羅伊氏乳桿菌對發(fā)酵魚糜揮發(fā)性風味物質的影響

江 鋒，鄭心茹，周常義，江曉穎，林偉言，劉 玉，蘇文金，蘇國成,

（1.廈門中集信檢測技術有限公司，福建廈門 361100；2.集美大學食品與生物工程學院，福建廈門 361021）

發(fā)酵食品由來已久，具有獨特風味、豐富營養(yǎng)和耐保藏等特色，是廣受歡迎的食品[1]。其中發(fā)酵水產(chǎn)品近年來逐漸受到關注，應用生物發(fā)酵技術對傳統(tǒng)魚糜制品、魚塊、全魚等進行了廣泛研究。國內(nèi)外學者研究發(fā)現(xiàn)在魚糜制作過程中添加有益微生物，不僅能抑制葡萄球菌、假單胞菌等雜菌的生長，減少生物胺的積累，還能增強魚糜制品的凝膠強度，碳水化合物與脂肪降解后產(chǎn)生的有機酸、醇、酮等化合物可以去除魚肉的土腥味，賦予魚糜制品特殊的發(fā)酵香氣[2?3]。

目前國內(nèi)外對食品中揮發(fā)性成分的研究常采用同時蒸餾萃?。╯imultaneous distillation extraction，SDE）、溶劑萃取、固相微萃取（solid-phase microextraction，SPME）、超臨界萃取等提取技術及氣相色譜、氣相色譜-質譜聯(lián)用（Gas Chromatograph-Mass Spectrometry，GC-MS）、飛行時間質譜（TOFMS）、電子鼻等分析鑒定技術[4]。SDE 法利用相似相溶原理，對揮發(fā)物進行富集。龍斌等[5]采用SDE 法對樣品中揮發(fā)性風味成分進行提取，從川鯰腹肉和背肉中分別檢測出67 和45 種揮發(fā)性風味成分。Forehand等[6]采用SDE 法提取豆醬中揮發(fā)性物質，用DBwax 色譜柱進行洗脫分離，鑒定出了91 種揮發(fā)性物質。Kesen 等[7]采用蒸餾萃取法提取橄欖油中揮發(fā)性物質，用二氯甲烷做溶劑，并用DB-wax 色譜柱進行芳香物質的分離，每種樣品分離鑒定出12～14 種主要的芳香成分。劉佳等[8]采用固相微萃取對鮮牡蠣肌肉風味化合物進行了濃縮，并用HP-5MS 彈性毛細管色譜柱進行風味物質的分離，檢出了24 種呈味物質，主要是醛類、酸類、醇類、烯類等化合物。

本研究采用篩選出的適宜魚糜發(fā)酵的優(yōu)良菌株接種到魚糜中進行發(fā)酵，探索其產(chǎn)生風味物質的變化規(guī)律。根據(jù)前期的實驗基礎，利用已分離篩選具有降解亞硝酸鹽能力的羅伊氏乳桿菌[9]，加入到魚糜中制作發(fā)酵魚糜，采用SDE 法結合GC-MS 技術檢測發(fā)酵魚糜的揮發(fā)性風味物質，比較自然發(fā)酵魚糜與羅伊氏乳桿菌法加工發(fā)酵魚糜的風味物質變化，以期為開發(fā)新型發(fā)酵魚糜制品提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

金線魚魚糜 AAA 級，福建泉州龍富港水產(chǎn)品有限公司；羅伊氏乳桿菌R6 本實驗室分離保存菌株；MRS 固（液）體培養(yǎng)基 廣東環(huán)凱生物科技有限公司；乙醚 優(yōu)級純，國藥集團；Na2SO4分析純，國藥集團。

PHX150 生化培養(yǎng)箱 寧波萊福科技有限公司；Bag Mixer 400VW 均質器 法國INTERSCIENCE公司；TP-1102/214 電子分析天平、PB-10 pH 計 德國賽多利斯公司；500 mL 同時蒸餾萃取設備 廈門市集美區(qū)仕富玻璃廠；Varian320-MS 氣相色譜-質譜聯(lián)用儀 美國Varian 公司；OA-SYS 氮吹儀 美國Organomation 公司；RE-52AA 旋轉蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品制備 自然發(fā)酵魚糜：將冷凍魚糜解凍后，將水分調(diào)整為80%，空擂5 min，按魚糜質量添加3%食鹽和適量淀粉，繼續(xù)擂潰10 min。擂潰過程中控制魚糜樣品溫度不超過10 ℃[10?11]。30 ℃放置30 h，45 ℃水浴1 h 后轉移至90 ℃水浴20 min，加熱完成后立即置于冰水浴中冷卻，在4 ℃冰箱冷藏過夜。

乳酸菌法發(fā)酵魚糜[9,12]：以羅伊氏乳桿菌R6 為發(fā)酵劑，在食鹽擂潰前按1%的接種量接種菌株R6（108CFU/mL），其余步驟與自然發(fā)酵法相同。

1.2.2 揮發(fā)性風味物質的富集 在SDE 裝置右側的燒瓶中加入稱取10 g 已發(fā)酵樣品，加入200 mL 蒸餾水。在SDE 裝置左側的燒瓶中加入重蒸后的乙醚50 mL。打開冷卻水，將電熱套設置為110 V，加熱試樣燒瓶；將水浴溫度設定為50 °C 以加熱溶劑瓶，當兩邊稍微煮沸時，提取2 h。提取完成后，首先關閉電熱套和水浴的電源，等待冷卻，然后關閉冷卻水。冷卻后，收集U 形管中的溶劑并合并到含溶劑的蒸餾瓶中。提取完成后，將200 mL 蒸餾水加入到樣品瓶中，并將50 mL 再蒸發(fā)的乙醚加入到溶劑瓶中，然后根據(jù)上述用于添加樣品的提取方法進行30 min 的提取。向合并的提取物中加入適量的無水Na2SO4，在冰箱中冷凍過夜并過濾。將提取物在減壓下蒸餾至5 mL，然后用氮吹儀將氮氣吹至0.5 mL。過膜裝入小瓶中，并通過氣相色譜-質譜法分析濃縮物[13]。

1.2.3 GC-MS 分析方法 色譜和質譜條件根據(jù)參考文獻和預實驗條件進一步優(yōu)化[7,13]。

色譜條件：色譜柱使用VF-17ms 毛細管柱（30 m，0.25 mm，0.25 μm）；入口溫度：250 °C；升溫步驟：在35 ℃保持1 min，以5℃/ min 升溫至60℃保持1 min，6 ℃/ min 升溫至140℃ 保持1 min，最后8 ℃/min升溫至230 ℃保持5 min；載氣：氦氣；流速1.0 mL/min；恒速，分流比1:20。

質譜條件：離子源溫度：200 ℃，電子能量70 eV，質量掃描范圍35～350 m/z，無溶劑去除時間。

1.3 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)處理和質譜檢索：通過質譜儀工作站，運用NIST 譜庫檢索人工比對對GC-MS 采集得到的質譜數(shù)據(jù)進行檢索。通過面積歸一化法分析每個組分的相對含量。顯著性水平設為P<0.05。

2 結果與分析

2.1 發(fā)酵魚糜的揮發(fā)性物質總離子流圖

采用同時蒸餾萃取法分離，提取和濃縮各樣品中揮發(fā)性物質，并結合GC-MS 檢測法在上述條件下分析自然發(fā)酵魚糜和乳酸菌法發(fā)酵魚糜的風味物質變化。圖1 和圖2 顯示了兩種發(fā)酵方式魚糜樣品的總離子色譜圖。乳酸菌法發(fā)酵魚糜的總離子強度比自然發(fā)酵魚糜的總離子強度高，而且產(chǎn)生的物質相對更多。

圖1 自然發(fā)酵魚糜總離子流色譜圖Fig.1 Total ion flow diagram of naturally fermented surimi

圖2 乳酸菌發(fā)酵魚糜總離子流色譜圖Fig.2 Total ion flow diagram of fermented surimi by lactic acid bacteria

2.2 不同方式發(fā)酵后魚糜風味物質含量和分析

搜索數(shù)據(jù)庫分析，取大于80%以上相似度的揮發(fā)性風味物質鑒定出樣品魚的不同揮發(fā)性成分，結果見表1 和圖3?？梢钥闯?，發(fā)酵魚糜的主要揮發(fā)性成分中的51 個組分是飽和或不飽和的醛類、酯類、醇類、烴類和其他物質。在乳酸菌法發(fā)酵魚糜中檢測到37 種揮發(fā)性化合物，在自然發(fā)酵魚糜中檢測到25 種揮發(fā)性物質。這兩種不同的發(fā)酵方式在主要呈味成分種類以及含量方面有一定的區(qū)別。乳酸菌法加工發(fā)酵魚糜中醛類、醇類的數(shù)量較多，相對含量較高，這與自然發(fā)酵方法的樣品有所區(qū)別，也許與乳酸菌的蛋白酶和脂肪酶加速蛋白質和脂肪的分解，產(chǎn)生大量的游離氨基酸和脂肪酸，并形成獨特的揮發(fā)性物質有關[14?17]。

表1 發(fā)酵魚糜揮發(fā)性成分的GC-MS 分析結果Table 1 GC-MS analysis of volatile components from fermented surimi

續(xù)表 1

圖3 發(fā)酵魚糜中揮發(fā)性化合物的種類及相對含量Fig.3 Composition and relative content of compound classes in fermented surimi

我國已批準羅伊氏乳桿菌可作為人類保健品的微生物菌種，該菌具有很高的理論研究和生產(chǎn)應用價值[16]。在動物飼料、食品等方面有較多關于羅伊氏乳桿菌應用的研究報道，添加羅伊氏乳桿菌對于產(chǎn)品的感官、風味、品質的提升有一定作用[17?18]。

本研究中比較了羅伊氏乳桿菌發(fā)酵魚糜與自然發(fā)酵魚糜中揮發(fā)性風味物質的區(qū)別，在兩種發(fā)酵魚糜中，羅伊氏乳桿菌法發(fā)酵魚糜揮發(fā)性物質中酯類、酸類和烷烴類物質含量明顯高于自然發(fā)酵魚糜，含量分別是自然發(fā)酵魚糜中占揮發(fā)性物質的1.20%和2.72%和1.56%，乳酸菌發(fā)酵魚糜中占揮發(fā)性物質的21.83%、14.86%和14.98%；羅伊氏乳桿菌法發(fā)酵魚糜中醇類稍高于自然發(fā)酵魚糜，分別為16.37%和11.35%；自然發(fā)酵魚糜的酮類和醛類略高于羅伊氏乳桿菌法發(fā)酵魚糜，前者的酮類和醛類分別為4.51%和15.93%，后者分別為1.69%和11.69%。

近年來，在發(fā)酵酸魚方面有一系列研究報道，例如Xu 等[14]采用植物乳桿菌、木糖葡糖球菌和釀酒酵母混合菌發(fā)酵酸魚，發(fā)現(xiàn)在發(fā)酵過程中，醛類、酸類、醇類、酯類、酮類的含量在不斷增加。Zang 等人[15]在低鹽酸魚發(fā)酵方面的研究表明，添加的菌種對產(chǎn)生磷脂分子種類有影響，其中接種了釀酒酵母和混合發(fā)酵劑的酸魚，產(chǎn)生的磷脂分子比未添加釀酒酵母多。臧金紅[19]采用混合接種對鯉魚進行發(fā)酵，篩選出9 中酸魚特征風味物質，分別為乳酸乙酯、十六酸乙酯、苯甲醛和異戊酸等化合物，發(fā)現(xiàn)這些物質與關鍵微生物的演替有關。這些研究表明發(fā)酵產(chǎn)品風味的形成與所添加的菌種有相關性，這與本研究的結果相似。

2.2.1 酯類化合物 酯類化合物是常見的揮發(fā)性風味成分，由于較低的氣味閾值，檢出酯類可以賦予制品果香味[20]。本研究中，乳酸菌發(fā)酵魚糜相對于自然發(fā)酵的魚糜酯類的含量大幅度提高，風味明顯優(yōu)于傳統(tǒng)發(fā)酵魚糜。其中在乳酸菌發(fā)酵魚糜中含量較高的乙酸乙酯、乙烯乙酯、甲酸乙酯、異戊酸乙酯等在自然發(fā)酵的魚糜中均未檢出，其中乙烯乙酯的含量達10.24%。

高沛[21]研究微生物與酸魚中揮發(fā)性物質的關系，比較了植物乳桿菌、木糖葡糖球菌和釀酒酵母單一菌株分別接種魚體發(fā)酵和自然發(fā)酵的方法，結果表明，接種乳酸桿菌組的脂類物質含量最高，乙酸乙酯、乙酸-3-甲基丁酯、己酸乙酯等是酸魚的關鍵氣味成分。與本研究中乳酸菌發(fā)酵魚糜的脂類物質大量增加有類似情況。

2.2.2 酸類化合物 在傳統(tǒng)的發(fā)酵魚肉腸中，酸類物質含量很低，碳原子數(shù)小于六的為短鏈的脂肪酸，它具有強烈的酸度和香氣，對風味影響很大[22]。低價值的魚肉酸味和奶酪味道主要是由于這些酸的增加。它們除了主要來源于氨基酸的代謝，還可能來自碳水化合物的分解。吳海燕等[23]在研究發(fā)酵劑對咸魚的影響發(fā)現(xiàn)乙酸、丁酸、異丁酸和戊酸的濃度隨著發(fā)酵時間的增加而逐漸增加。在本研究中，自然發(fā)酵魚糜的乳酸菌發(fā)酵的魚糜中酸類物質含量分別為2.72%和14.86%，可見酸類物質顯著提高，乳酸菌發(fā)酵魚糜中乙酸、2-乙基丁酸、硫代乙酸含量明顯高于自然發(fā)酵魚糜，乳酸菌發(fā)酵魚糜的酸味和奶酪味明顯優(yōu)于自然發(fā)酵魚糜，這也許是因為羅伊氏乳桿菌為異型乳酸發(fā)酵，而且在代謝過程中，產(chǎn)生乳酸、乙酸等不同酸類物質，同時與乳酸菌分解蛋白質，產(chǎn)生多種代謝產(chǎn)物有關系。

2.2.3 醇類化合物 在本研究中檢出正己醇、1-辛烯-4-醇、1-辛烯-3-醇、1-戊烯-3-醇等醇類化合物，為主要的風味物質。自然發(fā)酵魚糜中檢出4-甲基-1-戊烯-3-醇、3-甲基-2-丁醇、2-戊醇、3-十六醇，而乳酸菌法發(fā)酵魚糜中未檢出這些物質；乳酸菌法發(fā)酵魚糜中檢出1-戊烯-3-醇、正己醇、異十三醇、環(huán)十二醇，但在自然發(fā)酵魚糜中未檢出這些物質。乳酸菌法發(fā)酵魚糜中1-辛烯-3-醇、1-辛烯-4-醇、3-甲基-1-丁醇的含量低于自然發(fā)酵魚糜。醇類的分子結構會影響其香氣強度、特征和類型。低級脂肪醇指7 個碳原子以內(nèi)的醇，一般沒有什么特殊的香氣，當碳原子數(shù)增加到12 時，呈現(xiàn)出比較特別的香氣，但當醇的碳原子數(shù)高于12 時香氣又會消失不見[21]。1-辛烯-3-醇對發(fā)酵樣品中的醇類對肉類風味的形成有一定作用，具有蘑菇香氣和類似的金屬味，是日本 fish miso和臭鮭魚的關鍵風味之一[24?25]。有研究認為1-辛烯-3-醇與鮮魚的腥味有關[19]，本研究中通過添加羅伊氏菌發(fā)酵，該物質含量降低，魚腥味有一定減緩作用。1-戊烯-3-醇香氣特征是果香和蔬菜香[21]。羅伊氏乳桿菌發(fā)酵生產(chǎn)醇類物質的來源除了與碳水化合物分解有關外，還可能通過脂類代謝途徑產(chǎn)生[26]。

2.2.4 醛酮類物質 本研究中兩種發(fā)酵魚糜中，自然發(fā)酵法中揮發(fā)性物質醛類和酮類物質均高于乳酸菌發(fā)酵魚糜，其中，正己醛含量分別為13.53%和8.16%，2-甲基-3-戊酮含量分別為3.74%和未檢出。醛類的閾值較低，賦予食物清香和果香的芳香特質，其風味取決于醛的濃度。魚的主要揮發(fā)性風味化合物是羰基化合物。N-己醛在淡水魚和海水魚中均有，具有青草味，它通常與C8-揮發(fā)性化合物混合并有助于魚的香氣[27]。在發(fā)酵過程中，醛類化合物可以通過脂質過氧化或降解產(chǎn)生，也可以通過氨基酸降解或醛酸途徑產(chǎn)生。本研究中兩種發(fā)酵魚糜均檢出的具有青草味的是正己醛，且含量相對較高；自然發(fā)酵魚糜中檢出苯甲醛，有特殊的杏仁氣味，這些物質對于產(chǎn)品的風味有一定作用。酮類物質通常是脂肪氧化和美拉德反應的產(chǎn)物，酮類物質具有清香味、奶油味和果香味。酮類物質閾值一般比醛類物質高，本研究中檢測出的酮類物質含量和種類均較少，推測對發(fā)酵魚糜氣味的貢獻較小。

2.2.5 其他化合物 烴類化合物主要來源于脂肪酸烷氧自由基的均裂[28]，有學者認為對魚露的溶劑味有貢獻的是一些烷基苯和支鏈烷基[22]。在本研究中檢測到的一定含量烷烴，由于烷烴的閾值較高[29]，預計這些物質對產(chǎn)品整體風味貢獻不大的。

3 結論

通過比較不同方法發(fā)酵魚糜的風味物質發(fā)現(xiàn)，醛類、醇類和酮類是構成發(fā)酵魚糜獨特風味的主要成分。本研究添加羅伊氏乳桿菌發(fā)酵的魚糜中檢測到總共37 種具有不同風味特征的物質，主要特征物質有乙酸、正己醛、1-辛烯-3-醇和乙酸乙酯等。自然發(fā)酵魚糜中共檢出25 種揮發(fā)性物質。羅伊氏乳桿菌法發(fā)酵魚糜中酯類、酸類、烷烴類和醇類物質含量均高于自然發(fā)酵魚糜。乳酸菌法發(fā)酵魚糜提高了魚肉感官品質，產(chǎn)品具有特殊的風味，因此采取乳酸菌法發(fā)酵魚糜的加工方法不僅有利于縮短加工時間，而且增強產(chǎn)品的獨特風味，使產(chǎn)品質量明顯提高。

在揮發(fā)性物質萃取方面，本研究采用SDE 法，后續(xù)研究可考慮采用HS-SPME 或其他方法進行萃取；在檢測設備方面，本研究采用GC-MS 方法，今后可結合GC-O、電子鼻等設備，更全面分析發(fā)酵魚糜中揮發(fā)性物質；在研究方法方面，可結合代謝組學方法研究其代謝通路，以更全面了解發(fā)酵魚糜的揮發(fā)性化合物的產(chǎn)生機制。