氣相色譜-質譜聯用法測定茶葉包裝紙中9, 10-蒽醌含量

梁劍鋒，李 亞，魏詩琴，喬如穎，陳美伴

（梧州學院化學工程與資源再利用學院，廣西梧州 543002）

中國茶葉歷史悠久、種類繁多，深受國人喜愛。近年來中國的茶葉為更多世界各地人們所接受，據統計全球160 多個國家和地區30 多億人有飲茶的習慣[1]。茶葉的飲用安全一直以來是消費者和茶葉生產加工者共同關注的問題，其關鍵是確保飲用茶葉不會對人體構成任何的健康風險[2]。相關研究表明茶葉飲用是否安全主要受農藥殘留、重金屬殘留和真菌毒素等方面的影響[3]，而隨著研究的不斷深入，發現茶葉中含有新型的污染物如蒽醌、高氯酸鹽、鄰苯二甲酸酯類化合物[4?5]。2014年10月歐盟發布NO1146/2014 規定：茶葉中蒽醌最高限量為20 μg/kg[6]，這一規定出臺導致2014 年我國出口茶葉出現同比下降，其中輸出歐盟茶葉中不符合限量要求的27 批次茶葉中，因蒽醌超標多達8 批次而居首位[7]，蒽醌超標問題給我國茶葉出口帶來一定沖擊。

9,10-蒽醌是一種醌類化合物，容易溶解于苯、甲苯、乙醇、乙醚和氯仿等有機溶液，不溶于水，國際癌癥研究機構將其列為“對人類可能致癌”（2B 組）物質，對人體有一定毒性[8]；其常存在于高等植物和低等植物地衣類、真菌類代謝物中；9,10-蒽醌也可人工合成，主要用于染料生產的中間體，還是做紙制品印花的導氧劑[9]。目前，許多造紙企業將蒽醌作為添加劑在造紙過程中使用，有研究表明蒽醌可以通過包裝紙和硬紙板等纖維制品遷移到相應食品中而造成污染[10?11]。已報道的蒽醌檢測方法主要有紫外-可見分光光度法[12?15]、高效毛細管電泳法[16?17]、高效液相法[18?20]、氣相色譜-質譜法[21]、氣相色譜-串聯質譜法[22?25]及比色定量法[26?27]，尚無適用于茶葉包裝紙中蒽醌檢測方法。目前檢測包裝紙中蒽醌主要參考國標GB/T 230204-2008《茶葉中519 種農藥及相關化學品殘留量的測定氣相色譜-質譜法》中蒽醌的檢測方法[28]，但該方法為定性方法，且不適合包裝紙等富含植物纖維的復雜基質中微量蒽醌的測定。因此，基于對樣品前處理、優化色譜條件等手段，建立一種快速、準確、適合常見茶葉包裝紙基質的蒽醌氣相色譜-質譜內標定量分析方法，對研究茶葉中蒽醌來源，從而控制蒽醌污染物由包裝紙遷移至茶葉，保障茶葉消費者飲用安全，消除歐盟技術壁壘具有積極意義。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

茶葉包裝紙樣品 市場上購買的袋裝、紙籮裝、盒裝等紙質包裝茶葉，取其中的包裝紙（牛卡紙、銅版紙、特種紙、白紙板）作為分析研究樣品；9,10-蒽醌標準物品CAS 號：84-65-1，純度99.0% 德國DrEhrenstorfer 公司；D8-蒽醌CAS 號：10439-39-1，純度99.0% 美國TRC 公司；丙酮，色譜純 美國Honeywell 公司；正己烷，色譜純 德國Merck 公司；無水硫酸鎂，分析純 國藥集團化學試劑有限公司；SPE 小柱1000 mg/6 mL，弗羅里硅土 美國安捷倫公司。

Agilent Intuvo9000-7000D 三重四極桿氣相質譜聯用儀配電子轟擊離子化源及Masshunter 色譜處理軟件 美國安捷倫公司；Multi reax 渦旋混合器 德國heidolph 公司；X-30R離心機 德國Beckman公司；NAI-DCY-12G 氮吹儀 上海那艾精密儀器有限公司；CPA225D 型電子天平 德國Sartoriu 公司；Million Q 超純水器 美國Milli-pore 公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品前處理

1.2.1.1 樣品提取 將包裝紙樣品裁剪成小碎紙，混勻后分成兩份，一份用于檢測，另外一份保存在棕色樣品瓶中備用。取樣品0.50 g 于50 mL 聚乙烯離心管中，加入5.0 mL 超純水浸泡30 min，加入內標D8-蒽醌儲備液16.7 μL 和15.0 mL 丙酮-正己烷混合提取溶液（V+V=1+4），超聲提取30 min，加入3.0 g 無水硫酸鈉鎂，立即搖勻，然后置于冷凍離心機（轉速4000 r/min，溫度4 ℃）離心10 min。移取6.0 mL 上清液于15mL 離心管中，35 ℃氮氣吹干。2.0 mL 丙酮-正己烷洗脫液（V+V=1+39）溶解殘渣，待凈化[29]。

1.2.1.2 樣品凈化 首先用5.0 mL 丙酮-正己烷（V+V=1+39）洗脫液淋洗SPE 小柱，棄去流出液，然后上樣待凈化液，加入10.0 mL 丙酮-正己烷（V+V=1+39）洗脫液洗脫目標分析物，收集所有流出液于35 ℃氮氣吹干，1.0 mL 丙酮-正己烷（V+V=1+39）洗脫液溶解殘渣，過0.22 μm 有機濾膜于進樣小瓶，濾液供上機測定。

1.2.2 色譜條件 色譜柱：美國安捷倫科技有限公司DB-5MS 柱（20 m×0.18 mm×0.18 μm）；載氣：氦氣（純度≥99.999%）；流速：1.0 mL/min；進樣口溫度：280 ℃；進樣方式：不分流；進樣量：1 μL；柱溫箱升溫程序：初始溫度120 ℃，以30 ℃/min 升至280 ℃，保持3 min。

1.2.3 質譜條件優化 電離模式：電子轟擊（EI），70 eV；檢測模式：多反應監測（MRM），監測離子對和其他參數見表1；離子源溫度：230 ℃；傳輸線溫度：280 ℃；碰撞氣：高純氮氣，流量為1.0 mL/min；溶劑延遲：3 min。

表1 質譜儀檢測參數Table 1 Detection parameters of mass spectrometer

1.2.4 標準曲線繪制 稱取9,10-蒽醌標準品25.3 mg于25 mL 容量瓶中，用丙酮定容至刻度，然后用丙酮稀釋成 1.00 μg/mL 的9,10-蒽醌標準儲備液，置于4 ℃冰箱中避光保存。

稱取D8-蒽醌標準品10.1 mg 于10 mL 容量瓶中，用丙酮定容至刻度，然后用丙酮稀釋成 100 μg/mL的D8-蒽醌內標儲備液，置于4℃冰箱中避光保存。

臨用前，吸取10、20、50、100、200 μL 的9,10-蒽醌標準儲備液（1.00 μg/mL）于1.0 mL 容量瓶中，分別各加入5 μL 的 D8-蒽醌內標儲備液（100 μg/mL），用丙酮逐級稀釋成的濃度分別為10、20、50、100、200 ng/mL 的9,10-蒽醌標準使用液，D8-蒽醌內標濃度為0.50 μg/mL。以9,10-蒽醌濃度為橫坐標，定量離子對（208.0>180.0）的峰面積與內標峰面積比為縱坐標，繪制標準曲線。

1.3 數據處理

以保留時間和定性離子對定性，以定量離子對響應值進行定量，實驗數據、圖譜處理采用安捷倫氣質聯用儀自帶分析軟件MassHunter GC/MS Acquisition（版本B.07.06.2704，18-Jul-2017），圖表制作采用Origin7.5，試樣中9,10-蒽醌含量計算公式為

式中：w 為試樣中9,10-蒽醌的含量，mg/kg；A 為樣品溶液中9,10-蒽醌和D8-蒽醌的峰面積比；As為標準溶液中9,10-蒽醌和D8-蒽醌的峰面積比；ρs為標準溶液中9,10-蒽醌的質量濃度，μg/mL；V 為樣品提取溶液體積，mL；m 為試樣的質量，g。

計算結果以重復條件下獲得2 次獨立測定結果的算術平均值表示。

2 結果與分析

2.1 氣相色譜條件優化

2.1.1 色譜柱選擇 由于包裝紙富含植物纖維，基質較復雜，必須采用能夠把目標物與基質干擾物很好的分離的氣相色譜柱[30]。試驗目標分析物9,10-蒽醌為弱極性物質，根據被分析物質的物化性質及相似相溶原理，本文試驗考察DB-5MS、HP-5MS、VF-5MS、DB-1701P 四種不同型號弱極性氣相色譜柱分離檢測效果。通過檢測加標茶葉包裝紙（加標量：100 ng/mL）及改變色譜條件觀察目標物與干擾物分離情況評價色譜柱效果，不同色譜柱對目標物分離情況見圖1～圖4。

圖1 DB-5MS 色譜柱總離子流圖Fig.1 Total ion flow diagram of DB-5MS column

試驗考察的DB-5MS、HP-5MS、VF-5MS、DB-1701P 四款色譜分離柱均屬于弱極分離柱，其中DB-5MS、HP-5MS、VF-5MS 三款色譜柱在分離性能上近似等同于以（5%-苯基）-甲基聚硅氧烷為填充物的色譜柱。四款色譜柱在具體填充料上有所區別：DB-5MS 色譜柱填充料為5%苯基和95%二甲基亞芳基硅氧烷，HP-5MS 色譜柱填充料為5%苯基和95%二甲基聚硅氧烷，VF-5MS 色譜柱填充料為高惰性5%苯基甲基聚硅氧烷，DB-1701P 色譜柱填充料為（14%-氰丙基-苯基）-甲基聚硅氧烷。四款色譜柱由于在填充料方面組成不同，導致它們在對目標分析物9,10-蒽醌進行分離時，在出峰時間、響應值、基線分離等關鍵性能指標上存在一定差別。對比上面四個不同色譜柱的總離子流圖可以發現：DB-5MS色譜柱的出峰時間比其他兩款色譜柱明顯要快，在響應值、基線分離方面與其他三款色譜柱差別不大，而且由于DB-5MS 色譜柱具有極低柱流失特性，更適合在GC/MS/MS 上檢測目標物9,10-蒽醌，因此試驗采用DB-5MS 色譜柱進行分離檢測。

圖2 HP-5MS 色譜柱總離子流圖Fig.2 Total ion flow diagram of HP-5MS column

圖3 VF-5MS 色譜柱總離子流圖Fig.3 Total ion flow diagram of VF-5MS column

圖4 DB-1701P 色譜柱總離子流圖Fig.4 Total ion flow diagram of DB-1701P column

2.1.2 進樣口溫度選擇 氣相色譜進樣口溫度選擇過高，會導致樣品中目標分析物9,10-蒽醌在進樣口分解，降低回收率而影響結果的準確性和靈敏度；而進樣口溫度選擇過低，則導致樣品中目標分析物9,10-蒽醌未完全汽化，同樣影響結果的準確性和靈敏度。本文實驗考查240～300 ℃之間的進樣口溫度，以目標分析物9,10-蒽醌的質譜響應值大小為考核指標（每個溫度重復測定2 次取平均值），結果見圖5。

圖5 不同進樣口溫度對9,10-蒽醌響應值影響Fig.5 Effect of different inlet temperature on 9,10 anthraquinone response values

從圖5 可以發現，隨著進樣口溫度從240 ℃開始升高，9,10-蒽醌在質譜的響應值持續增大，說明在一定的溫度范圍內，增加進樣口溫度能夠提高樣品中9,10-蒽醌目標分析物的汽化率，同時增加檢測響應值；進樣口溫度超過270 ℃后，隨著溫度升高，9,10-蒽醌在質譜中的響應值出現下降的趨向，原因可能是由于進樣口溫度過高，樣品中的部分9,10-蒽醌在進樣口部分被分解，導致響應值出現下降。綜合分析，采用270 ℃作為進樣口溫度比較合適[31]。

2.2 質譜條件優化

本實驗在色譜條件優化后進行全掃描（Scan）得到目標分析物9,10-蒽醌的質譜圖（見圖6），選擇質核比大，相對豐度比較高的作為目標產物離子，然后采用多反應檢測方式掃描（MRM）。根據目標物離子信息，結合檢測靈敏度，最終選擇208.0>152.0 為定性離子對，208.0>180.0 為定量離子對，選取10 eV、22 eV 分別作為定量和定性離子對的碰撞能量。

圖6 9,10-蒽醌離子流圖和質譜圖Fig.6 Ion flow and mass spectra of 9,10-anthraquinone

2.3 線性范圍及方法檢出限

按照本文1.3 的實驗條件進行測定，以9,10-蒽醌的濃度為橫坐標，以定量離子對的峰面積與內標峰面積比值為縱坐標，制作標準曲線。以3 倍信噪比（S/N）計算出檢出限（limit of detection，LOD），10 倍信噪比計算出定量限（limit of quantity，LOQ）。

結果表明，9,10-蒽醌在10～200 ng/mL 的質量濃度范圍內具有良好的線性關系，線性回歸方程為Y=0.23249X+0.001203，擬合度R2為0.9989，方法檢出限為3 μg/kg，定量限為10 μg/kg。

2.4 樣品基質效應考查

選擇氣相色譜質譜聯用方法測定樣品，包裝紙樣品的某些基質可能會對目標物的離子具有較強的增強或抑制效應，因此選擇內標法定量分析目標物具有較高的靈敏度和準確性。制備四種不同空白基質樣品溶液，對空白樣品進行10、50、100 ng/mL 3 個濃度的添加水平實驗，樣品不添加蒽醌D8內標采用外標標準曲線進行定量分析，外標法標準曲線：y=0.564516x+0.001421，擬合度R2為0.9950，具體結果見表2。

在采用外標曲線定量情況下，分別考察采用丙酮、空白基質溶液配制9,10-蒽醌加標濃度為10、50、100 ng/mL 的樣品，從表2 結果可以看出，它們在加標回收率、相對標準偏差方面相差不大，試驗說明可以采用丙酮作為9,10-蒽醌標準工作曲線的配制溶劑，其效果與采用空白基質樣品配制的標準工作曲線不存在明顯差異。

2.5 實際樣品加標回收率和精密度

選取未檢出9,10-蒽醌的牛卡紙、銅版紙、特種紙、白紙板4 種茶葉包裝紙樣品，各稱取0.5 g 于500 mL 離心管中，分別添加質量濃度為10、50、100 ng/mL 標準溶液，每個添加水平取6 份平行樣，充分混勻后，按照最佳前處理和色譜分析條件進行測定，回收率處于89.3%～98.7%范圍，相對標準偏差（RSD）為3.01%～4.42%，具體結果見表3；由于目前茶葉包裝紙中9,10-蒽醌檢測尚未有相應國家標準方法，參考茶葉中蒽醌檢測的進口檢測方法SN/T 4777-2017,與試驗方法做同樣的加標回收試驗，具體結果見表4。

表3 9,10-蒽醌加標回收率和相對標準偏差（n=6）Table 3 Recovery and relative standard deviation of 9,10-anthraquinone

表4 方法SN/T 4777-2017 試驗回收率和相對標準偏差（n=6）Table 4 Recovery and relative standard deviation of method SN/T 4777-2017 (n=6)

從以上試驗數據可以發現，本文試驗方法與參考方法SN/T 4777-2017 在加標回收率、相對標準偏差方面結果接近，表明該試驗方法符合GB/T 27404-2008《實驗室質量控制規范 食品理化檢測》中回收率和精密度的要求[32]。

2.6 實際樣品測定

隨機采集市場銷售茶葉包裝紙20 份，其中牛卡紙、銅版紙、特種紙、白紙板各5 份。其中蒽醌檢出率9 份，檢出率45%。牛卡紙檢出率最高為60%，銅版紙檢出率最低為20%。通過實際樣品檢測結果可以看出，茶葉包裝紙確實含有9,10-蒽醌污染物，存在遷移到茶葉的安全風險。本文的試驗方法適用于茶葉包裝紙中9,10-蒽醌的檢測。

3 結論

本文通過對四種常見茶葉包裝材質牛卡紙、銅版紙、特種紙、白紙板進行樣品前處理和色譜條件優化，實現了對茶葉常見四種包裝材料中9,10-蒽醌的測定。該方法在10～200 ng/mL 質量濃度范圍內具有良好的線性關系，線性回歸方程為Y=0.23249X+0.001203，擬合度R2為0.9989，方法檢出限為3 μg/kg，定量限為10 μg/kg，加標回收率在89.3%～98.7%之間，相對標準偏差（RSD）為3.01%～4.42%，達到較好檢測效果。方法具有簡單易操作、線性范圍寬、靈敏度高、抗干擾能力強等優點，能夠滿足對茶葉中蒽醌污染源包裝紙中9,10-蒽醌的分析檢測要求，適用于茶葉包裝紙中蒽醌污染的監測與控制。