鹽脅迫對醉馬草和高羊茅種子萌發及幼苗生長的影響

陳雅琦，蘇楷淇，李春杰

（蘭州大學草地農業生態系統國家重點實驗室/ 蘭州大學農業部草牧業創新重點實驗室/ 蘭州大學草地農業教育部工程研究中心/蘭州大學甘肅省西部草業技術創新中心 / 蘭州大學草地農業科技學院，甘肅蘭州730020）

鹽漬化土地是有限土地可利用資源的重要組成部分。全球約有10億hm2土地受到鹽漬化的侵襲，且以每年100萬～150萬hm2的速度快速增加[1]。中國是遭受土壤鹽漬化危害最為嚴重的國家之一，鹽漬化土地面積達3.6×107hm2，占全國可利用土地面積的4.88%[2]，且大多分布在甘肅、新疆等西北干旱地區。中重度土壤鹽漬化(土壤含鹽量>0.3%)會顯著抑制植物的生長發育[3-4]，因此，土壤鹽漬化是制約西北旱區農業及生態恢復的重要因素之一。

草坪草作為城市綠化的重要組成部分，具有改善和美化城鎮居住環境的積極作用。其種植水平是衡量當地綠化效果的重要標準。草坪草具有一系列獨特的功能，生物學特征和栽培管理技術，與牧草等農作物之間既有特殊性又有其營養共性，故發展耐鹽草種可為發掘及栽培耐鹽牧草等作物提供參考依據[5]。選育及栽培耐鹽草坪草種可充分利用有限土地資源，對西北地區農牧業發展、生境恢復及美化環境具有十分重要的意義。故發掘及種植耐鹽草坪草種已成為亟待解決的問題。

高羊茅(Festuca arundinacea)為冷季型草坪草，屬禾本科羊茅屬多年生上繁禾草，耐踐踏、耐干旱、成坪常綠優美且能適應大多數土壤類型，便于管理[6-8]，常作為先鋒草坪草種使用。醉馬草(Achnatherum inebrians)為冷季型禾草，屬禾本科芨芨草屬多年生上繁禾草，常見于西北高海拔地區[9]，于1994年發現其種子并檢測到攜帶內生真菌且攜菌率接近100%[10-11]，在國際上與美國葦狀羊茅–內生真菌、新西蘭多年生黑麥草–內生真菌并稱為三大禾草內生真菌[11]。一方面，內生真菌與醉馬草互為共生體，互惠互利。研究表明，醉馬草–內生真菌共生體具有抗生物脅迫[12-13]、抗寒[14]、抗旱[15]、抗金屬[16]、耐鹽堿[17-18]，生長快、競爭力強[19]等優良草坪草種特性。另一方面，醉馬草–內生真菌體內產生的有毒生物堿使其成坪其間免受啃食[20-22]。近年來醉馬草因其優良特性被作為新型草坪草種廣受關注。

在鹽漬土壤環境下，多年生禾草建植草坪的關鍵在于處在鹽濃度較高土壤表層的種子的發芽能力以及幼苗期間的生存能力。有關鹽脅迫對冷季型草坪草的種子萌發和幼苗生長的研究較多，但以成熟草坪草種作為對照，來研究醉馬草作為新型草坪草種潛力的研究卻鮮見報道。醉馬草與高羊茅同屬多年生上繁禾草，具有一定相似性，且高羊茅是應用最為廣泛的草坪草之一，故與高羊茅作為對照，可論證醉馬草作為新型草坪草種的發展潛力。因此以帶菌醉馬草、不帶菌醉馬草、高羊茅‘俠客島’、高羊茅‘獵狗6號’作為試驗對象，研究不同鹽脅迫對兩種禾草種子萌發特性和幼苗特性的影響并對其耐鹽性進行綜合評價，為西北鹽漬地區冷季型草坪草的選育、建植和管理提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試材料為西北地區常見禾草，共2屬4份種質。分別為帶菌醉馬草，不帶菌醉馬草，高羊茅‘俠客島’和高羊茅‘獵狗6號’，高羊茅種子由甘肅紅瑞園林綠化工程有限公司提供。試驗所用醉馬草種子于2019年8月采自甘肅省夏河縣(102°33′E，35°11′N)，鏡檢發現其帶菌率100%，將一半醉馬草種子用稀釋100倍的70%甲基托布津浸泡2 h滅菌，滅菌后再次鏡檢，確認帶菌率為0，得到不帶菌的醉馬草種子。將確認后帶菌(A1)/不帶菌(A2)的醉馬草種子和‘俠客島’(A3)、‘獵狗6號’(A4)種子分別在5℃下密封保存，試驗前采用物理方法打破種子休眠以供后續試驗使用[23]。

將覆蓋兩層濾紙、直徑為12 cm的培養皿進行2 h的150℃高溫消毒，避免種子在試驗過程中受到污染。

1.2 試驗方法

1.2.1 種子發芽試驗

種子發芽試驗于2020年6月采用雙層濾紙培養法進行。選取顆粒飽滿、大小均一且無病害的4個品種禾草種子，用蒸餾水浸泡24 h后晾干。用質量分數分別為0.1%(C1)、0.3%(C2)、0.5%(C3)、0.7%(C4)、0.9%(C5)的NaCl溶液作為鹽脅迫處理液，蒸餾水作為對照(CK)。在培養皿中平鋪兩層濾紙，4份種質分別放置其中，每皿50粒，然后加入對應濃度10 mL的鹽溶液處理，每個處理3個重復，共72個培養皿。每隔2 d加入相同的水分，以保證各鹽脅迫處理液濃度保持不變。將培養皿置于25℃、光暗周期為12 h的恒溫培養箱內。每日觀察記錄種子萌發及幼苗生長狀況。培養皿內發芽溫度為25℃、每日光照時數為12 h。

1.3 指標測定

以芽身超過本身長度的1/2或超過根長作為種子發芽的標志，每隔24 h觀察記錄一次發芽狀況。各種子萌發截止時間不同(連續3 d無種子發芽即為萌發停止)，帶菌醉馬草(A1)第15天結束，不帶菌醉馬草(A2)第15天結束，俠客島(A3)第13天結束，獵狗6號(A4)第14天結束。種子發芽試驗結束后進行相關指標的計算與評估。計算公式如下：

種子發芽指標：

發芽率= (末期發芽數/供試種子數)×100%；

相對發芽率=(處理組發芽率/對照組發芽率)×100%；

發芽勢=(發芽高峰時種子的發芽總數/供試種子數)×100%；

相對發芽勢=(各個處理的發芽勢/對照組的發芽勢)×100%；

式中：Gi為不同培養時間(t) 的發芽種子數，Dt為相應的培養時間，S為幼苗高度。

幼苗生長及根系指標：發芽試驗結束后，每個處理隨機取10粒種子，分別測其幼苗高度(S)、胚根長(RL)，不足10株的全部測量，取其平均值。

相對胚根長= 處理組平均胚根長/對照組胚根長；

根冠比= 平均胚根長/平均苗高。

耐鹽性評價指標：

1)種子萌發階段。分別以A1、A2、A3、A4這4種禾草種子的相對發芽率為因變量(y)，以鹽濃度為自變量(x)建立函數方程，以相對發芽率下降至75%、50%、10%時所對應的NaCl溶液濃度作為4份種質的耐鹽適宜濃度、耐鹽半致死濃度及耐鹽極限濃度。

2)幼苗生長階段：分別以A1、A2、A3、A4的相對胚根長為因變量(y)，以鹽濃度為為自變量(x)建立函數方程，以相對胚根長下降50%時所對應的NaCl溶液濃度作為4份種質幼苗的耐鹽閾值。

1.4 數據處理

采用Excel 2010統計數據并制圖，采用SPSS 20.0軟件進行發芽率、發芽勢等種子發芽指標數據的方差分析，并通過Duncan’s新復極差法進行多重比較。將4份種質的相對發芽率和相對胚根長度與鹽濃度進行最優曲線估計與曲線回歸分析，從而對4份種質的萌發期和幼苗期的耐鹽性分別進行綜合評價。

2 結果與分析

2.1 鹽脅迫對醉馬草和高羊茅種子發芽率和發芽勢的影響

4份種質材料的種子發芽率隨鹽濃度的升高呈下降趨勢，其中A1在0.1%(C1)、0.3%(C2)、0.5%(C3)鹽濃度下，A2在0.1%(C1)、0.3%(C2)鹽濃度下的發芽率略高于對照組，說明輕中度的鹽分脅迫對A1和A2的種子萌發無顯著影響(P>0.05)(表1)。A1和A2在濃度為0.5%時的發芽率仍能維持在65%以上，濃度為0.7%時發芽率才顯著降低(P<0.05)。兩者發芽率在任一鹽濃度下均無顯著差異。A3在鹽濃度為0.5%時發芽率顯著下降，達到0.7%時停止發芽。A4在鹽濃度為0.7%時發芽率顯著降低。在大于0.5%的鹽分脅迫下，A3與A4的發芽率顯著低于A1、A2。除A1和A2的0.3%以及A3、A4的0.5%鹽濃度外，4份種質的種子發芽勢均低于對照組且隨鹽濃度的升高呈下降趨勢，其中A1、A2、A4的發芽勢在0.7%的鹽脅迫下顯著降低，A3在濃度為0.5%時，發芽勢顯著降低且在0.7%時不再發芽。鹽濃度大于0.5%時，A1發芽勢顯著高于A3但與A2、A4差異不顯著。綜上可知，0.7%及以上的NaCl鹽分脅迫可顯著抑制種子萌發，使其發芽率和發芽勢顯著降低。與對照相比，受到0.7% NaCl脅迫的A1、A2、A3、A4的發芽率分別下降34.38%、56.16%、100%和68.06%，發芽勢分別下降55.32%、70.69%、100%和84.85%；受到0.9% NaCl脅迫的A1、A2、A3、A4的發芽率分別下降35.94%、54.79%、100%和73.61%，發芽勢分別下降57.45%、81.03%、100%和81.80%。

表1 鹽脅迫對種子發芽率和發芽勢的影響Table 1 Effect of salt stresson seed germination rateand energy

2.2 鹽脅迫對醉馬草和高羊茅種子發芽指數、活力指數的影響

4份種質材料的種子發芽指數和活力指數均隨鹽濃度的升高呈下降趨勢，其中A1、A2在0.1%、0.3%鹽濃度下的發芽指數與活力指數略高于對照組，A3在0.3%鹽濃度下的發芽指數高于對照組且無顯著差異(P>0.05)(表2)。說明中輕度的鹽分脅迫對以上3種種子的萌發無顯著影響。除0.1%和0.3%鹽脅迫外，A1、A2的發芽指數與活力指數無顯著差異。除對照外，在任一鹽濃度下，A1、A2、A4的發芽指數和活力指數均顯著優于A3(P<0.05)。由此可知，鹽分脅迫對于A3種子萌發的抑制尤為強烈。與對照相比，A1在鹽濃度為0.7%和0.9%時發芽指數顯著降低，較對照分別下降48.27%、52.80%，在鹽濃度為0.5%及以上時，其活力指數顯著下降，下降幅度分別為20.56%、78.48%、78.62%。A2在鹽濃度為0.7%和0.9%時發芽指數與活力指數顯著降低，分別下降66.60%、72.41%和73.58%、90.06%。A3在鹽濃度為0.5%及以上時發芽指數和活力指數顯著降低，分別降低了69.19%和84.46%，且在濃度達到0.7%時兩指標驟降至0，表明高濃度鹽分脅迫已使A3停止萌發。A4在鹽濃度為0.5%及以上時發芽指數顯著降低，分別下降38.87%、85.95%、87.41%，其活力指數在輕中度鹽脅迫(0.3%和0.5% NaCl)時已顯著降低，下降幅度為28.79%和66.98%，并在重度脅迫(0.7%和0.9% NaCl)時驟降95.54%與95.72%。綜上可知，0.7%及以上的重度鹽脅迫可顯著抑制A1、A2的種子萌發，0.5%及以上的重度鹽脅迫抑制可顯著抑制A3、A4的萌發。A3的種子萌發狀況顯著弱于其余種質。

表2 鹽脅迫對種子發芽指數和活力指數的影響Table 2 Effect of salt stresson seed germination and vigor indexes

2.3 鹽脅迫對醉馬草和高羊茅幼苗生長的影響

在0.1%、0.3%輕度鹽脅迫下的苗高略高于對照組且無顯著差異(P>0.05)(表3)，A4在0.1%的鹽濃度下同樣如此。說明輕度鹽脅迫對以上兩種種質幼苗高度的變化無顯著影響。A2在0.1%、0.3%鹽濃度下的幼苗高度顯著高于對照組(P<0.05)，與對照組比，分別提高了25%、28.76%。表明輕度鹽脅迫對于A2幼苗的生長有一定的促進作用。與對照相比，A1在鹽濃度為0.5%及以上時苗高顯著降低，分別下降14.09%、57.94%、53.24%。A2在0.7%、0.9%時苗高顯著下降，分別下降45.53%、72.63%。A3在0.5%及以上的中高度鹽脅迫時苗高顯著降低，下降幅度為58.71%，并在0.7%時驟降至0。表明0.7%及以上的重度鹽脅迫可使A3幼苗停止生長。A4在0.3%鹽濃度時苗高出現顯著降低，較對照組分別下降12.32%、48.12%、69.39%和79.63%。綜上可知，0.5%及以上的中高度鹽脅迫可顯著抑制A1、A3兩種禾草的幼苗生長，鹽濃度為0.3%時的輕度脅迫就可顯著抑制A4的幼苗生長。0.7%及以上的重度鹽脅迫才可顯著抑制A2的幼苗生長。

從胚根長度變化來看(表3)，4份種質的胚根長均低于對照組且隨鹽濃度的升高呈下降趨勢。與對照相比，A1和A4在鹽濃度為0.7%及以上時胚根長顯著降低(P<0.05)，分別降低了31.56%和36%、37.85%和60.73%。A2僅在鹽濃度為0.9%時胚根長才顯著降低，降低了58.92%。而A3的胚根長在任一鹽脅迫下均較對照顯著降低。說明0.7%及以上的重度鹽脅迫可顯著抑制A1、A4的胚根生長。0.9%的重度鹽脅迫才可顯著抑制A2的胚根生長，而任一鹽分脅迫都可顯著抑制A3幼苗胚根生長。

從根冠比來看(表3)，隨著鹽濃度的升高，4份種質的幼苗根冠比均基本呈上升趨勢。其中A2、A3在鹽濃度為0.1%、0.3%時根冠比略低于對照組但無顯著差異(P>0.05)，A4在鹽濃度為0.1%時同樣如此。說明輕度鹽脅迫對A2、A3、A43份種質的根冠比無顯著影響。與對照相比，A1在鹽濃度為0.7%及以上時根冠比顯著提高(P<0.05)，分別提高了58.33%和50.00%。A2僅在鹽濃度為0.9%時根冠比顯著提高，提升幅度為49.52%。A3在鹽濃度為0.5%時根冠比顯著提高，提升36.49%。A4則在鹽濃度為0.5%及以上時根冠比顯著提高，分別提高31.58%、52.08%、48.31%。綜上可知，鹽濃度為0.5%及以上的中重度鹽脅迫對幼苗高度的影響顯著高于對胚根生長的影響。

2.4 醉馬草和高羊茅綜合耐鹽性評價

將4份種質的相對發芽率和相對胚根長度與鹽濃度進行最優曲線估計與曲線回歸分析(表4)，結果表明， A1、A2、A3、A4的相對發芽率與鹽濃度之間均呈現良好的三次曲線函數關系且擬合程度最優。A1和A3的相對胚根長與鹽濃度濃度呈良好的三次曲線函數關系時擬合程度最優。A2和A4則與鹽濃度呈現出良好的二次曲線函數關系時擬合程度最優。由建立的最優函數方程可知(表4、表5)，在種子萌發階段(相對發芽率)，A1、A2、A3、A4的耐鹽適宜濃度分別是0.70%、0.60%、0.37%和0.49%。耐鹽半致死濃度分別為0.98%、0.72%、0.46%和0.61%。耐鹽極限濃度分別為1.02%、0.91%、0.61%和0.87%，從大到小依次為A1>A2>A4>A3。幼苗階段(相對胚根長)的A1、A2、A3、A4的耐鹽閾值分別為1.23%、1.01%、0.44%和1.09%，從大到小依次為A1>A4>A2> A3。

表3 鹽脅迫對4份種質幼苗生長的影響Table 3 Effect of salt stresson seedling growth of four germplasms

表4 鹽脅迫下4份種質的相對發芽率與鹽濃度的回歸分析Table 4 Regression analysis of relative radicle length and salt concentration of four germplasms

表5 鹽脅迫下4份種質的相對胚根長與鹽濃度的回歸分析Table 5 Regression analysis of relative germination rate and salt concentration of four germplasms

綜上可知，無論是在種子萌發階段還是幼苗生長階段，A1耐鹽性均為最優，A3均為最差。種子萌發階段A2耐鹽性優于A4，幼苗生長階段的A4則優于A2。

3 討論

3.1 鹽脅迫對醉馬草和高羊茅種子發芽的影響

植物的生長發育受到多種環境因素的影響，包括干旱、寒冷和鹽堿脅迫等。種子萌發和幼苗生長狀況是評估種質質量的重要指標，也是建植草坪的必要基礎，但同時處在萌發階段的種子也是極為脆弱的[24]。鹽分逆境下的種子通常表現為生命力衰弱、胚芽、胚根等生長受抑，甚至停止萌發[25-26]。NaCl鹽分脅迫對植物發芽的影響由兩部分組成。一是，高鹽環境下的Na+含量超高，對植物造成了單鹽毒害。植物吸收過多Na+導致體內出現離子失衡。二是，植物體內的滲透勢相對于鹽溶液過高，使植物體內水分流失，造成植物脫水等不良反應[27]。

發芽率、發芽勢、發芽指數等指標可反映出種子活力、出苗速度和整齊度等發芽特性。4份種質的種子發芽率和發芽勢均隨鹽濃度的上升呈下降趨勢，僅有帶菌醉馬草的發芽率和發芽勢在輕度鹽脅迫時呈上升趨勢，這與陳新等[28]的研究結論相一致，推測這與不同品種間耐鹽性及鹽逆境響應差異有關。重度鹽脅迫下，高羊茅‘俠客島’的發芽率、發芽勢等指標均為0，說明此時重度鹽分脅迫已使‘俠客島’停止萌發。相比之下，醉馬草在NaCl鹽分脅迫下的發芽率和發芽勢等指標都較為穩定，且試驗結果表明，輕度鹽脅迫對醉馬草種子的萌發具有一定的促進作用，推測是低濃度鹽分促進了細胞的滲透調節，并刺激了抗氧活酶的活力[8,29]，從而對萌發產生了積極影響，此外，中重度鹽分脅迫下的帶菌醉馬草，其發芽率等指標均高于不帶菌醉馬草。總體而言，帶菌醉馬草受鹽分脅迫的影響較小，推測是由于帶菌醉馬草帶有內生真菌Epichlo? gansuensis，增強了宿主對逆境的抗性，使其免受鹽分脅迫的危害。Bharadwaj等[30]證明，內生真菌的存在促使在鹽分逆境中的植物提高葉綠素、脯氨酸等調節滲透物質的含量，降低丙二醛的含量，從而增強植物在鹽分逆境中的生存能力。本研究顯示了帶菌醉馬草在鹽脅迫下的穩定發芽率和發芽勢，且得出的結論與段春華等[18]的研究結果相一致。

種子發芽指數和活力指數是種子綜合活力的體現，是衡量種子品質的重要標準。種子活力與生命力是逆境生存的保障。4份種質的發芽指數和活力指數與發芽率和發芽勢的結論類似，再次證明了帶菌醉馬草的旺盛活力和對NaCl鹽分脅迫的優良耐受性。對于種子來說，重度鹽脅迫使其種子周圍水勢降低，使得種子內外水勢差異增大，致使種子失水，細胞內大量溶質流失，并造成質壁分離等情況。而醉馬草中的內生真菌可以通過增加脯氨酸或者可溶性糖等滲透物質，增加細胞內抗氧化酶的含量等一系列生理活動[31]，從而有效減輕NaCl鹽分脅迫造成的滲透效應和離子失衡對于植物的傷害。

3.2 鹽脅迫對醉馬草和高羊茅種子幼苗生長的影響

胚根能否順利突破種皮并扎根是幼苗生長的關鍵，處于該幼苗階段的植物對鹽分脅迫通常很敏感且更易受到傷害[32]。因此，利用種子萌發和幼苗生長的試驗，可初步預見醉馬草和高羊茅兩種質在不同鹽脅迫環境中發芽、建植和生長的情況，進而揭示植物在鹽分逆境中的適應和改變規律。

本研究結果表明，重度鹽脅迫對醉馬草和高羊茅幼苗高度的影響大于根長。這可能是由于重度鹽脅迫使幼苗細胞嚴重失水、質壁分離，進而對胞內抗氧化酶及激素的合成造成影響，致使幼苗生長受抑程度大于根長[33]。梁正偉等[34]對羊草(Leymus chinensis)、趙斌等[35]對洋金鳳(Caesalpinia pulcherrima)等3種熱帶植物和Li等[36]對552份向日葵(Helianthus annuus)種質在鹽脅迫下的種子萌發和幼苗生長的研究結論亦與本研究一致，推測是因植物根系是最早接觸鹽溶液的器官，對鹽分脅迫的響應最早，為適應逆境而進行相應的生理反應所致。

3.3 耐鹽性評價

本研究結果表明，鹽分脅迫下的帶菌醉馬草種子發芽率、發芽勢及發芽指數、活力指數等指標最優，種子活力最為旺盛，高羊茅‘俠客島’最差。本研究通過建立最優函數方程預測出帶菌醉馬草的耐鹽適宜濃度、耐鹽半致死濃度、耐鹽極限濃度分別為0.70%、0.98%和1.02%；不帶菌醉馬草的3種濃度分別為0.60%、0.72%和0.91%；高羊茅‘俠客島’的3種濃度分別為0.37%、0.46%和0.62%；高羊茅‘獵狗6號’的3種濃度分別為0.49%、0.61%和0.87%；帶菌醉馬草、不帶菌醉馬草、高羊茅‘俠客島’、高羊茅‘獵狗6號’幼苗生長階段的耐鹽閾值依次為1.23%、1.01%、0.44%和1.09%。由此可知，帶菌醉馬草的耐鹽適宜濃度、耐鹽半致死濃度、耐鹽極限濃度、耐鹽閾值均高于其余3個種質，明確了帶菌醉馬草種子萌發和幼苗生長階段的NaCl耐受性依次為A1>A4>A2>A3。綜上所述，帶菌醉馬草對于NaCl單鹽脅迫具有相當的耐受性，作為西北鹽堿地區的新型草坪草種具有優良發展潛力，可提高西北地區土壤資源利用率并緩解鹽漬化帶來的危害。

4 結論

本研究以醉馬草和高羊茅種子作為研究對象，分析了不同單鹽脅迫下對種子萌發和幼苗生長的影響，并對其綜合耐鹽性進行評估。結果表明：1)鹽脅迫對4份種質的萌發及幼苗生長均有抑制作用。2)經評估，4份種質的綜合耐鹽性依次帶菌醉馬草>高羊茅‘獵狗6號’>不帶菌醉馬草>高羊茅‘俠客島’。帶菌醉馬草耐鹽性最佳，具有成為西北地區優良草坪草種的巨大潛力。