響應(yīng)面法優(yōu)化南極磷蝦油微膠囊噴霧干燥制備工藝的研究

苗鈞魁，魏書磊，劉小芳，于 源，張笑梅，冷凱良,

（1.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部極地漁業(yè)開發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東青島 266071；2.青島海洋科學(xué)與技術(shù)國(guó)家實(shí)驗(yàn)室，海洋藥物與生物制品功能實(shí)驗(yàn)室，山東青島 266200；3.中國(guó)海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東青島 266100）

南極磷蝦油是從南極磷蝦中提取的具有保健療效的油脂。研究認(rèn)為，南極磷蝦油富含ω-3、ω-6 類多不飽和脂肪酸以及蝦青素等活性物質(zhì)[1]，除了具備預(yù)防炎性反應(yīng)疾病、心腦血管疾病、老年癡呆癥、糖尿病等重大疾病的功效[2?6]，在體內(nèi)還可以起到清除自由基、修復(fù)DNA 損傷、抗炎活性、改善認(rèn)知能力等作用[5,7?10]。另外，蝦青素作為一種抗氧化能力極強(qiáng)的內(nèi)源性抗氧化劑，對(duì)防止油脂氧化變質(zhì)也起到一定作用[11]。

目前，在開發(fā)利用南極磷蝦油方面還存在諸多問題，表現(xiàn)為產(chǎn)品以軟膠囊為主，劑型單一；易變質(zhì)，儲(chǔ)存條件要求高；磷脂含量高，易乳化，應(yīng)用范圍受限制[1,12]。運(yùn)用微膠囊技術(shù)，將南極磷蝦油包在毫米至微米大小的膠囊中，可以隔絕與外界的接觸，延長(zhǎng)產(chǎn)品的貯藏時(shí)間，提高產(chǎn)品的溶解度，保護(hù)活性成分不被破壞[13]。針對(duì)油性內(nèi)容物的微膠囊化方法主要有：噴霧干燥法[14]、復(fù)凝聚法[15]、真空冷凍干燥法等。本研究采用的噴霧干燥法是將芯材分散在壁材溶液中，在高溫氣流中將芯材、壁材的混合溶液霧化，使溶液中的溶劑迅速蒸發(fā)，最終使壁材固化而得到微膠囊產(chǎn)品[16]。較其他方法，噴霧干燥法具有操作簡(jiǎn)便，成本較低的優(yōu)點(diǎn)，微膠囊化產(chǎn)品顆粒大小均勻，產(chǎn)品質(zhì)量好，易于實(shí)現(xiàn)規(guī)模化生產(chǎn)，是微膠囊技術(shù)中應(yīng)用最為廣泛的方法[17]。暴莎莎[18]利用麥芽糊精和明膠為壁材，噴霧干燥法制備了表面較光滑、無褶皺的南極磷蝦油微膠囊，包埋率達(dá)到74.15%。趙鑫鵬等[19]以海藻酸鈉與殼聚糖為壁材，采用銳孔法制備南極磷蝦油微膠囊，包埋率達(dá)到86.45%。戴妍等[20]比較了不同壁材生產(chǎn)蛋黃卵磷脂微膠囊的包埋率和性能等指標(biāo)，說明壁材的選擇對(duì)微膠囊性能優(yōu)劣具有關(guān)鍵作用。包埋率是影響微膠囊品質(zhì)的主要指標(biāo)。包埋率低，附著在微膠囊表面的油脂多，微膠囊極易氧化變質(zhì)，儲(chǔ)存難度大，生產(chǎn)成本高，無法進(jìn)入商業(yè)化生產(chǎn)。本文使用酪蛋白酸鈉、明膠、麥芽糊精作為壁材，制備南極磷蝦油微膠囊，在單因素基礎(chǔ)上，以包埋率為響應(yīng)值，采用響應(yīng)面法優(yōu)化了南極磷蝦油微膠囊的配方工藝，并探索了微膠囊的理化性質(zhì)，為南極磷蝦油工業(yè)化生產(chǎn)提供了工藝支持和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

南極磷蝦油 食品級(jí)，南極維康有限公司；明膠 食品級(jí)，山東恒源康生物科技有限公司；酪蛋白酸鈉 分析純，上海麥克林生化科技有限公司；麥芽糊精、正己烷、乙石油醚 分析純，上海國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

BILON-6000Y 實(shí)驗(yàn)室小型噴霧干燥機(jī) 上海比朗儀器制造有限公司；JZH50-80 高壓均質(zhì)機(jī) 上海錦竹機(jī)械設(shè)備有限公司；RE-52AA 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 鄭州科泰實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；BAS224S-CW 電子分析天平 德國(guó)賽多利斯科學(xué)儀器有限公司；Zs90 激光粒度分析儀 英國(guó)Malvern Zatasizer Nano 公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 南極磷蝦油微膠囊的制備 稱取一定質(zhì)量的酪蛋白酸鈉、明膠、麥芽糊精分別溶解，酪蛋白酸鈉直接溶解到70℃蒸餾水中，濃度約為6%，明膠經(jīng)少量水溶脹后加入到酪蛋白酸鈉溶液中，麥芽糊精直接加入到酪蛋白酸鈉溶液中，用磁力攪拌器攪拌直至充分混合，冷卻至50 ℃，得到壁材溶液；取一定質(zhì)量的南極磷蝦油，水浴加熱至50 ℃左右，邊攪拌邊加入到壁材溶液中，磁力攪拌器充分?jǐn)嚢瑁?jīng)高壓均質(zhì)機(jī)均質(zhì)后得到乳化液，均質(zhì)壓力設(shè)定為35 MPa，均質(zhì)3 次。將此乳化液通過噴霧干燥機(jī)噴霧干燥得到南極磷蝦油微膠囊，進(jìn)風(fēng)溫度設(shè)定為200 ℃，進(jìn)料量為20 mL/min。

工藝流程：

配料（水、壁材、南極磷蝦油）→乳化→高壓均質(zhì)→噴霧干燥→微膠囊

1.2.2 檢測(cè)方法 包埋率計(jì)算公式：

測(cè)定產(chǎn)品表面油：首先，準(zhǔn)確稱取適量的微膠囊產(chǎn)品，記作M，用一定體積的正己烷浸提大約2 min后，過濾，再用2 倍體積正己烷進(jìn)一步浸提，過濾，收集兩次濾液，放入旋蒸瓶進(jìn)行旋蒸，直到正己烷完全出去為止，其質(zhì)量記做m。

表面油計(jì)算公式：

測(cè)定產(chǎn)品總油：參考GB 5009.6-2016 中脂肪的測(cè)定方法，略有改動(dòng)。將分液漏斗放置于架子上，向分液漏斗內(nèi)加入1～2 g 南極磷蝦油微囊和10 mL 60 ℃熱水，振搖破壁，肉眼觀察不能有大顆粒，先后加入10 mL 無水乙醇、50 mL 石油醚，充分振搖，靜置30 min 直到清晰分層，用吸管吸取上層液體，轉(zhuǎn)移至旋蒸瓶?jī)?nèi)，濃縮得到總油。

1.2.3 單因素實(shí)驗(yàn) 選取各因素條件梯度：酪蛋白酸鈉用量16%、20%、24%、28%、32%，明膠用量4%，芯壁質(zhì)量比1:3；明膠用量2%、4%、6%、8%、10%，酪蛋白酸鈉20%，芯壁質(zhì)量比1:3；芯壁質(zhì)量比：1:1.5、1:2、1:3、1:4，酪蛋白酸鈉24%，明膠6%。固形物（芯材和壁材總和）濃度25%，不足濃度以麥芽糊精填充。

1.2.4 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì) 綜合單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果確定顯著因素和最佳條件，對(duì)明膠 A、酪蛋白酸鈉 B、芯壁質(zhì)量比C 設(shè)計(jì)了三因素三水平響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)。以 A、B、C 為自變量，以南極磷蝦油微膠囊包埋率為響應(yīng)值，采用 Design-Expert10.0 進(jìn)行響應(yīng)面中心組合設(shè)計(jì)，實(shí)驗(yàn)因素及水平設(shè)計(jì)見表1 。

表1 因素及水平表Table 1 Factors and levels table

1.2.5 南極磷蝦油微膠囊理化性質(zhì)的測(cè)定

1.2.5.1 水分含量的測(cè)定 按照食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB 5009.3-2016《食品中水分的測(cè)定》中直接干燥法測(cè)定。

1.2.5.2 灰分的測(cè)定 參照食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB 5009.4-2016 中的高溫灼燒法測(cè)定。稱取5 g 左右微膠囊，加入1.00 mL 乙酸鎂溶液（240 g/L）使試樣完全潤(rùn)濕。放置10 min 后，在水浴上將水分蒸干，在電熱板上以小火加熱使試樣充分炭化至無煙，然后置于高溫爐中，在550±25 ℃灼燒4 h。冷卻至200 ℃左右，取出，放入干燥器中冷卻30 min，稱量。重復(fù)灼燒至前后兩次稱量相差不超過0.5 mg 為恒重。

1.2.5.3 吸濕性的測(cè)定 首先，在表面皿中放入10～20 g 的樣品，放置于干燥器中，脫濕12 h 以上；然后，將表面皿置于藥品穩(wěn)定性試驗(yàn)箱內(nèi)，設(shè)置濕度75%，溫度25 ℃，每隔1 h 取出表面皿，精密稱量1 次，放回試驗(yàn)箱，平行測(cè)定3 次；最后，根據(jù)記錄數(shù)據(jù)計(jì)算吸濕增重并繪制樣品12 h 吸濕曲線。

1.2.5.4 粒徑的測(cè)定 取少量微膠囊粉末溶于燒杯中，待全部溶解后，取適量置于玻璃皿中，用Zs90 激光粒度分析儀測(cè)定微膠囊平均粒徑大小。

1.2.6 南極磷蝦油微膠囊機(jī)械強(qiáng)度 參照文獻(xiàn)[21]報(bào)道方法，利用離心法研究南極磷蝦油微膠囊在不同pH 環(huán)境中的機(jī)械強(qiáng)度。取一定量的微膠囊，于3 支離心管中，加入一定體積的超純水，混勻，使其充分分散，然后用0.1 mol/L 的鹽酸或氫氧化鈉分別調(diào)PH 至3.0、4.0、7.0，于1000 r/min 下分別離心15、30、45、60 min。控制在4 ℃，盡可能的減少溶劑的揮發(fā)和油酯降解。離心后，向體系中加入一定體積的正己烷，50 r/min 渦旋3 min，靜置10 min，收集正己烷相，旋蒸除去正己烷即得到釋放油脂，以離心前樣品作為對(duì)照，分析南極磷蝦油的釋放情況。

計(jì)算離心過程中由于離心作用力釋放出的南極磷蝦油占樣品中總南極磷蝦油酯的百分含量定義為釋放率，按照下式（3）進(jìn)行計(jì)算：

式中：m0表示體系中南極磷蝦油的總量，mg；mt表示離心時(shí)間為t 時(shí)，體系中釋放出的南極磷蝦油總量，mg；m0表示未被包埋的南極磷蝦油，即離心前（0 min）樣品中釋放出的南極磷蝦油，mg。

1.3 數(shù)據(jù)處理

重復(fù)所有實(shí)驗(yàn)至少3 次，結(jié)果表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（SD）。采用Excel2010 和Origin2018 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)

2.1.1 酪蛋白酸鈉對(duì)南極磷蝦油微膠囊包埋率的影響 圖1 顯示了明膠用量4%時(shí)，同等梯度酪蛋白酸鈉用量，酪蛋白酸鈉以及酪蛋白酸鈉和明膠共同作為壁材時(shí)（均添加適量麥芽糊精），南極磷蝦油微膠囊包埋率的差異。從圖1 可以看出添加明膠后南極磷蝦油微膠囊包埋率明顯提高。因此，選用酪蛋白酸鈉和明膠作為南極磷蝦油微膠囊的壁材。從圖1 中酪蛋白酸鈉和明膠共同作為壁材時(shí)微膠囊包埋率的曲線可以看出，包埋率隨著酪蛋白酸鈉用量的增加先上升后下降，在酪蛋白酸鈉用量為24%時(shí)達(dá)到最高值90.2%±0.34%。因此，酪蛋白酸鈉的用量24%為宜。

圖1 添加明膠和不添加明膠兩種情況下南極磷蝦油微膠囊包埋率的差異Fig.1 Differences in the embedding rate of Antarctic krill oil under single and composite wall materials

2.1.2 明膠用量對(duì)南極磷蝦油微膠囊包埋率的影響 明膠用量對(duì)南極磷蝦油微膠囊包埋率的影響，如圖2 所示，明膠用量由2%增加到4%時(shí)，微膠囊的包埋率迅速上升，在4%時(shí)達(dá)到最大值92.6%±0.34%，而后出現(xiàn)下降趨勢(shì)。因此，明膠的用量以4%為宜。

圖2 明膠對(duì)南極磷蝦油微膠囊包埋率的影響Fig.2 Effect of gelatin on embedding rate

2.1.3 芯壁質(zhì)量比對(duì)南極磷蝦油微膠囊包埋率的影響 由圖3 可知，隨著芯材與壁材質(zhì)量比的降低，南極磷蝦油包埋率增加，當(dāng)芯材與壁材的比例提高到1:3 時(shí)，達(dá)到91.6%±0.45%。芯材載量過高時(shí)，生產(chǎn)成本低，但是微膠囊囊壁厚度過低，滲透性高，南極磷蝦油的包埋率低，穩(wěn)定性差；降低芯壁質(zhì)量比，可以增加微膠囊壁厚度，降低微膠囊的滲透性，防止芯材流失或受氧氣、水蒸氣等外在因素的影響，延長(zhǎng)微膠囊的貨架期，但是生產(chǎn)成本增加。所以，綜合考慮微膠囊性能和生產(chǎn)成本，選擇芯壁質(zhì)量比為1:3 作為制備南極磷蝦油微膠囊的最佳工藝條件。

圖3 芯壁質(zhì)量比對(duì)南極磷蝦油微膠囊包埋率的影響Fig.3 Effect of the core-wall mass ratio on embedding rate

2.2 響應(yīng)面法優(yōu)化分析

響應(yīng)面分析方案及實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2，方差分析見表3。

表2 Box-Behnken 中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 2 Design and experimental results of Box-Behnken central composite

由表3 可知，模型的決定系數(shù)R2=0.9988，表示模型的相關(guān)度非常好，模型調(diào)整系數(shù)R2=0.9973，表明模型能解釋99.73%的響應(yīng)值變化，模型失擬項(xiàng)P=0.1515>0.05，表明模型顯著性較好，因此可以根據(jù)該數(shù)學(xué)模型，預(yù)測(cè)和分析南極磷蝦油微膠囊制備工藝中不同的配料比下微膠囊的包埋率，輔助設(shè)計(jì)新的配方工藝。擬合回歸方程：包埋率（%）=92.63+1.43625A+0.9375B?1.95625C?0.3425AB?0.585AC+0.2525BC?5.6825A2?5.12B2?2.8225C2。其中，A、B、C、A2、B2和C2項(xiàng)均是影響極顯著的因素（P<0.01），AB 項(xiàng)為影響顯著的因素（P<0.05），對(duì)南極磷蝦油微膠囊包埋率影響大小順序依次為：芯壁比>明膠>酪蛋白酸鈉。BC 交互作用不顯著，AB、AC 的交互作用顯著，表明各個(gè)影響因素與響應(yīng)值之間不是簡(jiǎn)單的線性關(guān)系，圖4、圖5、圖6 更直觀描述了3 因子對(duì)響應(yīng)值的影響。

表3 回歸模型的方差分析及顯著性檢驗(yàn)Table 3 Analysis of variance and significance test of regression model

圖4 明膠和酪蛋白酸鈉交互影響的響應(yīng)面圖Fig.4 Response surface diagram of interaction between gelatin and sodium caseinate

圖5 酪蛋白酸鈉和芯壁質(zhì)量比交互影響的響應(yīng)面圖Fig.5 Response surface diagram of interaction between sodium caseinate and the core-wall mass ratio

圖6 明膠和芯壁質(zhì)量比交互影響的響應(yīng)面圖Fig.6 Response surface diagram of interaction between gelatin and the core-wall mass ratio

2.3 驗(yàn)證試驗(yàn)

為驗(yàn)證模型的可靠性，選用優(yōu)化的參數(shù)，酪蛋白酸鈉用量24.55%、明膠用量4.86%、芯壁比0.33、麥芽糊精用量45.60%，進(jìn)行3 次平行實(shí)驗(yàn)，得到南極磷蝦油微膠囊包埋率為93.79%±0.12%，與理論預(yù)測(cè)值92.65%比較，誤差在3%以內(nèi)，說明模型準(zhǔn)確可靠。

2.4 南極磷蝦油微膠囊的理化性質(zhì)

南極磷蝦油微膠囊產(chǎn)品呈粉末狀，水分含量越低，越有利于防止產(chǎn)品結(jié)塊或霉變。如果產(chǎn)品吸濕性高，在儲(chǔ)存過程中容易引起粉末吸潮導(dǎo)致結(jié)塊，流動(dòng)性降低，顏色變深，易滋生微生物，影響產(chǎn)品的應(yīng)用和儲(chǔ)存性能。在該實(shí)驗(yàn)條下制得的南極磷蝦油微膠囊產(chǎn)品水分含量2.31%±0.11%，置于75%的高濕度環(huán)境下12 h，在初始的2～3 h，微膠囊增重明顯，隨著時(shí)間的推移，增加的重量逐漸減小，在7.5 h 后增加幅度變緩（圖7）。這說明微膠囊具有較強(qiáng)的吸濕能力，需要在干燥密封的條件下貯藏。微膠囊粒徑在7～48 μm 之間，集中在14.8～26.7 μm，且呈正態(tài)分布（圖8）。灰分含量為2.04%±0.14%。

圖7 南極磷蝦油微膠囊吸濕性曲線Fig.7 Hygroscopicity curve of Antarctic krill oil microcapsules

圖8 南極磷蝦油微膠囊粒徑測(cè)定結(jié)果Fig.8 Results of particle size measurement of Antarctic krill oil microcapsules

2.5 pH 對(duì)南極磷蝦油微膠囊機(jī)械強(qiáng)度的影響

通過考察南極磷蝦油微膠囊在不同pH 環(huán)境下的釋放，評(píng)價(jià)pH 對(duì)南極磷蝦油微膠囊機(jī)械強(qiáng)度的影響，以便為南極磷蝦油微膠囊產(chǎn)品的制備和應(yīng)用提供參考。圖9 描述了不同pH 條件下南極磷蝦油微膠囊芯材在離心過程中的釋放情況。由圖9 可以看出，在不同的pH 環(huán)境和離心時(shí)間條件下，微膠囊中南極磷蝦油釋放率小于0.3%，釋放量幾乎可以忽略，表明南極磷蝦油微膠囊的機(jī)械強(qiáng)度和抗離心能力非常強(qiáng)，結(jié)構(gòu)非常穩(wěn)定。微膠囊的強(qiáng)度取決于膠囊的直徑和囊殼的厚度，也與壁材關(guān)系密切[22]。推測(cè)微膠囊機(jī)械強(qiáng)度高的原因是明膠使酪蛋白酸鈉溶膠體系重組而改變?cè)械木酆衔锟臻g結(jié)構(gòu)，兩性親水物質(zhì)酪蛋白酸鈉和明膠之間的生物相容性、協(xié)同增效作用增強(qiáng)，使微膠囊囊壁的機(jī)械強(qiáng)度顯著性提高[23]。酪蛋白酸鈉和明膠兩種分子間的氫鍵作用，使囊壁的膜結(jié)構(gòu)更加緊湊，阻水性明顯提高；明膠側(cè)基-NH3+與酪蛋白酸鈉解離的負(fù)離子間靜電力相互作用，使囊壁的拉伸強(qiáng)度提高[23]。

圖9 不同pH 環(huán)境下南極磷蝦油微膠囊芯材釋放率隨離心力時(shí)間的變化Fig.9 Variation of Antarctic krill oil microcapsules release rate versus centrifugation time in different pH conditions

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)利用噴霧干燥法制備南極磷蝦油微膠囊，在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，利用響應(yīng)面試驗(yàn)確定了南極磷蝦油噴霧干燥法微膠囊化的最佳配方工藝為：酪蛋白酸鈉用量24.55%、明膠用量4.86%、芯壁比0.33，麥芽糊精質(zhì)量分?jǐn)?shù)為45.60%，此條件下得到的南極磷蝦油包埋率為93.79%。微膠囊水分含量2.31%±0.12%，吸濕性強(qiáng)，需儲(chǔ)存于干燥密閉的環(huán)境里，灰分含量為2.04%±0.14%，粒徑在14.8～26.7 μm之間。微膠囊機(jī)械強(qiáng)度高，結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，初步認(rèn)為可應(yīng)用于食品加工。根據(jù)響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果，得出酪蛋白酸鈉用量、明膠用量、芯壁質(zhì)量比對(duì)南極磷蝦油微膠囊包埋率的影響極顯著，且三者對(duì)南極磷蝦油微膠囊包埋率影響大小順序依次為：芯壁比>明膠>酪蛋白酸鈉，各實(shí)驗(yàn)因素對(duì)南極磷蝦油微膠囊包埋率的影響程度并非簡(jiǎn)單的線性關(guān)系。本文所建立預(yù)測(cè)模型可以用于南極磷蝦油微膠囊包埋率的預(yù)測(cè)。