黑米啤酒釀造中主要風味物質變化的研究*

陳亮，龐瑩瑩，張明亮，黃鷺強

（福建師范大學生命科學學院，福建 福州 350117）

我國的黑米資源豐富[1]，民間具有食用習慣。黑米所含的蛋白質是白米的1.25～1.5倍[2]，賴氨酸含量高[3]，現代醫學認為黑米色素具有固顏保健、防衰緩老等功效[4-6]。黑米表皮含有大量的纖維素和果膠等物質[7]不易蒸煮，口感較差。目前產品的開發僅限于主食產品，充分挖掘中國黑米資源，高效利用其營養價值并開發新產品，有助于推動黑米加工現代化。

黑米作為輔料加入啤酒釀造過程中可改變啤酒風味。黑米中的亞鐵離子、鋅離子等微量元素可有效降低啤酒中雙乙酰的含量[8,9]；黑米中的花青素對啤酒色澤具有改善作用[10]。啤酒揮發性香氣成分對于啤酒的特征風味形成尤其重要，通過分析從香氣、口感方面提高啤酒質量有非常重要的意義。本研究對黑米啤酒釀造過程中的主要理化指標和揮發性香氣成分進行分析，比較釀造過程的六個代表性階段物質變化的差異，為黑米啤酒的開發提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料

黑米，品種為紫兩優737，產自寧化縣水茜鎮；麥芽、酒花、S-189酵母均購自濟南雙麥啤酒物資有限公司。

1.2 試劑

氫氧化鈉、鄰苯二甲酸氫鉀、無水乙醇、氯化鈉、環己酮等，均為國產分析純。

1.3 儀器

PAL-1 數顯糖度計，日本ATAGO；ST 3100 pH計，美國OHAUS；Snap 41酒精計，奧地利Anton Paar；集熱式磁力攪拌器，江蘇金壇；固相萃取頭（2 cm-50/30μmDVB/CAR/PDMS），美國Supelco；7890N/5977C氣相色譜質譜聯用儀，美國Agilent。

1.4 方法

1.4.1 黑米啤酒的釀造方法

黑米啤酒的釀造工藝參考楊剛[11]的方法略作調整，分為前期原料處理、粉碎、糊化、糖化、過濾、煮沸、旋沉、發酵等步驟，如圖1所示。

圖1 黑米啤酒釀造流程圖

⑴ 原料處理：黑米粉碎之前挑去肉眼可見雜質，由于其含有豐富的水溶性維生素和色素，避免清洗以減少營養物質的流失。

⑵ 粉碎：稱取2.3 kg黑米和20.7 kg麥芽，即將二者以“黑米∶麥芽”為1∶9的加入比例進行粉碎，并且要求分別粉碎。黑米經過粉碎成粉末狀備用；麥芽在粉碎前10 min需要加入1.5 kg的水濕潤麥芽，待麥芽外表面無明顯水珠時，進行粉碎。

⑶ 黑米糊化：首先，需在糊化鍋內加入20 L蒸餾水，升溫至50 ℃，啟動糊化鍋攪拌，將粉碎好的黑米投入糊化鍋。50 ℃保溫20 min后，升溫至70 ℃，保溫20 min。

⑷ 糖化：在糖化鍋內加入70 L水，升溫至37 ℃后，啟動糖化鍋攪拌，將粉碎好的麥芽、液化酶10 g、氯化鈣20 g和石膏5 g投入糖化鍋。37 ℃保溫20 min，升溫至50 ℃保溫40 min。啟動攪拌，將糊化的黑米泵入糖化鍋內，升溫至65 ℃，靜置保溫65 min，進行糖化。最后，升溫至78 ℃，保溫10 min。

⑸ 過濾、煮沸、旋沉：糖化結束后將糖化產物進行過濾、回流，至麥汁澄清后，將其煮沸60 min，期間需加入45 g苦味酒花和40 g香味酒花。煮沸后進行旋沉處理，進一步澄清麥汁，并將澄清好的麥汁冷泵入發酵罐。

⑹ 發酵：在泵送麥汁的同時將活化的S-189酵母同時接入發酵罐，發酵溫度保持在12 ℃，第3天封罐，第7天第一次排酵母（FY），降溫至9 ℃，期間每隔2 d排一次酵母，最后一次排酵母（LY）開始降溫度至-1 ℃直至成熟，成熟后每隔1 d充1次二氧化碳，共3次，獲得成品（BB）。

1.4.2 糖度、總酸及酒精度的測定

分別在黑米啤酒的代表性發酵階段，即接種前（BI）、封罐前（BF）、第一次排酵母前（FY）、最后一次排酵母前（LY）、第一次充二氧化碳前（FC）、成品（BB）6個工藝節點取樣，檢測相應的理化指標和香氣成分。

1.4.3 糖度、總酸及酒精度的測定

黑米啤酒的糖度、總酸及酒精度參照GB/T 4928—2008《啤酒分析方法》進行測定。

1.4.4 揮發性香氣成分的測定分析

揮發性香氣成分的定性定量分析參照王一冉[12]的方法進行測定，通過頂空固相微萃取和氣相色譜-質譜儀聯用法測定樣品的揮發性成分，樣品中香氣各組分經計算機譜庫（NEST14）檢索及分析得到。

1.4.4.1 樣品處理

準確量取10.00 mL黑米啤酒置于20 mL的頂空進樣瓶中，加入3.6 g氯化鈉和0.2 mL濃度為1 mL/L的環己酮(其中環己酮母液為10 g/L，取50μL加到5 mL待測樣品中，故理論環己酮最終濃為100 mg/L），加蓋密封，重復實驗3次；將老化處理后的50/30μm DVB/CAR/PDMS固相微萃取頭插入頂空進樣瓶，將纖維頭懸在頂空瓶上方，在溫度為50 ℃的磁力攪拌條件下萃取30 min后，取出萃取頭，立即插入氣相色譜儀進樣口，于250 ℃解析5 min。

1.4.4.2 色譜、質譜條件

⑴ 氣相色譜條件

進樣模式：不分流；色譜柱：HP-INNOWAX Polyethylene Glycol（30 m×0.25 mm×0.25μm）。采用氦氣為載氣，流速為1.0 mL/min，進樣口溫度為250 ℃，傳輸線230 ℃。程序初始溫度為40 ℃，保持1 min，以8 ℃/min升溫至120 ℃，再以1 ℃/min升溫至155 ℃，最后以5 ℃/min的速率上升至220 ℃，保持5 min。

⑵ 質譜條件：電子電離（EI）源，電子能量為70 eV，發射電流100 μA，檢測器電壓為1.4 kV。掃描范圍35～550 amu，離子源溫度為230 ℃。

1.4.5 數據處理

每個實驗平行3次，數據采用“平均值±標準差”的方式表示。采用統計軟件SPSS 19.0 處理相關數據，用Duncan氏多重比較法對各實驗處理間的差異顯著性進行比較分析，圖表制作軟件為origin 8.5。

2 結果與分析

2.1 黑米啤酒主要理化指標的變化

在啤酒釀造的發酵各代表性階段分別取樣，測定麥汁濃度、總酸和酒精度并分析比較，結果見圖2。

圖2 黑米啤酒的主要理化指標變化

由圖2可知，黑米啤酒釀造過程中糖度的變化幅度最大，成品中所測得的糖度相對于接種前下了10.7 °Bx。接種前（BI）至封罐前（BF）糖度下降速度最快。總酸則呈現前期逐步上升，之后在第一次充二氧化碳（FC）前達到穩定，成品（BB）中總酸度比接種前（BI）上升了7 g/L。接種后酵母代謝產生酒精，到其中最后一次排酵母（LS），成品中酒精度不再上升。

2.2 黑米啤酒揮發性香氣成分的測定

將黑米啤酒發酵各代表性階段取樣并進行揮發性香氣成分測定，結果如表1。

由表1可知，黑米啤酒釀造過程共鑒定出主要香氣成分26種，其中醛類4種，酯類12種，酸類3種，醇類6種，其他化合物1種。在6個階段中，屬于酯類的主要香氣成分物質是辛酸乙酯和癸酸乙酯，這些物質是黑米啤酒水果香味主要來源；酸類物質中辛酸在整個發酵階段始終占比最大，是黑米啤酒發酵過程中酸味的主要來源；乙醇作為醇類中最主要香氣物質，也是整個黑米啤酒中相對含量占比最多的化學物質，是發酵過程中酒精氣味逐漸濃郁的主要原因[13]。

表1 黑米啤酒釀造階段主要香氣成分

2.3 黑米啤酒揮發性香氣成分的比例變化

將黑米啤酒發酵各代表性階段的揮發性香氣成分變化繪圖分析，結果如圖3所示。由圖3可知，黑米啤酒發酵6個代表性階段的香氣成分總體接近，但比例不同。

圖3 不同發酵階段黑米啤酒揮發性香氣成分比較

接種前（BI）的主要化合物是醛類，且無酸類化合物的存在，而醇類和酯類的相對含量存在輕微的差異。在封罐前（BF），檢測不到醛類物質。

接種前（BI）共檢測出7種揮發性化合物，醛類相對含量約占66.31%，苯乙醛作為主要的醛類揮發性香氣成分，其相對含量達到(33.03±0.03)%。

封罐前（BF）共檢測出的16種揮發性化合物，酯類相對含量64.09%，如癸酸乙酯等共8種物質；醇類相對含量27.17%，如苯乙醇等4種；酸類相對含量8.43%，如辛酸等3類物質。

第一次排酵母前（FY）檢測出的17種揮發性化合物，酯類相對含量為46.47%，共包括9種酯類；醇類相對含量為35.68%，共5種物質，該階段增加了丙醇，該階段啤酒較前兩次測定酒精味更為刺激[14]；酸類相對含量7.53%。癸酸乙酯相對含量較高（22.16%），具有類似椰子香味，該階段乙醇的相對含量升高達24.88%。

最后一次排酵母前（LY）共檢測出的17種揮發性化合物，酯類共有9種，相對含量50.87%，醇類共5種，相對含量37.21%；酸類共3種，相對含量11.95%，

第一次充二氧化碳前（FC）共檢測出16種揮發性化合物，酯類相對含量8種，相對含50.51%；醇類相對含量有4種，相對含量36.61%；酸類相對含量3種，為12.06%。

成品（BB）共檢測出18種揮發性化合物，酯類有9種相對含量為46.10%；醇類6種相對含量為43.07%，該階段增加了醇類物質2-環己烯-1-醇；酸類3種相對含量12.75%。

2.4 黑米啤酒揮發性香氣成分的種類變化

將黑米啤酒發酵各代表性階段的揮發性香氣成分變化繪圖分析，結果見圖4。

圖4 黑米啤酒在不同取樣節點的風味物質種類變化

由圖4可知，黑米啤酒在接種后，通過酵母發酵產生新的風味物質，主要為酯類、醇類、酸類三類化合物，這與Chengtuo N等的研究結果相近[15-17]。在封罐前（BF）、第一次排酵母前（FY）、最后一次排酵母前（LY）、第一次充二氧化碳前（FC）和成品（BB）中，主要的酯類化合物、醇類化合物和酸類化合物的種類數及成分數波動較小，總體穩定。各類化合物的占比始終呈現酯類最多，其次是醇類，而后是酸類物質，這與周煜等的研究結果相近[13]。揮發性酯是黑米啤酒的主要特征香氣成分，酸是啤酒主要呈味物質[18]。

3 結論

揮發性香氣成分是黑米啤酒的重要品質指標，本研究共檢出26種揮發性香氣成分。在釀造過程中，麥汁發酵，其糖度逐步降低；總酸逐漸升高，隨后呈基本保持穩定的趨勢。黑米啤酒不同的釀造階段產生各種風味物質均以醇類、酯類、酸類為主，揮發性香氣成分隨著發酵進行大幅增加，酯類增加最為明顯，隨后保持穩定，相對含量大小依次為酯類、醇類、酸類。酯類作為啤酒中主要的揮發性香氣成分，相對含量在發酵后期穩定在了50%左右。