棉花枯萎病菌新生理型菌株毒素鑒定及其活性測定

楊可心，陳秀葉，劉暢，鹿秀云，郭慶港*，馬平

（1.河北省農林科學院植物保護研究所/河北省農業有害生物綜合防治工程技術研究中心/農業農村部華北北部作物有害生物綜合治理重點實驗室，河北 保定071000；2.南京農業大學植物保護學院，南京210095）

由尖孢鐮刀菌萎蔫專化型（Fusarium oxysporumf.sp.vasinfectum）引起的棉花枯萎病是棉花生產上的主要病害之一，給棉花生產造成嚴重損失[1]。種植抗病品種是防治棉花枯萎病的有效措施之一[2]，但近年來田間調查發現，棉花枯萎病發生提前，并且存在越來越重的趨勢，推測可能與病原菌的遺傳分化有關。

根據在不同寄主上的致病力強弱，棉花枯萎病菌被劃分為8個不同的生理小種，1號和2號生理小種分布在美國和坦桑尼亞[3]，3號生理小種分布在埃及、以色列、蘇丹和我國新疆的個別地區[4]；4號生理小種最初在印度被發現，2001年在美國的加州地區也發現了1株強致病力棉花枯萎病菌，通過致病力測定和分子檢測技術，該菌株被鑒定為4號生理小種[5]。5號生理小種分布于蘇丹，對海島棉有侵染性，對陸地棉無侵染作用[6]；6號生理小種存在于巴西，其致病力與1、2號生理小種相似。7號和8號生理小種存在于中國，并且7號生理小種致病力較強，是我國的優勢生理小種[7]。除了上述8個明確的生理小種外，在澳大利亞存在一類獨特的生理型菌株。澳大利亞生理型菌株致病力較強，對澳大利亞大部分棉花品種表現較強的致病力，給當地棉花生產造成嚴重的經濟損失。通過多基因序列比對發現，澳大利亞生理型菌株是由澳大利亞本土起源[8]。近年來，隨著測序技術的快速發展，國內外相繼分離出幾個具有不同遺傳背景的生理型菌株[9]。

尖孢鐮刀菌產生植物毒素導致植物萎蔫是其致病的主要機理之一。尖孢鐮刀菌可以產生多種植物毒素，包括鐮刀菌酸（Fusaric acid）、白僵菌素（Beauvericin）、苯乙酸（Phenylacetic acid）[10-11]，其中鐮刀菌酸是棉花枯萎病菌產生的主要毒素，引起棉花植株萎蔫癥狀，阻斷鐮刀菌酸合成后可以顯著降低棉花枯萎病菌的致萎能力[12-13]。棉花枯萎病菌不同生理小種之間毒素的種類以及鐮刀菌酸的產量不同[14]。

Guo等對采自我國主要植棉區的棉花枯萎病菌進行遺傳多樣性分析，發現我國棉花枯萎病菌存在不同于3號、7號和8號生理小種的新生理型菌株；進一步通過看家基因序列比對，證明這類新生理型菌株與澳大利亞生理型菌株親緣關系較近；致病力測定表明，新生理型菌株對我國主要的棉花品種致病力較弱[9]。本研究的目的包括：（1）明確棉花枯萎病菌新生理型菌株、7號生理小種以及澳大利亞生理型菌株產生的主要毒素種類以及產量差異；（2）采用離體葉片法評價毒素的致病力。本研究結果將進一步加深對新生理型菌株的了解，為新生理型菌株致病力長期監測及防控提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料

棉花枯萎病菌新生理型H70菌株采自河北省威縣，通過擴增片段長度多態性（Amplified fragment length polymorphism，AFLP）分析以及多基因序列比對，證明該菌株不同于我國已發現的3號、7號和8號生理小種，而與澳大利亞生理型菌株親緣關系較近[9]。7號生理小種由河北省農林科學院植物保護研究所植物病害生物防治實驗室分離并保存提供，澳大利亞生理型菌株ATCC96291購自美國菌株保存中心（American Type Culture Collection，ATCC）。

1.2 棉花枯萎病菌不同菌株形態學觀察

將棉花枯萎病菌7號生理小種、H70及澳大利亞生理型菌株ATCC96291菌株接種在馬鈴薯葡萄糖瓊脂（Potato dextrose agar，PDA）培養基（pH 5.5）上，25℃條件下培養5 d，觀察不同菌株的形態。將3株棉花枯萎病菌在馬鈴薯葡萄糖液體（Potato dextrosebroth，PDB）培養基（pH 5.5）中，25℃、160 r·m in－1下震蕩培養5 d，培養液在10000 r·m in－1下離心10min，觀察上清液的顏色。

1.3 棉花枯萎病菌不同菌株在不同溫度下生長情況比較

將供試菌株接種在PDA培養基上，在25℃條件下培養5 d，挑取菌落邊緣相同大小的菌餅于PDA培養基上，分別置于20℃、25℃、30℃和35℃溫度梯度下培養，每個溫度3次重復，7 d后利用十字交叉法測量菌落平均直徑，觀察菌株在不同溫度下的生長差異。

1.4 棉花枯萎病菌不同菌株孢子形態觀察

將供試菌株接種在綠豆湯培養基（pH 6.0）[15]中，25℃、160 r·m in－1下震蕩培養5 d，經4層紗布濾去菌絲，制成孢子懸浮液，在顯微鏡下觀察孢子形態。

1.5 棉花枯萎病菌毒素的提取

將棉花枯萎病菌菌株H70、7號生理小種和ATCC96291分別接種到PDA培養基上，25℃黑暗培養7 d，切取菌落邊緣直徑為6 mm的菌餅，放入100 m L察氏培養基[16]中，25℃、120 r·min－1振蕩培養15 d。培養液4層紗布過濾，過濾液3 000 r·m in－1下離心30 m in。上清液再次用3層濾紙過濾，收集濾液。將濾液置于65℃水浴30 min，得到粗毒素。取粗毒素50 m L，用1 mol·L－1的HCl調pH至2.5，用10 m L乙酸乙酯萃取3次，合并有機相，45℃旋轉蒸發去除有機相。蒸干后的殘留物用色譜級甲醇溶解并調整質量濃度為20 g·L－1，然后用孔徑為0.45μm的過濾器過濾得到毒素提取液，置于4℃冰箱中保存備用。

1.6 毒素的高效液相色譜分析

利用Waters-2695高效液相色譜儀（美國Waters公司）對毒素提取液進行分離、檢測。色譜柱為Agilent TC-C18（柱長250 mm，直徑4.6 mm，填料粒徑5μm），流動相A相為0.5%（質量分數）K2HPO4·3H2O溶液（使用前，用濃H3PO4將其pH調節至7.34），流動相B相為甲醇。梯度洗脫程序：0～20 m in，流動相B從50%（體積分數）逐漸提高到75%；20～25 m in，流動相B從75%逐漸降低到50%。流速為1 m L·m in－1，檢測波長為268 nm。鐮刀菌酸標準品（Sigma公司）用甲醇溶解并配制成質量濃度為10～1 000 mg·L－1的系列稀釋液，按照質量濃度從低到高的順序連續進樣，以進樣鐮刀菌酸標準品的質量濃度為橫坐標（x），以檢測到的峰面積為縱坐標（y）繪制標準曲線，得到回歸方程。對3個菌株的毒素提取物進行液譜分析，根據峰面積大小計算每個菌株鐮刀菌酸的產量[17]。收集3個菌株毒素提取液中的特異性物質，濃縮后進行質譜鑒定。

1.7 毒素的質譜分析

采用液質聯用儀（Triple TOF 5600，美國AB公司）對毒素中特異性物質進行鑒定。液相色譜柱為Shim-pack GIST C18（柱長100 mm，直徑2.1 mm，填料粒徑2μm），流動相A相為H2O，流動相B相為乙腈，洗脫條件為0～0.5 m in，流動相B為10%；0.5～1.5 m in，流動相B從10%提升到40%；1.5～2.5 m in，流動相B從40%升到95%；2.5～3.5 m in，流動相B為95%；3.5～3.6 m in，流動相B從95%降到10%；3.6～5.0 m in，流動相B為10%。流速：0.4 m L·m in－1，柱溫：40℃，進樣量：2μL。質譜條件：采用電噴霧電離源（Elaectrospray ionization，ESI），正離子掃描方式；檢測方式為飛行時間全掃描質譜和二級質譜（TOF MS IDA MS-MS）模式。電噴霧電壓為5 500 V，離子源溫度為500℃。TOF-MS掃描范圍的質核比（m/z）為20～500；觸發二級掃描范圍的m/z為30～500。

1.8 棉花枯萎病菌粗毒素對棉花葉片的致萎能力

采集健康一致的棉花葉片（冀棉11，對枯萎病敏感品種），用清水沖洗干凈。將棉花葉片置于含有水瓊脂的培養基中，用無菌針頭將葉片刺破，每個傷口滴加20μL（20 g·L－1）的粗毒素。將培養皿置于培養箱中25℃黑暗培養，3 d后測量病斑面積。設置20 g·L－1的鐮刀菌酸標準品作為陽性對照，甲醇為陰性對照，每個處理4個重復[18]。

1.9 不同類型土壤中棉花枯萎病菌致病力測定

分別從河北省保定市定興縣、邯鄲市成安縣和滄州市黃驊市的棉田中采集淺層土（去除表層土后，采集地下20 cm以內的土壤）。土壤樣品的理化性質（pH、電導率及有機質、全氮、全磷、全鉀、速效鉀、速效磷含量）由青島橫立檢測有限公司測定。將供試土壤和蛭石過篩按體積比1∶1充分混勻，121℃滅菌1 h，晾涼后再重復滅菌1次。將棉花枯萎病菌孢子懸浮液與土壤充分混勻，使土壤中孢子的含量達到106g－1。冀棉11種子經表面消毒后，于25℃下催芽，將露白的棉種播種到混有枯萎病菌的培養基質中，25℃恒溫室內培養（12 h光照，12 h黑暗）。播種20 d后調查棉花枯萎病的發病情況，計算病情指數[9]。

2 結果與分析

2.1 棉花枯萎病菌培養性狀比較

比較了H70、7號生理小種和ATCC96291在PDA培養基上的形態差異。結果表明，7號生理小種和H70均能形成明顯的氣生菌絲，而ATCC96291氣生菌絲較少（圖1）。在PDB培養基上25℃、160 r·m in－1震蕩培養5 d后，7號生理小種產生淡褐色（紫色）的色素，但H70和ATCC96291均沒有色素產生，且7號生理小種培養液的上清液呈淡粉色，H70和ATCC96291的上清液均無色素產生（圖2）。

圖1 棉花枯萎病菌菌株H70、7號生理小種（Race7）、ATCC96291的氣生菌絲觀察Fig.1 Aerial hypha of strains H70,race 7 and ATCC96291 of Fusarium oxysporum f.sp vasinfectum

圖2 棉花枯萎病菌菌株H70、7號生理小種（Race7）、ATCC96291的菌落形態及上清液觀察Fig.2 Morphology and supernatantof strains H70,race 7 and ATCC96291 of Fusarium oxysporum f.sp vasinfectum

進一步比較了H70、7號生理小種和ATCC96291在不同溫度下的生長情況。結果表明，3個菌株在25～30℃生長最好，7 d后菌落直徑達到3.4～4.2 cm，在35℃下不能生長。在20℃下，7號生理小種生長較快，而H70生長較慢；但在25℃和30℃下，H70和ATCC96291菌株生長較快，7號生理小種生長較慢（圖3）。

2.2 3株棉花枯萎病菌孢子形態比較

觀察3株棉花枯萎病菌在綠豆湯培養基中形成的孢子形態，結果（圖4）發現，7號生理小種形成的分生孢子以雙核小型孢子為主，孢子大小為（10～15）μm×（3～5）μm，存在少數多核大型孢子[（30～35）μm×（3～5）μm）]。H70菌株形成的分生孢子均為單核的小型分生孢子，孢子大小為（10～15）μm×（3～5）μm。而ATCC96291菌株形成的分生孢子均為大型分生孢子，孢子多核，大小為（30～35）μm×（3～5）μm。

圖3 棉花枯萎病菌菌株H70、7號生理小種、A TCC96291菌株在不同溫度下生長情況Fig.3 Grow th of strains H70,race 7 and ATCC96291 of Fusarium oxysporum f.sp.vasinfectum under different temperatures

圖4 棉花枯萎病菌7號生理小種、H70、ATCC96291菌株的孢子形態觀察Fig.4 The morphological features of strains H70,race 7 and ATCC96291 of Fusarium oxysporum f.sp.vasinfectum

2.3 3株棉花枯萎病菌毒素的色譜分析

利用液相色譜對棉花枯萎病菌新生理型菌株H70、7號生理小種和ATCC96291的毒素提取液進行分析。結果（圖5）顯示，3個菌株的毒素提取物中均存在1種特異性物質，保留時間為6.5 min，且該特異性物質與鐮刀菌酸具有相似的保留時間。由此推斷，3個菌株均產生鐮刀菌酸。

2.4 3株棉花枯萎病菌毒素的質譜分析

以鐮刀菌酸作為對照，進一步利用液質聯用儀對3株枯萎病菌中經液譜分離獲得的特異性物質進行質譜分析。結果（圖6）顯示，H70、7號生理小種和ATCC96291毒素提取液中的特異性物質m/z均為180.1，與鐮刀菌酸標準品的m/z相同，并且3個菌株毒素提取物中的特異性物質與鐮刀菌酸標準品的二級質譜圖相同。結果證明，3株棉花枯萎病菌均可產生鐮刀菌酸。

2.5 3株棉花枯萎病菌毒素含量分析

3株棉花枯萎病菌具有相同的生長速率（結果未列出）。利用鐮刀菌酸標準品構建了基于峰面積和鐮刀菌酸質量濃度的標準曲線，結果發現，鐮刀菌酸質量濃度在10～1 000 mg·L－1范圍內與峰面積具有較高的線性關系（y＝16 635x＋51 237，R2＝0.999）。根據此標準曲線，比較了3個菌株毒素提取物中鐮刀菌酸的質量濃度。結果表明，鐮刀菌酸的產量在3個菌株之間存在顯著性差異（表1）。棉花枯萎病菌7號生理小種毒素提取物中鐮刀菌酸的質量濃度最大，為1 259.32 mg·L－1；ATCC96291毒素提取物中鐮刀菌酸的質量濃度次之，為778.32 mg·L－1；而H70毒素提取物中鐮刀菌酸的質量濃度最小，為135.18 mg·L－1。上述結果證明，7號生理小種產生的鐮刀菌酸最多，而H70產生的鐮刀菌酸最少。

2.6 3株棉花枯萎病菌毒素的毒力檢測

將質量濃度為20 g·L－1的毒素采用葉片穿刺的方法接種于棉花葉片上，以20 g·L－1鐮刀菌酸為陽性對照，以甲醇和察氏培養基為陰性對照。結果顯示，鐮刀菌酸能引起棉花葉片發生大面積的萎蔫壞死，3個菌株的毒素提取液均能導致棉花葉片出現病斑，其中7號生理小種毒素提取液處理的病斑面積最大，其次是ATCC96291，而H70的毒素對棉花葉片的毒力最小（圖7）。

2.7 棉花枯萎病菌在不同土壤中的致病力測定

對采自黃驊市、定興縣和成安縣的土壤進行理化性質檢測，結果（表2）表明，黃驊市土壤堿性最強，有機質含量較低；定興縣的土壤為輕壤土，有機質含量較高；成安縣的土壤為褐土，土壤養分中等。

圖5 毒素提取液的高效液相色譜分析Fig.5 HPLC analysis of the toxins extracted from Fusarium oxysporum f.sp.vasinfectum

圖6 鐮刀菌產生的毒素提取物中特異性物質的質譜分析Fig.6 Mass spectrum analysis of the specific com pound in toxin extracts of Fusarium oxysporum f.sp.vasinfectum

表1 鐮刀菌酸的產量比較Table 1 Production of the fusaric acid in the toxin extracts of Fusarium oxysporum f.sp.vasinfectum

利用感病品種冀棉11測定7號生理小種和菌株H70在不同地區土壤中的致病力，結果（圖8）表明，在3種不同類型土壤中，7號生理小種比H70的致病力更強。7號生理小種在定興縣和成安縣的土壤中致病力較強，病情指數分別為68.2和59.3，在黃驊偏堿性土壤中的致病力較弱，病情指數為34.6。H70在成安縣和定興縣土壤中的致病力較高，病情指數分別為32.0和29.3，在黃驊市土壤中的致病力較弱，病情指數為21.4。

3 討論

圖7 棉花枯萎病菌毒素致病力測定Fig.7 Pathogenicity ofthe toxin extracts from Fusarium oxysporum f.sp.vasinfectum

表2 供試土壤理化性質Table 2 Physical and chem ical properties of the tested soils

圖8 棉花枯萎病菌7號生理小種和新生理型菌株H70在不同土壤中的致病力Fig.8 Pathogenicity of Fusarium oxysporum f.sp.vasinfectum race 7 and strain H70

棉花枯萎病是由尖孢鐮刀菌萎蔫專化型引起的棉花土傳病害。棉花枯萎病菌通過產生纖維素酶[19]和植物毒素[14]而引起棉花葉片萎蔫，植物生長緩慢，其中產生植物毒素是棉花枯萎病菌主要的致病機制。植物毒素會破壞植物細胞原生質膜的透性，造成細胞內電解質外滲，植物吸水困難而呈現萎蔫[20]。另外，毒素還可以抑制植物防御反應和呼吸活性，降低植物對逆境的抗性，從而導致植物生長緩慢甚至死亡[21-22]。澳大利亞生理型菌株和4號生理小種分別對澳大利亞和美國的棉花生產造成嚴重的產量損失，目前已經明確鐮刀菌酸是澳大利亞生理型菌株和4號生理小種主要致病因子[23]。我國棉花枯萎病菌存在3號、7號、8號生理小種，最近研究發現我國存在不同于3號、7號和8號生理小種的新生理型菌株，命名為H70，該菌株與澳大利亞生理型菌株具有更加緊密的親緣關系[9]。本研究首先比較了7號小種、新生理型菌株H70和澳大利亞生理型菌株ATCC96291的培養性狀。結果發現，在PDB培養基中，7號小種可以產生淡褐色色素，而H70和ATCC96291菌株均不能產生色素。Bridge等研究發現，在含有七葉苷（Aesculin）的培養基中，2號、3號和4號枯萎病菌小種可以產生七葉素（Aesculetin），從而使培養基呈現深紅色，而1號小種和來自非洲的棉花枯萎病菌不能將七葉苷轉化為七葉素[24]。關于H70菌株和ATCC96291菌株是否可以將七葉苷轉化為七葉素需要進一步研究。尖孢鐮刀菌在無性階段產生多核的大型分生孢子和單核的小型分生孢子，其中大型分生孢子在其分類鑒定中具有重要意義[25]。本研究比較了7號小種、新生理型菌株H70和澳大利亞生理型菌ATCC96291產生分生孢子的形態，結果發現，ATCC96291菌株產生多核的大型分生孢子，7號小種產生多核和雙核的大型分生孢子，而新生理型菌株H70主要產生單核的小孢子。據此推測，分生孢子的形態可能是新生理型菌株的重要分類依據之一。為了明確新生理型菌株H70產生的毒素種類，本研究對棉花枯萎病菌該菌株、7號生理小種和澳大利亞生理型菌株ATCC96291的毒素提取物進行了液相色譜和質譜分析，發現3株棉花枯萎病菌產生的毒素具有一致的保留時間和相對分子質量，通過與鐮刀菌酸標準品進行比較，證明3株棉花枯萎病菌均產生毒素鐮刀菌酸。

棉花枯萎病菌不同生理小種產生的鐮刀菌酸產量不同，并且鐮刀菌酸的致病力與其產量正相關[26]。澳大利亞生理型菌株具有較強的致病力，對澳大利亞主要的栽培品種表現較強的致病力。研究發現，澳大利亞生理型菌株可以產生大量的鐮刀菌酸，并且致病力不同的菌株之間，鐮刀菌酸的含量有所差異，即鐮刀菌酸的產量與菌株的致病力相關[14]。本研究選用的7號生理小種表現強致病力，而新生理型菌株呈現弱致病力，澳大利亞標準菌株呈現中等致病力。為了明確不同菌株的致病力是否與其產生的鐮刀菌酸產量相關，本研究定量比較了3個菌株產生的鐮刀菌酸的產量，結果發現，7號生理小種的鐮刀菌酸產量最高，而新生理型菌株產生的鐮刀菌酸產量最低，不同菌株的致病力與其鐮刀菌酸產量呈現正相關。本研究還采用葉片穿刺法檢測3株棉花枯萎病菌產生的毒素對棉花葉片的致病力，結果顯示其毒素均可以使棉花葉片出現病斑，7號生理小種的毒素造成的病斑面積最大，而新生理型菌株的毒素造成的病斑面積最小。該結果同樣證明鐮刀菌酸是棉花枯萎病菌主要的致病因子，其菌株的致病力強弱與其產生的鐮刀菌酸產量相關。

棉花枯萎病菌通過分泌植物毒素，不僅影響棉花的正常生長，而且抑制棉花根際其他有益微生物的生長，從而利于枯萎病菌在棉花根部的侵入和定植。而棉花根部存在大量的有益微生物，不僅可以抑制枯萎菌的生長，還可以降解植物毒素，緩解植物的中毒癥狀，從而發揮生物防治的效果[27]。尖孢鐮刀菌番茄專化型（F.oxysporumf.sp.lycopersici）通過分泌鐮刀菌酸而引起番茄萎蔫。Toyoda獲得1株能降解鐮刀菌酸的無致病性的青枯病菌（Pseudomonassolanacearum），該細菌處理番茄根際后能有效緩解尖孢鐮刀菌引起的番茄萎蔫癥狀[28]。棉花枯萎病菌4號生理小種可以產生大量的鐮刀菌酸，對美國大部分主栽棉花品種表現較強的致病力，給美國棉花生產造成嚴重的經濟損失。研究發現，根際的真菌魯氏毛霉（Mucorrouxii）可以將鐮刀菌酸代謝為8-羥基鐮刀菌酸，后者對棉花的致病力較低。因此，棉花根部施用魯氏毛霉可以防治枯萎病。因此，明確了棉花枯萎病菌毒素種類，可以有目的地篩選降解毒素的微生物，用于創制新型微生物殺菌劑[12]。本研究明確了棉花枯萎病菌7號生理小種和新生理型菌株H70產生的植物毒素為鐮刀菌酸，可以篩選有效降解鐮刀菌酸的微生物，從而有針對性地開發防治棉花枯萎病的微生物殺菌劑。

本研究所用的新生理型菌株H70與澳大利亞生理型菌株ATCC96291具有較近的親緣關系。前期研究評價了新生理型菌株對海島棉匹馬90以及陸地棉冀棉11、冀棉169和中植棉2號的致病力，發現同7號生理小種相比，H70的致病力較弱[9]。澳大利亞菌株ATCC96291對澳大利亞所有的棉花品種均表現出較高的致病力，并且在偏堿性的土壤中致病力較強[8]。因此，本研究進一步評價了新生理型菌株H70和7號生理小種在不同土壤中的致病力。結果發現，相比7號生理小種，H70在3中不同類型土壤中的致病力均較弱；隨著土壤堿性的增強，7號生理小種和H70的致病力均降低，且后者較前者降低更緩慢，推測H70菌株較7號生理小種對堿性土壤的適應能力可能更強。

4 結論

棉花枯萎病菌新生理型菌株H70不能形成淡褐色色素，形成的氣生菌絲較多，產生單核的小型分生孢子。H70、7號小種和澳大利亞生理型菌株ATCC96291均產生鐮刀菌酸，7號生理小種產生的鐮刀菌酸含量最高，而H70的鐮刀菌酸含量最低。鐮刀菌酸可以引起棉花葉片出現壞死癥狀，并且病斑大小與鐮刀菌酸的含量呈正相關性。新生理型菌株在3種不同類型土壤中的致病力均較低。