、80、100 μg/mL 的ZDP 對照品溶液，依次精密吸取對照品溶液10 μL 注入液相色譜儀，按照“1.2.2”項下ZDP 色譜條件下進行測定。以峰面積為縱坐標（Y），質量濃度為橫坐標（X）擬合，得到線性回歸方程和相關系數。

用流動相乙腈-66.7 mmol/L 醋酸銨溶液（體積比85:15）稀釋“1.2.1.1”項下枸杞酸對照品儲備液，分別配制成3.125、6.25、12.5、25、50、100 μg/mL的枸杞酸對照品溶液，依次精密吸取對照品溶液2 μL 注入液相色譜儀，按照“1.2.2”項下枸杞酸色譜條件進行測定。以峰面積為縱坐標（Y），質量濃度為橫坐標（X）擬合，得到線性回歸方程和相關系數。

1.2.3.2 結果計算 試樣中ZDP、枸杞酸的含量按下式計算：

式中：X-試樣中ZDP 和枸杞酸的含量，%；c-根據標準曲線計算得到的試樣中ZDP 和枸杞酸的濃度，μg/mL；D-稀釋倍數；V-定容液的體積，mL；m-試樣的稱樣量，mg。

1.2.4 方法學考察實驗 通過線性度、精密度、穩定性、重復性、加標回收率等考察方法的可行性。

1.3 數據處理

數據采集和分析軟件分別為Waters e2695 自帶的Empower 3FR3 和Excel 2016。

2 結果與分析

2.1 線性關系

將ZDP 和枸杞酸的標準工作溶液，各自按照實驗色譜條件依次進樣，根據濃度與峰面積的關系繪制標準曲線。ZDP 的線性方程為y=4×107x+1646.9，r=0.9990。表明ZDP 在質量濃度10～100 μg/mL 范圍內線性良好。枸杞酸的線性方程為y=11264x?1005，r=1.0000。表明枸杞酸當質量濃度為3.125～100 μg/mL 范圍內時線性良好。

2.2 精密度實驗

由于丙酮溶劑揮發性極強，取ZDP 對照品溶液分裝到6 個液相小瓶中，精密吸取對照品溶液10 μL注入液相色譜儀，連續進樣6 次，記錄ZDP 的峰面積；精密吸取枸杞酸對照品溶液2 μL 注入液相色譜儀，重復進樣6 次，記錄枸杞酸的峰面積，結果如表2。兩者的RSD 分別為0.85%、0.83%，表明儀器精密度良好。

表2 玉米黃素雙棕櫚酸酯對照品及枸杞酸對照品精密度試驗結果（n=6）Table 2 Precision test results of zeaxanthin dipalmitate and ascorbic acid (n=6)

2.3 穩定性試驗

取同一ZDP 供試品溶液，分裝在6 個液相小瓶中，分別于0、2、4、8、12、24、48、72 h 精密吸取供試品溶液10 μL 注入液相色譜儀，記錄ZDP 的峰面積，0～24 h 內ZDP 峰面積RSD 為1.06%，結果表明樣品在24 h 內穩定。ZDP 在48 h 后開始出現小范圍的降解，72 h 后降解程度達6.92%。因此，ZDP 供試品前處理結束后宜在24 h 內盡快檢測。

取同一枸杞酸供試品溶液，分別于0、2、4、8、12、24、48、72 h 精密吸取2 μL 注入液相色譜儀，記錄枸杞酸的峰面積，0～72 h 內枸杞酸峰面積RSD 為1.956%，表明樣品在72 h 內穩定（見表3）。

表3 ZDP 供試樣品及枸杞酸供試樣品穩定性試驗結果Table 3 Stability test results of ZDP and ascorbic acid

2.4 重復性試驗

取同一批次枸杞子粉末（批號：20190908）6 份，按照“1.2.1.2”項下制備供試品溶液依法測定，結果見表計算ZDP 含量的RSD 為1.88%，表明該方法的重復性良好。結果如表3。

取同一批次枸杞子粉末（批號：20190908）6 份，按照“1.2.1.2”項下制備供試品溶液，依法測定，計算枸杞酸含量的RSD 為1.82%，表明方法的重復性良好（見表4）。

2.5 加樣回收率試驗

精密稱取ZDP 含量已知的枸杞子粉末樣品（批號：20190908），共9 份，加入適量的ZDP 對照品，按照“1.2.1.2”項下制備供試品溶液，依法測定，并計算回收率，結果如表5。RSD 小于5%，表明ZDP 檢測方法有良好的回收率。

精密稱取已知枸杞酸含量的枸杞子粉末樣品（批號：20190908），共9 份，分別添加適量的枸杞酸對照品，按照“1.2.1.2”項下制備供試品溶液，依法測定，計算回收率，結果如表6。RSD 小于5%，表明枸杞酸檢測方法有良好的回收率。

2.6 樣品測定

按建立的方法，對22 批枸杞子樣品進行ZDP及枸杞酸含量的測定，結果見表7。ZDP 對照品及ZDP 供試品溶液高效液相色譜圖譜見圖2。枸杞酸對照品及枸杞酸供試品溶液超高效液相色譜圖見圖3。

本文對不同產地不同年份的22 批次枸杞子樣品進行分析，結果顯示，ZDP 與枸杞酸穩定存在各批次樣品中，ZDP 含量在0.14%～0.51%之間，枸杞酸含量在0.45%～1.33%之間。不同地區枸杞子中的ZDP 并沒有明顯的差異性（見圖4）。寧夏枸杞子中的枸杞酸相比較青海枸杞子含量更高，且存在顯著性差異（P<0.05），但與甘肅枸杞子并無顯著性差異（見圖5）。

3 討論與結論

本研究分別采用HPLC 及UPLC 檢測枸杞子脂溶性活性成分ZDP 及水溶性活性成分枸杞酸含量。ZDP 極性小且對光熱較為敏感，所以用“正己烷-丙酮”提取，實驗全程低溫避光穩定性實驗中發現ZDP 在48 h 后開始出現小范圍的降解，72 h 后降解明顯。因此，ZDP 供試品前處理結束后宜在24 h 內盡快檢測。本文的檢測結果與白光燦[26]的結果相差近10 倍，但與陳敏等[28]報道結果接近。枸杞酸極性大且穩定性非常好，所以用水超聲提取。平行測定6 次，ZDP 及枸杞酸的相對標準偏差（RSD）分別為1.88%、1.82%，加樣回收率分別在92.48%～104.31%，90.345%～100.743%。表明2 種方法均重現性良好、準確可行。

表4 供試樣品中ZDP 含量及枸杞酸含量的重復性試驗結果Table 4 Repeatability test results of ZDP and ascorbic acid content

表5 玉米黃素雙棕櫚酸酯加樣回收試驗結果Table 5 Results of recovery tests for ZDP

表6 枸杞酸加樣回收試驗結果Table 6 Results of recovery tests for ascorbic acid

表7 枸杞中玉米黃素雙棕櫚酸酯及枸杞酸的含量測定結果Table 7 Results of content assay for ZDP and ascorbic acid in fruits of Lycium barbarum L.

圖2 玉米黃素雙棕櫚酸酯（A）和供試品（B）溶液高效液相色譜圖Fig.2 HPLC chromatograms of zeaxanthin dipalmitate (A) and test substance (B) solution

圖3 枸杞酸（A）和供試品（B）溶液超高效液相色譜圖Fig.3 UPLC chromatograms of Lycium barbarum acid (A) and test substance (B) solution

圖4 玉米黃素雙棕櫚酸酯（ZDP）在不同產地枸杞子中的分布Fig.4 Distribution of ZDP in Lycium barbarum L.from different areas

圖5 枸杞酸在不同產地枸杞子中的分布Fig.5 Distribution of AA2βG in Lycium barbarum L.from different areas

本文對不同產地不同年份的22 批次枸杞子樣品進行分析，結果顯示，ZDP 與枸杞酸穩定存在各批次樣品中，ZDP 含量在0.14%～0.51%之間，枸杞酸含量在0.45%～1.33%之間。該方法操作簡單，檢測結果能夠較好地反映枸杞子的品質，為枸杞子樣品的品質評價提供參考。

盡管本文對ZDP 的方法進行了改進，但提取及液相分析時間仍然很長。后期可進一步簡化提取步驟，并采用超合相色譜進行分析。超合相色譜在分析極強的親脂性化合物時可得到與反相LC 類似的保留特征，且流動相換為超臨界或亞臨界狀態的壓縮CO2，減少正相流動相中有害溶劑的使用。