固體發酵降低大米血糖指數的蛹蟲草菌株篩選

胡 龍，范秀芝，姚 芬，殷朝敏，史德芳，高 虹, ，胡中澤,

（1.武漢輕工大學食品科學與工程學院，湖北武漢 430023；2.湖北省農業科學院農產品加工與核農技術研究所，湖北武漢 430064；3.國家食用菌加工技術研發分中心，湖北武漢 430064）

血糖指數（Glycemic Index，GI）是衡量碳水化合物對血糖反應的一種有效指標[1]。根據GI 值的高低，分為高GI 食品（GI>70）、中GI 食品（55≤GI≤70）和低GI 食品（GI<55）[2]。低GI 食品，因在人體在進食后分解為葡萄糖的速率慢，使人體血糖水平升高的速率和幅度變小，可降低胰島素的分泌量，有利于人體血糖平衡并有效預防糖尿病[3?4]，已得到食品研究人員和企業的關注[5]。按照國家標準WS/T 652-2019 食物血糖生成指數測定方法的規定[6]，食品的GI 值需要通過測定人體餐后血糖變化量后計算而得，檢測過程復雜且費用昂貴，目前我國具備檢測能力的機構少。因此，研究者們大都通過體外消化試驗這一簡單有效的方法來測定食品的GI 值，所得GI 值用預估血糖指數（expected glycemic Index，eGI）來表示[7?9]。目前，大多數低GI 食品是通過低GI 原料的混合加工達到降低產品GI 值的目的，如田寶明[10]通過在小麥面粉中添加谷朊粉、魔芋精粉、微晶纖維素和高直鏈玉米淀粉制作成低GI 掛面。舒志成等[11]通過燕麥、白蕓豆、鷹嘴豆、魔芋丁制作出低GI 八寶粥。此外，也有通過微生物發酵技術降低產品GI 值的研究報道，Singh 等[12]利用酵母對生面團發酵，從而降低面包GI 值，Angelis 等[13]利用酵母、乳酸菌對生面團發酵降低面包GI 值。但目前鮮有通過食用菌菌絲發酵降低產品GI 值的研究報道。

蛹蟲草（Cordyceps militaris），又名北蟲草、北冬蟲夏草，與野生冬蟲夏草同屬異種[14]。蛹蟲草子實體含有豐富的蟲草素、蟲草多糖、腺苷、蟲草酸、超氧化物岐化酶等，具有提高人體免疫力、抑制腫瘤、抗疲勞、降血脂等功效[15?17]，被認為是冬蟲夏草的理想替代品。2009 年衛生部發布第3 號公告，批準蛹蟲草為新資源食品，為蛹蟲草在食品加工領域中應用奠定了基礎。但是，蛹蟲草子實體栽培周期長，出草過程受到溫度、濕度、光照等諸多因素制約，且環境控制成本較高[18?19]。有報道指出，經蛹蟲草發酵后得到的發酵菌質中含有與蛹蟲草子實體中一致的多糖、蟲草酸和蟲草素等，并且具有與子實體中活性物質相同的抗氧化、抗腫瘤等功效[20?22]。

因此，本研究以大米為培養基質進行蛹蟲草固體發酵，以菌絲生長速度、發酵菌質多糖、蟲草素含量，以及大米基質發酵前后eGI 值降低效果為評價指標，篩選出最優的菌株，以保證在降低大米GI 值的同時提高發酵菌質中活性物質含量，為后續直接利用發酵菌質開發營養及功能食品奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

蛹蟲草菌株 共4 種，沈農大蟲草、皖西蟲草、云蟲草、全蟲草（根據前期研究選擇[23]），華中農業大學菌種試驗中心；京山橋米 湖北國寶橋米有限公司；蟲草素標準品 上海源葉生物科技有限公司；豬胰α-淀粉酶、色譜級乙腈 Sigma 公司；可消化淀粉、抗性淀粉試劑盒、淀粉葡萄糖苷酶 愛爾蘭Megazyme 公司；98%濃硫酸、苯酚、葡萄糖、95%乙醇、無水乙醇、氫氧化鈉、冰醋酸等分析純 國藥集團。

LDZX-75KBS 高壓蒸汽滅菌鍋 上海申安醫療器械廠；SW-CJ-ID 凈化工作臺 蘇州凈化設備有限公司；FD5-3P 真空冷凍干燥機 美國金西盟公司；KQ-5200 DE 超聲波清洗器 昆山市超聲波儀器公司；3K15 高速冷凍離心機 德國Sigma 公司；UV-1800 紫外可見分光光度計、LC-20AT 高效液相色譜儀 日本島津公司；RE-52AA 旋轉蒸發器 上海亞榮生化儀器廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 培養基制備 馬鈴薯固體培養基（PDA）：土豆200 g，葡萄糖20 g，瓊脂20 g，加蒸餾水定容至1 L，pH 自然。液體完全培養基（LCYM）：葡萄糖20 g，蛋白胨2.0 g，酵母膏2.0 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，K2HPO41.0 g，KH2PO40.46 g，加蒸餾水定容至1 L，50 mL分裝，121 ℃滅菌30 min，備用。大米固體培養基：大米與LCYM 以1:1（m:v）比例配制，121 ℃滅菌30 min。其中，菌絲生長速度測定用大米培養基為25 mm×200 mm 試管中裝入20 g 大米與20 mL 的LCYM；固體發酵培養基為500 mL 罐頭瓶中裝入50 g 大米和50 mL 的LCYM。

1.2.2 菌種活化 在超凈工作臺中，將沈農大蟲草、皖西蟲草、云蟲草、全蟲草4 種菌株取一小塊轉接到固體馬鈴薯平板培養基上，25 ℃恒溫培養5 d，備用。

1.2.3 菌絲生長速度 測定菌株活化后用8 mm 打孔器打孔，取1 個接種塊接種到大米試管培養基頂部表層中央，垂直放置，在25 ℃避光培養。待菌絲萌發并長滿培養基表面，在試管的3 個方向劃線，到同一批中菌絲生長到試管底部時，結束培養并劃線。記錄菌絲生長距離以及培養天數，計算出菌絲生長速度。

式中：V 表示菌絲生長速度，mm/d；H 表示2 次劃線菌絲生長距離，mm；T 表示培養天數，d。

1.2.4 液體菌種制備 菌株活化后，8 mm 打孔器打孔，每瓶液體培養基接入6～7 塊菌塊，25 ℃恒溫避光培養5 d。

1.2.5 固體發酵 培養液體菌種勻漿后按6 mL/罐接種到固體發酵培養基中，同時以接入6 mL 滅菌水的未發酵大米作為對照組，樣品組與對照組同時在25 ℃避光培養25 d，培養結束后收集發酵菌質進行冷凍干燥。

1.2.6 淀粉含量測定 利用可消化淀粉及抗性淀粉試劑盒測定發酵前后菌質中淀粉含量。取0.5 gα-淀粉酶（40000 U/g）與淀粉葡萄糖苷酶（170000 U/g）粉末混合物溶解于25 mL 0.05 mol/mL 馬來酸緩沖液（pH6.0），配制后4 h 內使用。分別取0.500 g 樣品，用95%乙醇浸濕后加入17.5 mL 馬來酸緩沖液，170 r/min 37 ℃攪拌5 min。加入2.5 mL 混合酶液，在20、120 和240 min 分別取0.2 mL 反應溶液加入到4 mL 無水乙醇中，13000 r/min 離心5 min，取0.1 mL 上清液加入3 mL 氧化酶-過氧化酶（GOPOD）試劑，50 ℃水浴20 min，對照空白樣在510 nm 處測量樣品中葡萄糖含量，計算快消化淀粉（rapidly digestible starch，RDS）和慢消化淀粉（slowly digestible starch，SDS）含量。

式中：G20表示酶解20 min 產生的葡萄糖含量，mg；G120表示酶解120 min 產生的葡萄糖含量，mg；W 表示所取樣品質量，mg。

同時，在240 min 取4 mL 反應液到裝有4 mL無水乙醇的離心管中，混合均勻，4000 r/min 離心10 min，棄上清，8 mL 50%乙醇溶液洗滌3 次。向沉淀中加入2 mL 1.7 mol/mL 氫氧化鈉，冰水浴20 min。加入8 mL 1.2 mol/L，pH3.8 醋酸鈉緩沖液和0.1mL 淀粉葡萄糖苷酶（3300 U/mL），混合均勻，于50 ℃振蕩水浴30 min，13000 r/min 離心5 min后以上述相同的方法加入氧化酶-過氧化酶試劑測定樣品中葡萄糖含量，計算抗性淀粉（resistant starch，RS）和總淀粉（total starch，TS）含量。

式中：GRS表示所取的4 mL 反應液進一步酶解后產生的葡萄糖含量，mg；ΔV 表示反應總體積，mL；G240表示酶解240 min 產生的葡萄糖含量，mg。

1.2.7 體外消化動力學 預估血糖指數測定與體外消化動力學測定參考文獻[24]稍作修改，取0.2 g 樣品加入15 mL 0.2 mol/L pH5.2 醋酸鈉緩沖液，170 r/min 37 ℃攪拌5 min。加入配制好的α-淀粉酶（290 U/mL）與淀粉葡萄糖苷酶（15 U/mL）混合酶液5 mL。170 r/min 37 ℃攪拌，在10、20、30、45、60、90、120、150、180 min 分別取0.1 mL 反應液至1 mL 無水乙醇，以13000 r/min 離心5 min，取0.1 mL 上清液加入3 mL GOPOD 試劑，50 ℃水浴20 min，對照空白樣在510 nm 處測量樣品中葡萄糖含量。

根據Go?i 等[25]研究指出，淀粉水解曲線遵循一級反應方程：

式中：C 表示在t 時刻淀粉酶解百分比，%；Gt表示在t 時刻酶解產生的葡萄糖量，mg；C∞表示180 min達到平衡后淀粉酶解百分比，%；k 表示動力學常數。

對所得曲線進行擬合，得出一級反應方程，計算擬合曲線0～180 min 下表面積（AHU）。得出樣品的淀粉水解指數（hydrolysis index，HI）。根據HI 值，計算出eGI 值。

1.2.8 發酵菌質中多糖含量測定 發酵菌質中粗多糖的提取參照參考文獻[26]的方法進行。取25 g發酵菌質，以料液比為1:30（g:mL）加入蒸餾水，超聲提取1 h，90 ℃水浴3 h。離心后取上清液。沉淀加蒸餾水沖洗后離心，合并上清液。旋轉蒸發到一定體積，加入0.185 gα-淀粉酶（1850 U），在60 ℃、pH6 的條件下，振蕩水浴3 h，酶解培養基中殘留淀粉以去除干擾。加入5 倍體積的無水乙醇，4 ℃沉淀過夜。再次離心，收集沉淀物，冷凍干燥后進行稱重。

按照NY/T 1676-2008[27]的方法測定蛹蟲草發酵菌質中多糖含量。分別取100 mg/mL 葡萄糖標準液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL 于20 mL 具塞試管中，用去離子水補至1.0 mL。加入1 mL 5%苯酚，然后快速加入5 mL 濃硫酸，靜置10 min。混合均勻，于30 ℃水浴反應20 min，用紫外分光光度計于490 nm 處測定吸光度，繪制標準曲線。

精確稱取樣品0.01 g，加入蒸餾水溶解并定容至100 mL，搖勻，精確吸取1 mL 樣液。同上述繪制標準曲線的步驟，測定吸光度，計多糖含量計算公式如下：

式中：ω表示蛹蟲草發酵菌質多糖含量，%；C 表示所測得多糖濃度，mg/mL；V 表示粗多糖樣品液體體積，mL；m 表示凍干后粗多糖質量，g；m0表示粗多糖取樣量，g；M 表示發酵菌質的取樣量，g。

1.2.9 發酵菌質蟲草素含量測定 按照NY/T 2116-2012[28]高效液相色譜法測定蛹蟲草發酵菌質中蟲草素的含量。

色譜條件為：色譜柱Inertsil ODS-SP（C18）柱250 nm×4.6 nm，5 μm；流動相為V（乙腈）:V（水）=5:95；流速為1.0 mL/min；柱溫為35 ℃；進樣量10 μL。

1.3 數據處理

每個實驗3 次重復，數據以平均值±標準表示。采用SPSS 25 和Origin 8.5 軟件進行數據差異顯著性分析和作圖。差異顯著水平為P<0.05。

2 結果與分析

2.1 不同菌株菌絲生長速度

如圖1 所示，在固體發酵培養基中，對4 個菌株的菌絲生長速度進行比較，沈農大蟲草與皖西蟲草的生長速度差異不顯著，沈農大蟲草與全蟲草的生長速度也不顯著，菌絲生長速度最快的是皖西蟲草，為1.80 mm/d，其次是沈農大蟲草與全蟲草，且二者差異不顯著，生長速度分別為1.74、1.71 mm/d，生長最慢的為云蟲草，為1.46 mm/d。

圖1 不同菌株菌絲生長速度Fig.1 Mycelial growth rates of different strains

2.2 培養基及發酵菌質中淀粉含量測定

根據Entlyst 等[29]對淀粉的分類，以淀粉在人體小腸中消化速度的差異分為快消化淀粉（RDS）、慢消化淀粉（SDS）和抗性淀粉（RS）。因此，本研究對固體發酵培養基及發酵菌質中不同種類淀粉含量進行了測定，結果如表1 所示。由公式（2）～（5）計算得未發酵的大米固體培養基中RDS、SDS、RS、TS 含量分別為68.32%、12.10%、3.00%、83.42%。經過4 個蛹蟲草菌株發酵后，RDS 含量都分別有所降低，除云蟲草外，SDS 都有所增加，RS 含量都顯著增加（P<0.05），其中全蟲草SDS 和RS 含量增加最多，尤其是RS 含量，增加了21.4%，TS 含量僅有全蟲草降低。田寶明[10]研究指出，SDS 與RS 的含量越高，在人體內產生葡萄糖的速率越慢，對于維持餐后血糖穩定具有非常重要的作用。因此，推測本研究中4 個蛹蟲草菌株對大米進行發酵后，能減緩大米在人體內的消化速率，尤其是全蟲草菌株。

表1 4 個菌株發酵菌質及未發酵大米不同種類淀粉含量Table 1 Contents of starch in fungal substances fermented by four strains and unfermented rice

2.3 體外消化動力學預估發酵菌質eGI 值

GI 值能更清晰的衡量出碳水化合物在人體內消化的快慢和影響人體餐后血糖波動的大小[9]。我國已在2019 年12 月實施血糖生成指數測定方法，但檢測是通過人體進行測定，檢測成本高，且我國具備檢測能力的機構少。目前，通過體外消化預估食品eGI 值是最常用的方法。因此，本研究以體外消化動力學方法預估蛹蟲草固體發酵前后基質eGI 值。

由圖2 可以看出，大米基質經過蛹蟲草菌株發酵后，4 個菌株發酵菌質中淀粉酶解率較發酵前均有所降低，其降低效果從高到低依次為全蟲草>沈農大蟲草>皖西蟲草>云蟲草,由公式（7）得C∞分別為43.22%、53.96%、58.15%和60.28%；與未發酵的大米相比，酶解3 h 后，C∞分別下降27.69%、16.95%、12.76%、10.63%。以白面包為參照物，通過計算HI 值，進一步得出各發酵菌質的eGI 值。其中，未發酵大米培養基的eGI 值為80.33，經過蛹蟲草菌種發酵后，4 個蛹蟲草菌株均能有效降低大米培養基的eGI 值，說明蛹蟲草發酵能有效降低大米eGI 值。但僅有全蟲草達到中eGI 值水平，為65.63，比未發酵基質其eGI 值降低了14.7（表2）。說明蛹蟲草發酵能有效降低大米eGI 值。推測原因可能是培養基以純大米為基質且營養液中含有葡萄糖，發酵菌質的eGI 值本身較高，加上培養時間有限，蛹蟲草菌絲體還未能將基質中淀粉等物質完全轉化和利用，導致發酵后菌質eGI 值仍較高。

圖2 蛹蟲草發酵對大米體外酶解動力學擬合曲線的影響Fig.2 Effects of Cordyceps militaris fermentation on the in vitro enzymatic hydrolysis kinetic fitting curve of rice

表2 4 個菌株發酵菌質及未發酵大米的淀粉體外消化動力學參數、水解指數（HI）和預估血糖指數（eGI）Table 2 In vitro digestion kinetic parameters of starch,hydrolysis index (HI) and estimated glycemic index(eGI) of fungal substances fermented by four strains and unfermented rice

2.4 發酵菌質中多糖含量測定

繪制多糖標準曲線，得到回歸方程y=11.096x?0.0043（R2=0.9995）。標準曲線線性關系良好。從圖3中可以看出，經過淀粉水解后測定的蛹蟲草發酵菌質中多糖含量均顯著高于未發酵大米中的多糖含量（P<0.05），表明蛹蟲草利用大米中淀粉作為底物分解合成了蟲草多糖[30]。不同發酵菌質之間，僅有皖西蟲草與全蟲草發酵后菌質中多糖含量之間差異不顯著。其中，沈農大蟲草發酵菌質的多糖含量最多，為5.79%，其次是皖西蟲草和全蟲草，分別為5.35%和5.29%，云蟲草發酵菌質的多糖含量最少，為4.77%。以上以純大米為發酵基質，在不出草情況下獲得發酵菌質中的多糖含量均略高于子實體收獲后發酵菌質中的多糖含量（3.52%）[26]，且與已報道的17 個蛹蟲草菌株子實體中多糖含量相對比（1.81%～4.92%）[31]，沈農大蟲草、皖西蟲草以及全蟲草發酵菌質菌質中多糖含量均超過子實體中的多糖含量，表明本研究所得發酵菌質具有一定的應用價值，可替代子實體或現有發酵菌質開展多糖相關研究。

圖3 未發酵大米及不同菌株發酵菌質中多糖含量Fig.3 Polysaccharide content in unfermented rice and fungal substances fermented by different strains

據已有研究報道，多糖是蛹蟲草降血糖的主要成分之一，蛹蟲草多糖對α-葡萄糖苷酶具有顯著的抑制效果，能有效降低糖尿病小鼠的血糖水平[32?34]。因此，推測發酵菌質中除SDS 和RS 淀粉含量增加對GI 值的影響外，多糖對發酵菌質GI 值的降低起到了一定的作用。

2.5 蛹蟲草發酵菌質中蟲草素測定結果

繪制蟲草素溶液的標準曲線，得到回歸方程y=29316.70x+5011.51（R2=0.9999）。標準曲線線性關系良好。圖4 為未發酵大米及4 個蛹蟲草發酵菌質蟲草素含量的測定結果（P<0.05），其中未發酵大米中未檢測到蟲草素，這與蟲草素是蛹蟲草的主要活性成分這一事實一致[21]。在4 個蛹蟲草發酵菌質中，蟲草素含量從多到少依次為：全蟲草發酵菌質>云蟲草發酵菌質>沈農大蟲草發酵菌質>皖西蟲草發酵菌質。其中，全蟲草發酵菌質的蟲草素含量為皖西蟲草發酵菌質的22 倍，為5185.98 mg/kg，云蟲草發酵菌質的蟲草素含量為3917.60 mg/kg、沈農大蟲草發酵菌質的蟲草素含量為2115.35 mg/kg、皖西蟲草發酵菌質的蟲草素含量為236.14 mg/kg。不同蛹蟲草菌株所產生的蟲草素含量差異顯著（P<0.05），與已有報道一致[31]。以上以純大米為發酵基質，25 d 培養不出草情況下獲得的發酵菌質中蟲草素含量除皖西蟲草外均略高于子實體收獲后發酵菌質中的蟲草素含量（1792.97 mg/kg）[21]。

圖4 未發酵大米及不同菌株發酵菌質中蟲草素的含量Fig.4 Cordycepin content in unfermented rice and fungal substances fermented by different strains

3 結論

在前期研究基礎上，選擇沈農大蟲草、皖西蟲草、云蟲草和全蟲草對大米基質進行發酵，篩選能降低大米基質eGI 值的蛹蟲草菌種。綜合生長速度、發酵菌質eGI 值、多糖以及蟲草素含量，確定全蟲草為最佳菌株。以該菌株對大米基質進行25 d 發酵后，菌質RDS 含量由68.32%下降到58.49%，SDS含量由12.10%上升到14.15%，RS 含量由3.00%上升到9.42%，TS 含量由83.42%下降到82.06%；菌質eGI 值由80.33 降低到65.63，降低了18.30%；發酵菌質中多糖含量為5.29%，蟲草素含量為5185.98 mg/kg，其多糖含量已高于子實體，且蟲草素含量也已達到較高水平，可以替代子實體用于營養和功能食品開發。

本研究雖然通過發酵降低了基質的eGI 值，但仍未達到低GI 水平，可能與本研究僅以大米為主要培養基質本身GI 值較高有關。因此，后續會對發酵基質及培養時間等進行優化，進一步降低發酵菌質eGI 值，為蛹蟲草發酵菌質的利用以及低GI 產品的開發奠定基礎。此外，還應該對多糖和蟲草素對降低GI 值的效果進行研究。