響應(yīng)面優(yōu)化馬骨髓蛋白的提取工藝及其抗氧化活性研究

吾哈麗妮薩·麥麥提托合提，帕爾哈提·柔孜，楊曉君，瑪依熱·哈斯木江，鄧 杰，阿卜杜薩拉木·阿卜杜凱尤木，阿卜杜瓦哈普·伊米提，王 娟

（新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與藥學(xué)學(xué)院，新疆烏魯木齊 830052）

新疆是我國傳統(tǒng)的五大牧區(qū)之一，擁有豐富的牧業(yè)資源，具有地方多年培育的優(yōu)勢(shì)畜牧品種，伊犁馬是其中之一[1?2]。新疆的馬存欄及馬肉產(chǎn)量在全國馬產(chǎn)業(yè)中占有重要地位[3]，據(jù)新疆統(tǒng)計(jì)年鑒記載，2018 年新疆的馬存欄數(shù)68.61 萬匹、肉類產(chǎn)量6.17 萬噸[4]，按馬骨占酮體20%～25%算，可利用資源相當(dāng)豐富。伊犁馬是我國主要乳肉兼用型馬品種，其副產(chǎn)物骨髓具有較好的開發(fā)前景。馬骨中蛋白質(zhì)和各類礦物質(zhì)含量較高，顯出多種生物活性[5?6]。有報(bào)道顯示，馬骨富含膠原蛋白、蘋果酸鈣等活性物質(zhì)，且具有較好的抗骨質(zhì)疏松作用[7]，但相關(guān)構(gòu)效關(guān)系和產(chǎn)品研發(fā)工作尚處于初級(jí)階段。長期以來，由于對(duì)馬骨類資源的藥用開發(fā)和關(guān)注程度不足，骨中豐富的蛋白類成分一直未能開發(fā)利用，導(dǎo)致資源的浪費(fèi)[8]。因此，研究其具有食藥保健功能的蛋白類成分、優(yōu)化制備工藝、鑒定多肽序列及發(fā)現(xiàn)新活性多肽對(duì)提高馬骨的高值化利用和開發(fā)新型骨髓蛋白產(chǎn)品，帶動(dòng)地方特種畜產(chǎn)品經(jīng)濟(jì)、提升產(chǎn)業(yè)鏈有重要意義。

動(dòng)物源性蛋白或酶解物因其藥理活性強(qiáng)、劑量小、穩(wěn)定性高、易吸收等特點(diǎn)，是開發(fā)各類保健食品或天然抗氧化劑研發(fā)的熱點(diǎn)[9?10]。然而，多肽的分離步驟繁瑣，在提取分離過程中保持蛋白原有的結(jié)構(gòu)和活性是其純化、活性研究和結(jié)構(gòu)鑒定的關(guān)鍵[11]。因此，需要以活性為導(dǎo)向采用適宜的提取方法和結(jié)合綠色的分離技術(shù)制備蛋白才能順利進(jìn)入產(chǎn)業(yè)化開發(fā)階段，同時(shí)能闡明多肽構(gòu)效關(guān)系。動(dòng)物源性蛋白的提取方法主要有等電點(diǎn)沉淀法、熱壓浸提法、酶提法和水提法等[10?12]。但上述方法均存在一定的弊端，所得的蛋白含量低，生物活性不明顯[13]。動(dòng)物骨骼化學(xué)成分主要以蛋白質(zhì)、多肽、油脂、礦物質(zhì)和硫酸軟骨素等為主[14]，其中蛋白含量較高，現(xiàn)代藥理研究表明，上述成分具有抗氧化、抗菌、降血壓、降血脂、補(bǔ)血、免疫調(diào)節(jié)及防治骨質(zhì)疏松等多種生物活性[15]。目前，對(duì)馬骨蛋白類成分和活性方面針對(duì)性研究較少，影響了馬副產(chǎn)物-骨髓類保健功能食品標(biāo)準(zhǔn)化及產(chǎn)業(yè)化開發(fā)步伐。前期研究顯示，馬骨髓蛋白和微量元素含量高于馬骨[16]。為此，本實(shí)驗(yàn)在前期研究結(jié)果的基礎(chǔ)上，將馬骨質(zhì)和骨髓分開，以馬骨髓為重點(diǎn)，開展提取方法篩選、提取工藝優(yōu)化試驗(yàn)來建立其蛋白制備工藝技術(shù)和評(píng)價(jià)體系，為動(dòng)物源性蛋白類物質(zhì)基礎(chǔ)研究方法和制定藥材標(biāo)準(zhǔn)提供新思路。

動(dòng)物骨類蛋白多種生物活性中抗氧化作用較為顯著。研究發(fā)現(xiàn)動(dòng)脈粥樣硬化、關(guān)節(jié)炎、帕金森病、癌癥、衰老等疾病和促礦物質(zhì)吸收、免疫調(diào)節(jié)、抑菌、抗血栓和抗高血壓等作用都與體內(nèi)外活性氧含量高低或生理代謝過程中產(chǎn)生的自由基含量相關(guān)[17?18]?；钚缘鞍锥嚯闹邪被岬倪B接方式及肽的結(jié)構(gòu)特征會(huì)影響其活性[19]。前期研究得出羊骨、牛骨蛋白提取物均具有抗氧化活性[20?21]，作為同類家畜，馬骨是否具有抗氧化活性需要系統(tǒng)的評(píng)價(jià)。因此，本研究以蛋白濃度和1,1-二苯基-2-三硝基苯（DPPH）自由基清除率為考察指標(biāo)，采用綜合評(píng)分結(jié)合響應(yīng)面法篩選馬骨髓蛋白最佳提取工藝，通過測(cè)定最佳工藝條件下制備的馬骨髓蛋白對(duì)DPPH·、羥自由基（·OH）、超氧陰離子自由基（）、2,2'-聯(lián)氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸（ABTS）自由基的清除率和總還原能力，研究其體外抗氧化活性，旨在為馬骨髓蛋白的進(jìn)一步分離純化、結(jié)構(gòu)鑒定和功能因子的開發(fā)提供參考。

1 材料與儀器

1.1 材料與儀器

馬骨 購買于烏魯木齊華凌牛羊肉批發(fā)市場(chǎng)D 座（防疫 鑒定），經(jīng)中國科學(xué)院新疆生態(tài)與地理研究所阿布力米提·阿布都卡迪爾研究員鑒定為“新疆伊犁馬骨”，保存于新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)626 生物大分子實(shí)驗(yàn)室；牛血清蛋白 E-BC-K318-MElabscience 公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH·）、2,2’-聯(lián)氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸（ABTS） 上海麥克林生化試劑有限公司；Tris-HCl 緩沖液（pH8.2 分析純） 武漢塞維爾生物科技有限公司；鄰苯三酚（分析純） 天津市大茂化學(xué)試劑廠；硫酸亞鐵、水楊酸、鐵氰化鉀、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉（均為分析純） 天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司；無水乙醇、三氯乙酸（TCA）、鐵氰化鉀（均為分析純） 天津市北辰方正試劑廠；雙氧水、乙醇、石油醚、甲醇（均為分析純） 上海德榜化工有限公司。

DF-101S 磁力攪拌器 上海興創(chuàng)科學(xué)儀器設(shè)備有限公司；LGJ-12 多岐管型真空冷凍干燥機(jī) 上海騰方儀器設(shè)備有限公司；UV 2550 紫外分光光度計(jì) 島津公司；SF-TDL-40D 高速離心機(jī) 上海菲恰爾分析儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 馬骨髓蛋白的提取 馬骨預(yù)處理：取馬骨中的骨髓樣品，用蒸餾水沖洗3 次，去除碎骨頭，加1:5 比例液氮粉碎成粉末，骨髓粉末置于燒杯，存于?40 ℃度冰箱，備用。

工藝流程：馬骨粉末→溶劑提?。ù帕嚢杌亓鳎忠郝┒贩蛛x油水（收集提取物）層→取油層→再提取→合并濾液→ 脫脂（石油醚）→濃縮（1/4）→透析（48 h）→冷凍干燥→骨髓蛋白粉

1.2.2 單因素實(shí)驗(yàn) 提取溶劑篩選：取三組5 g 馬骨髓粉末，分別以水、磷酸緩沖溶液（PBS，pH6.6）及Tris-HCl（pH8.2）作為溶劑進(jìn)行馬骨髓蛋白的提取，其中提取溫度45 ℃、提取時(shí)間2 h、料液比1:20 g/mL，提取次數(shù)1 次，收集提取液，離心（5000 r/min、10 min），冷凍干燥。以馬骨髓蛋白得率、蛋白濃度及DPPH自由基清除率為指標(biāo)，篩選最佳提取溶劑。

取5 g 馬骨髓粉末，固定提取時(shí)間2 h，提取料液比1:20 g/mL，提取1 次，各磁力攪拌1 次/2 h。研究不同提取溫度（30、35、40、45、50 ℃）對(duì)馬骨髓蛋白濃度及DPPH 自由基清除能力的影響。

取5 g 馬骨髓粉末，固定提取溫度50 ℃，提取料液比1:20 g/mL，提取1 次，各磁力攪拌1 次/2 h。研究不同提取時(shí)間（1、2、3、4、5 h）對(duì)馬骨髓蛋白濃度及DPPH 自由基清除能力的影響。

取5 g 馬骨髓粉末，固定提取溫度50 ℃，提取時(shí)間2 h，提取1 次，各磁力攪拌1 次/2 h。研究不同料液比（1:10、1:15、1:20、1:25、1:30 g/mL）對(duì)馬骨髓蛋白濃度及DPPH 自由基清除能力的影響。

取5 g 馬骨髓粉末，固定提取溫度50℃，提取時(shí)間2 h，提取料液比1:20 g/mL。研究不同提取次數(shù)（1、2、3、4、5 次）對(duì)馬骨髓蛋白濃度及DPPH 自由基清除能力的影響。

1.2.3 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì) 在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，根據(jù)設(shè)計(jì)Box-Behnken 原理，以提取溫度、提取時(shí)間、料液比及提取次數(shù)為因素，馬骨髓蛋白綜合得分為響應(yīng)值設(shè)計(jì)試驗(yàn)，響應(yīng)面試驗(yàn)中各因素的水平見表1。

表1 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)因素水平表Table 1 Factors and levels of response surface experiment

1.2.4 蛋白得率的計(jì)算 準(zhǔn)確稱取一定量的馬骨髓粉末（m），進(jìn)行提 取，凍干，得到馬骨髓蛋白粉末（M）。根據(jù)下式（1）計(jì)算粗蛋白得率：

1.2.5 蛋白濃度的測(cè)定 蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作：采用BCA 法測(cè)定蛋白濃度（參照BCA 試劑盒說明書），以蛋白質(zhì)濃度為橫坐標(biāo)(mg/mL)，吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。按照濃度與所測(cè)吸光度值繪制馬骨髓蛋白含量測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為：

樣品溶液的測(cè)定：稱取干燥的骨髓蛋白樣品，配制質(zhì)量濃度為1 mg/mL 樣品溶液，參照BCA 試劑盒說明書，測(cè)定樣品吸光度，根據(jù)下式（2）計(jì)算馬骨髓蛋白含量。

式中：C1為供試品溶液中的蛋白質(zhì)濃度（mg/mL）；C2樣品起始濃度（mg/mL）。

1.2.6 綜合評(píng)分 根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，以馬骨髓蛋白濃度及DPPH 自由基清除能力綜合評(píng)分為考察指標(biāo)，由于其貢獻(xiàn)值大小未知，因此設(shè)定總值為 100%，蛋白濃度為主要考察指標(biāo)占60%，DPPH 自由基清除能力為次考察指標(biāo)占40%。綜合得分按式（3）～式（5）計(jì)算：

1.2.7 抗氧化活性研究

1.2.7.1 DPPH 自由基清除能力的測(cè)定 參照文獻(xiàn)[22]的方法，并略作修改。各準(zhǔn)確吸取不同濃度的樣品溶液1 mL 于具塞試管中，分別加入1 mL 已配制好的DPPH 甲醇溶液（0.2 mmol/L），搖勻，置于37 ℃恒溫箱恒溫30 min，蒸餾水作為參比，用酶標(biāo)儀在517 nm處測(cè)定吸光度。空白組由1 mL 的蒸餾水代替樣品溶液，以二丁基羥基甲苯（BHT）為陽性對(duì)照。馬骨髓蛋白對(duì)DPPH 自由基的清除率按下式（6）計(jì)算：

上式中，A0為空白組吸光度；A1為樣品組吸光度；A2為對(duì)照品組吸光度。

1.2.7.3 OH·清除能力的測(cè)定 采用文獻(xiàn)[24]方法測(cè)定OH·清除率。準(zhǔn)確吸取不同濃度的樣品溶液各1 mL 于具塞試管中，分別加入已1 mL 配制好的FeSO4·7H2O 溶液（6 mmoL/L）和1 mL 水楊酸-乙醇溶液（6 mmoL/L），混合均勻，加入1 mL 質(zhì)量濃度為0.1%的過氧化氫溶液使反應(yīng)啟動(dòng)，置于37 ℃恒溫箱恒溫30 min，蒸餾水作為參比，在510 nm 處測(cè)量吸光度。空白組用1 mL 水代替，測(cè)量三次取平均值，以BHT 為陽性對(duì)照。馬骨髓蛋白對(duì)OH·清除率按式（5）計(jì)算。

1.2.7.4 ABTS 自由基清除能力的測(cè)定 采用文獻(xiàn)[25]方法測(cè)定ABTS 自由基清除率，并略作修改。準(zhǔn)確量取0.4 mL 不同濃度的樣品溶液于具塞試管中，加入3.6 mL ABTS 自由基溶液，混勻，避光反應(yīng)6 min，于734 nm 處測(cè)定吸光度。用1 mL 蒸餾水代替樣品溶液作為空白，取平均值三次，以BHT 作為陽性對(duì)照。馬骨髓蛋白對(duì)ABTS 自由基清除率按式（7）計(jì)算：

式中，A0空白組吸光度；A1為樣品組吸光度。

1.2.7.5 總還原能力的測(cè)定 采用文獻(xiàn)[26]方法測(cè)定總還原能力。準(zhǔn)確量取0.8 mL 不同濃度的樣品溶液于具塞試管中分別加入0.4 mL 的PBS 溶液，再加入0.4 mL 鐵氰化鉀溶液（1%），于50 ℃下放置20 min，降溫，加入0.4 mL 三氯乙酸水溶液（10%），再加入1.6 mL 蒸餾水和0.4 m 三氯化鐵溶液（0.1%），室溫放置10 min，700 nm 處測(cè)量吸光度，以BHT 為陽性對(duì)照。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次，實(shí)驗(yàn)結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，用Origin 9.0、SPSS 25.0 和Design-Expert 8.0.6 對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理和分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 三種不同提取溶劑對(duì)馬骨髓蛋白的影響

3 種不同溶劑提取的馬骨髓蛋白得率、蛋白濃度及DPPH 自由基清除能力如表2 所示，從三種考察指標(biāo)來看，水提取法所得骨髓蛋白的綜合指標(biāo)明顯高于其余2 種。因此，考慮成本和操作便捷選用蒸餾水為提取溶劑并進(jìn)行后續(xù)優(yōu)化。

表2 三種不同提取溶劑對(duì)馬骨髓蛋白的影響 (n=3)Table 2 Influence of three different extraction solvents on the horse marrow protein (n=3)

2.2 單因素對(duì)馬骨髓蛋白的影響

如圖1 所示，溫度在30～40 ℃時(shí)，蛋白濃度與DPPH 自由基清除率隨溫度的升高而升高，當(dāng)溫度在45 ℃時(shí)其蛋白濃度呈降低的趨勢(shì)，但其DPPH自由基清除率逐漸升高至最高值；在50 ℃時(shí)蛋白濃度達(dá)到最高值，但其DPPH 自由基清除率降低。提取溫度較低時(shí)，馬骨髓蛋白濃度較低，蛋白質(zhì)的抗氧化活性較弱；適當(dāng)?shù)纳邷囟饶軌虼龠M(jìn)蛋白的溶出，但溫度過高使蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)被破壞，導(dǎo)致抗氧化活性降低。當(dāng)提取溫度超過45 ℃時(shí)，馬骨髓蛋白可能變性，從而失去活性。因此，選擇45 ℃為響應(yīng)面提取馬骨髓蛋白的中心點(diǎn)。如圖2 所示，提取時(shí)間在1～2 h 時(shí)，馬骨髓蛋白濃度及DPPH 自由基清除能力隨著提取時(shí)間的延長而升高；當(dāng)在3～5 h 內(nèi)其蛋白濃度與DPPH 自由基清除率隨著提取時(shí)間的延長逐漸降低。隨著提取時(shí)間的延長，蛋白溶出率隨之增大，當(dāng)達(dá)到一定程度后，溶液中的蛋白達(dá)到飽和，反應(yīng)完全；提取的時(shí)間太長，容易導(dǎo)致蛋白質(zhì)的降解及抗氧化活性的減弱。當(dāng)提取時(shí)間為2 h 時(shí)，馬骨髓蛋白的濃度及DPPH 自由基清除能力均達(dá)到最高值。綜合考慮，選擇2 h 為響應(yīng)面提取馬骨髓蛋白的中心點(diǎn)。

圖1 溫度對(duì)馬骨髓蛋白濃度和DPPH自由基清除率的影響Fig.1 Effects of temperature on the horse marrow protein concentration and DPPH free radical scavenging ability

圖2 提取時(shí)間對(duì)馬骨髓蛋白濃度和DPPH自由基清除率的影響Fig.2 Effects of extraction time on the horse bone marrow protein concentration and DPPH free radical scavenging ability

如圖3 所示，料液比在1:10～1:20 g/mL 時(shí)，馬骨髓蛋白濃度與DPPH 自由基清除率逐漸升高，且在1:20 g/mL 時(shí)達(dá)到最高值。當(dāng)超過1:20 g/mL時(shí)，蛋白濃度隨著料液比的增加而降低。同樣，其對(duì)DPPH 自由基的清除能力也在1:20 g/mL 時(shí)達(dá)最高值。料液比會(huì)影響溶液的黏度和濃度，當(dāng)料液比較小時(shí)，溶液黏度大，蛋白質(zhì)分子不易擴(kuò)散，蛋白濃度較??；隨著溶劑量的增加，蛋白濃度先增大，到了飽和狀態(tài)后進(jìn)一步增加料液比將導(dǎo)致其蛋白濃度及抗氧化活性的降低。因此，選擇1:20 g/mL 為響應(yīng)面提取馬骨髓蛋白的中心點(diǎn)。如圖4 所示，提取次數(shù)在1～2 次時(shí)，其蛋白濃度及DPPH 自由基清除率逐漸升高；提取次數(shù)3 次后，馬骨髓蛋白濃度大幅度降低。提取次數(shù)對(duì)DPPH 自由基的清除能力呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，并提取2 次時(shí)達(dá)到最高。提取次數(shù)過多，可能會(huì)導(dǎo)致非蛋白類雜質(zhì)的一同溶出，導(dǎo)致馬骨髓蛋白濃度及DPPH自由基清除能力的減弱。因此，選擇2 次為響應(yīng)面提取馬骨髓蛋白的中心點(diǎn)。

圖3 提取料液比對(duì)馬骨髓蛋白濃度和DPPH自由基清除率的影響Fig.3 Effects of solid-liquid ratio on the horse bone marrow protein concentration and DPPH free radical scavenging ability

圖4 提取次數(shù)對(duì)馬骨髓蛋白濃度和DPPH自由基清除率的影響Fig.4 Effects of extraction times on the horse bone marrow protein concentration and DPPH free radical scavenging ability

2.3 響應(yīng)面分析馬骨髓蛋白提取工藝試驗(yàn)結(jié)果

2.3.1 響應(yīng)面法優(yōu)化實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案和馬骨髓蛋白的綜合評(píng)分?jǐn)?shù)據(jù)如表3所示。將表3 中各組綜合評(píng)分?jǐn)?shù)據(jù)采用Design Expert 軟件進(jìn)行多元回歸和二項(xiàng)式分析，建立馬骨髓蛋白提取工藝綜合評(píng)分（Y）對(duì)4 個(gè)因素（A、B、C、D）的二次回歸模型Y=89.90?4.98A?1.25B+1.17C?2.18D?5.63AB?3.39AC+4.30AD+2.00BC+1.83CD+18.19A2?7.16B2?1.83C2?2.42D2。

表3 響應(yīng)面分析試驗(yàn)結(jié)果Table 3 Test results of response surface analysis

方差分析顯示（表4），該模型回歸極顯著（P<0.0001），失擬項(xiàng)不顯著（P>0.05），R2=0.9923，說明該模型與試驗(yàn)擬合較好，試驗(yàn)方法可靠，可準(zhǔn)確預(yù)測(cè)試驗(yàn)響應(yīng)值。該模型中，一次項(xiàng)A、B、C、D，交互項(xiàng)AB、AC、AD、BC、BD、CD，二次項(xiàng)A2、B2、C2、D2的P值均小于0.01，說明上述因素均對(duì)響應(yīng)值有極顯著的影響。在試驗(yàn)范圍內(nèi)各因素對(duì)響應(yīng)值的影響大小分別為：A>D>B>C，即提取溫度>提取次數(shù)>提取時(shí)間>料液比。

表4 回歸模型方差分析Table 4 Variance analysis for the regression model

2.3.2 雙因素間交互作用影響 利用Design Expert軟件繪制不同因素間響應(yīng)面分析圖與等高線圖。各因素對(duì)馬骨髓蛋白的影響如下圖5～圖7 所示。等高線的形狀及疏密程度表明兩因素互作效應(yīng)的強(qiáng)弱，橢圓形且曲線密集體現(xiàn)其互作效應(yīng)對(duì)響應(yīng)值的影響顯著，若圓形、曲線稀疏則影響不顯著。響應(yīng)曲面的走勢(shì)及坡度可體現(xiàn)試驗(yàn)因素對(duì)響應(yīng)值的影響，曲面走勢(shì)越陡峭，表明兩因素交互效應(yīng)對(duì)響應(yīng)值的影響越顯著，響應(yīng)值的改變?cè)矫舾?；走?shì)越平緩則與之相反。如圖所示，提取時(shí)間、提取溫度及料液比對(duì)馬骨髓蛋白綜合得分的影響均呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)；而提取次數(shù)對(duì)馬骨髓蛋白綜合得分的影響呈現(xiàn)逐漸降低的趨勢(shì)；同時(shí)，如圖5～圖7 所示，各因素的響應(yīng)面曲線均比較陡峭，呈橢圓形，說明提取時(shí)間、提取溫度、料液比和提取次數(shù)等4 因素均對(duì)綜合評(píng)分有顯著地影響，結(jié)果與回歸分析的結(jié)果吻合。

圖5 提取溫度與提取時(shí)間交互作用的響應(yīng)面圖和等高線圖Fig.5 Response surface map and contour map of interaction between extraction temperature and time

2.3.3 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果 經(jīng)Design-Expert 優(yōu)化后的馬骨髓蛋白最佳提取工藝為提取溫度 43.96 ℃、提取時(shí)間1.91 h、料液比1:19.98 g/mL，提取次數(shù)1.55次，此條件下馬骨髓蛋白綜合評(píng)分預(yù)測(cè)值91.0998%。結(jié)合試驗(yàn)條件的可行性，將實(shí)際操作改良為提取溫度45 ℃、提取時(shí)間2 h、料液比1:20 g/mL、提取次數(shù)2 次。該條件下進(jìn)行三次重復(fù)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，取平均值，得馬骨髓中蛋白綜合評(píng)分91.017%（n=3），與預(yù)測(cè)值相接近，表明該工藝參數(shù)準(zhǔn)確可靠。

圖6 液料比與提取溫度交互作用的響應(yīng)面圖和等高線圖Fig.6 Response surface map and contour map of interaction between liquid-solid ratio and temperature

圖7 提取次數(shù)與提取溫度交互作用的響應(yīng)面圖和等高線圖Fig.7 Response surface map and contour map of interaction between extraction times and temperature

2.4 馬骨髓蛋白抗氧化活性分析

如圖8 所示，馬骨髓蛋白對(duì)DPPH·具有較強(qiáng)的清除能力。在測(cè)定濃度范圍內(nèi)（0.05～0.5 mg/mL），隨著蛋白濃度的增加，其清除能力逐漸增強(qiáng)，呈正相關(guān)關(guān)系。在低濃度時(shí)，馬骨髓蛋白對(duì)DPPH 自由基的清除率大于BHT；然而，隨著濃度的升高，BHT 的清除能力大于馬骨髓蛋白。馬骨髓蛋白對(duì)DPPH 自由基的半抑制濃度（IC50）為0.061 mg/mL，BHT 對(duì)DPPH自由基的IC50值為0.062 mg/mL。以上結(jié)果說明白骨髓蛋白具有較強(qiáng)的抗氧化活性。

圖8 馬骨髓蛋白對(duì)DPPH 自由基的清除率Fig.8 DPPH free radical scavenging activity of horse bone marrow protein

圖9 馬骨髓蛋白對(duì)自由基的清除率Fig.9 Superoxide free radical scavenging activity of horse bone marrow protein

如圖10 所示，馬骨髓蛋白對(duì)·OH 具有較強(qiáng)的清除能力，且在0～0.5 mg/mL 范圍內(nèi)，與濃度呈正比關(guān)系。馬骨髓蛋白對(duì)·OH 的IC50值為0.067 mg/mL，BHT 的IC50值為0.069 mg/mL。在低濃度時(shí)（0.025～0.075 mg/mL），馬骨髓蛋白對(duì)·OH 的清除能力高于BHT，以上結(jié)果說明馬骨髓蛋白具有較強(qiáng)的抗氧化活性。

圖10 馬骨髓蛋白對(duì)·OH 的清除率Fig.10 ·OH scavenging activity of horse bone marrow protein

如圖11 所示，不同濃度的馬骨髓蛋白均對(duì)ABTS 自由基有清除作用，且在試驗(yàn)濃度（0.025～0.5 mg/mL）范圍內(nèi)呈明顯的量效關(guān)系，其清除ABTS 自由基的能力低于BHT。BHT 對(duì)ABTS 自由基的IC50值為0.105 mg/mL，馬骨髓蛋白的IC50值為0.290 mg/mL。

圖11 馬骨髓蛋白對(duì)ABTS 自由基的清除率Fig.11 ABTS radical scavenging activity of horse bone marrow protein

如圖12 所示，馬骨髓蛋白具有一定的總還原能力。在濃度0.1～0.5 mg/mL 范圍內(nèi)總還原能力強(qiáng)弱與馬骨髓蛋白濃度呈劑量關(guān)系，隨著濃度的增加，總還原能力逐漸增強(qiáng)。然而，在此濃度測(cè)定范圍內(nèi)，馬骨髓蛋白的總還原能力弱于BHT。

圖12 馬骨髓蛋白總還原能力Fig.12 Total reduction capacity of horse bone marrow protein

3 討論

膠原蛋白的提取和利用是畜禽骨營養(yǎng)成分開發(fā)研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)，目前家畜動(dòng)物膠原蛋白研究主要集中于提取方法優(yōu)化和活性篩選等方面。水提法所得的牛骨蛋白濃度達(dá)64.73 mg/mL[27]；豬骨蛋白經(jīng)水解后提取率達(dá)28.45%[28]；凱氏定氮法測(cè)出的鹿骨中蛋白質(zhì)含量為18.0%[29]；采用胃蛋白酶提取牦牛膠原蛋白，提取率為35.88%[30]。與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果相比，脫脂后馬骨髓水提蛋白濃度略高，但其提取率略低于豬骨、鹿骨和牦牛骨等。由于不同的提取方法可能造成部分蛋白的沉淀，從而影響蛋白含量及得率等。因此，采用低成本、操作簡便的水提法提取馬骨髓蛋白具有較好的可操作性和產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用前景。

抗氧化作用是動(dòng)物源蛋白類化合物最主要的生物活性之一。本試驗(yàn)通過測(cè)定馬骨髓蛋白清除DPPH、ABTS、·OH、自由基水平及總還原能力評(píng)價(jià)了其體外抗氧化活性，結(jié)果表明馬骨髓蛋白具有較強(qiáng)的抗氧化活性。其中，DPPH 自由基清除能力明顯高于吳暉等[31]研究的牛骨膠原蛋白肽堿性蛋白酶酶解及姜海洋[32]等研究的牦牛骨蛋白堿性蛋白酶酶解物；羥自由基清除能力與羊骨、豬骨酶解物相比較強(qiáng)[33?34]；馬骨髓蛋白對(duì)超氧陰離子自由基清除能力與羊骨、牛骨酶解物及鹿骨膠原肽相比顯出較強(qiáng)的清除能力[31,33,35]；馬骨髓蛋白總還原能力與鹿骨膠原肽相當(dāng)[35]，強(qiáng)于牦牛骨酶解物總還原能力[32]。同時(shí)，ABTS 自由基清除能力與劉春雷等[35]研究的堿性蛋白酶酶解法制備的鹿骨膠原肽相比較弱，這可能與不同原料和提取方法所制備的膠原蛋白或肽具有不同的氨基酸組成、序列、分子量、結(jié)構(gòu)及理化特性等有關(guān)[36]。由此可見，與常見動(dòng)物相比，通過水提所得的馬骨髓蛋白顯出較強(qiáng)的抗氧化活性，本實(shí)驗(yàn)在未采用高溫或酶解條件下，避免了高溫高壓等引起的蛋白結(jié)構(gòu)的破壞及失活，從而保持蛋白原有的結(jié)構(gòu)以及生物活性。然而，現(xiàn)制備的馬骨髓蛋白可能是多種肽的混合物，因此，今后需對(duì)其通過酶解、多種方法分離純化、結(jié)構(gòu)鑒定及活性篩選等進(jìn)行進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

本文通過響應(yīng)面法優(yōu)化馬骨髓蛋白最佳提取工藝為提取溫度45 ℃、時(shí)間2 h、料液比1:20 g/mL、提取次數(shù)2 次，此條件下，粗蛋白最佳得率達(dá)17.24%±0.032%，蛋白濃度達(dá)70.40±0.23 mg/mL?？寡趸瘜?shí)驗(yàn)結(jié)果說明馬骨髓蛋白具有較強(qiáng)的抗氧化能力，其對(duì)DPPH·、·OH、及ABTS+·的IC50值分別為0.061、0.067、0.250 和0.290 mg/mL，具有潛在的應(yīng)用開發(fā)價(jià)值。后期研究中將對(duì)馬骨髓蛋白采用酶解或超濾膜、柱層析等現(xiàn)代技術(shù)進(jìn)行分離純化、結(jié)構(gòu)鑒定、理化性質(zhì)及抗氧化活性等方面進(jìn)行深入的系統(tǒng)研究，確定活性肽段序列，闡明其抗氧化作用機(jī)理，將為提升馬骨髓蛋白功能價(jià)值，并為現(xiàn)代動(dòng)物源性蛋白多肽類保健食品和藥物的開發(fā)奠定技術(shù)和理論基礎(chǔ)，對(duì)動(dòng)物副產(chǎn)物產(chǎn)業(yè)鏈的提升方面具有重要的意義。