SrtA蛋白在大腸桿菌中的高效表達與活性鑒定

張秀娟，于海威，劉棟琦，趙晉彤，熊向華

（1.哈爾濱商業(yè)大學藥學院，黑龍江哈爾濱 150076；2.軍事科學院軍事醫(yī)學研究院生物工程研究所，北京 100071）

Sortase酶是一組存在于革蘭氏陽性細菌中介導表面蛋白與細胞壁共價結(jié)合的蛋白酶，負責細胞表面蛋白的修飾和細菌鞭毛的構(gòu)建，在幫助病原細菌逃避宿主免疫系統(tǒng)方面起重要作用[1]。Sortase酶根據(jù)識別表面蛋白序列的不同可以分為A、B、C、D等多種，其中以在金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）中發(fā)現(xiàn)的轉(zhuǎn)肽酶A（Sortase A，SrtA）研究得最為廣泛，其結(jié)構(gòu)、功能及催化機制均已闡明[2-3]。Sortase A酶具有一個典型的類似Ⅱ型膜蛋白的N端跨膜區(qū)域和一個尾部富集正電荷的C端結(jié)構(gòu)域，可以特異性識別底物蛋白上的分選序列LPXTG（X為除半胱氨酸以外的任一氨基酸）[4-5]，在蘇氨酸（Thr）和甘氨酸（Gly）之間進行剪切[6-7]，并將其與含有多甘氨酸接頭（GlyGlyGly-，G-）的底物蛋白進行連接[8-9]。SrtA酶催化的連接反應具有反應條件溫和、效率高、特異性強等優(yōu)點[10-11]，近年來已應用于蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)、肽、核酸類似物[12-13]、糖等活性物質(zhì)連接以及蛋白質(zhì)固定化[14-15]，展示出良好的應用前景。但是野生型SrtA酶催化的連接反應耗時長、產(chǎn)率低，不同研究者開展了包括提高催化活性、改變底物識別特征等一系列改造，Chen等報道P94S、D160N、D165A和K196T這4個位點的突變可將SrtA酶催化活性提高140多倍，推測突變型SrtA酶更利于底物進入結(jié)合區(qū)域，從而大大提升連接效率[16-17]。

密碼子（codon）是中心法則的重要組成部分，同時也是生物遺傳和變異的最基本單元，對某物種基因組來說, 一些同義密碼子會頻繁出現(xiàn)，稱為優(yōu)化密碼子；還有一些密碼子則很少出現(xiàn)甚至不出現(xiàn)，稱為非優(yōu)化密碼子或稀有密碼子，這一現(xiàn)象稱為密碼子偏好性（codon usage bias）[18-19]。不同物種之間對密碼子使用存在各自的偏好，各同義密碼子之間雖然不會改變氨基酸的序列，但對于蛋白的表達水平具有一定程度的影響[20-21]。基因合成是一項較為成熟的技術(shù)[22-23]，常與密碼子優(yōu)化配合使用[24-25]，本文選擇了高活性突變型的srtA酶基因，為解決SrtA酶在大腸桿菌表達系統(tǒng)中表達水平低、包涵體比例高的缺點，按照大腸桿菌偏好性進行了密碼子優(yōu)化后合成了srtA基因并連入硫氧還蛋白（Thioredoxin，Trx）共表達載體pTIG，導入大腸桿菌BL21(DE3)后通過低溫誘導實現(xiàn)了SrtA酶的可溶性高表達，純化的SrtA酶成功實現(xiàn)了A型肉毒毒素（Botulinum toxins A，BoNT/A）活性缺失突變體LHN-LPETG結(jié)構(gòu)域和GHC結(jié)構(gòu)域的連接。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

DH5α大腸桿菌感受態(tài)、BL21（DE3）大腸桿菌感受態(tài) 北京擎科生物技術(shù)有限公司；質(zhì)粒提取試劑盒 北京達科為生物科技有限公司；DNA凝膠回收試劑盒、限制性內(nèi)切酶 賽默飛世爾科技（中國）有限公司；BCA法蛋白濃度測定試劑盒 康為世紀生物科技有限公司；瓊脂糖 索萊寶科技有限公司；T4 DNA連接酶 NEB有限公司；IPTG 北京經(jīng)科宏達生物技術(shù)有限公司；pTIG-GHC、pTIG-LHNLPETG、PUC57-srtA質(zhì)粒（克隆載體） 軍事醫(yī)學科學院軍事醫(yī)學研究院生物工程研究所。

Ni2+親和層析柱、強陰離子親和層析柱、強陽離子親和層析柱 GE公司；3K-18型低溫冷凍離心機 Sigma；T-1型PCR儀 Biometra；DYⅢ 3A型凝膠電泳儀 北京六一儀器廠；Gel-pro 2020D凝膠成 像 儀 pHarmacia Biotech；MiniPROTEAN?3 Cell蛋白電泳儀 Bio-RAD；AKTA UPC-900蛋白質(zhì)純化儀 GE；PAC200半干轉(zhuǎn)膜儀 Bio-Rad等。

1.2 實驗方法

1.2.1srtA基因密碼子優(yōu)化 將高活性突變型srtA基因序列按大腸桿菌偏好性進行密碼子優(yōu)化，交由北京擎科生物技術(shù)有限公司進行合成。

1.2.2 引物設(shè)計 利用edit seq軟件設(shè)計引物，引物序列如表1。

表1 引物設(shè)計Table 1 Primer design

1.2.3 pTIG-srtA質(zhì)粒構(gòu)建 根據(jù)優(yōu)化后的srtA基因序列設(shè)計正、反向引物，降落PCR擴增目的基因片段后進行瓊脂糖凝膠電泳，切膠分離目的片段后回收。將目的片段與pTIG表達載體經(jīng)EcoRI+XhoI雙酶切后再次電泳驗證并回收，二者于16℃連接過夜后轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)，將菌液涂布于LB（Amp）固體培養(yǎng)基，倒置在37 ℃培養(yǎng)過夜，次日挑單菌落進行菌落PCR鑒定，陽性對照的PCR模板為PUC57-srtA，陰性對照的PCR模板為pTIG空載體。鑒定篩選后將陽性克隆送至公司測序。

1.2.4 SrtA蛋白表達鑒定 將表達載體pTIG-srtA轉(zhuǎn)入BL21（DE3）感受態(tài)，然后挑取轉(zhuǎn)化子培養(yǎng)至對數(shù)生長期，加入終濃度0.5 mmol的IPTG置于16 ℃誘導過夜。次日取1 mL菌液離心后重懸于500 μL TE裂解液，經(jīng)過超聲破碎后，取出20 μL備用（全菌），其余裂解液離心，吸取20 μL上清待用，去掉上清后沉淀部分用480 μL裂解液重懸，取20 μL備用（沉淀）。將全菌、上清、沉淀進行SDS-PAGE鑒定，并利用Gelpro Analyzer軟件分析蛋白表達量。

1.2.5 SrtA蛋白純化 取pTIG-srtA/BL21（DE3）單菌落至搖瓶培養(yǎng)，按1.2.4低溫誘導表達，超聲裂解后利用AKTA純化儀梯度洗脫純化蛋白。經(jīng)前期純化條件摸索，srtA蛋白需經(jīng)過兩步純化，第一步使用強陽離子柱進行純化，收集洗脫液后液通過3 kDa截留分子量的超濾管進行超濾換液脫鹽，將溶液置換為Ni2+柱平衡液。第二步通過Ni2+親和層析柱進行二次純化，純化后采用3 kDa截留分子量的超濾管進行超濾換液脫鹽濃縮，利用SDS-PAGE及Gelpro Analyzer軟件分析純化蛋白純度，同時使用抗His標簽抗體為一抗進行Western Blot鑒定。純化體系平衡液、洗脫液見表2。

表2 純化平衡液、洗脫液Table 2 loading buffer and elution buffer

1.2.6 SrtA蛋白活性鑒定 分別將pTIG-G-HC、pTIG-LHN-LPETG質(zhì)粒轉(zhuǎn)入BL21（DE3）感受態(tài)細胞，按照1.2.4及1.2.5進行表達鑒定及純化，G-HC純化步驟同SrtA純化。LHN-LPETG蛋白需經(jīng)過兩步純化，第一步進行Ni2+親和層析柱純化，利用30 kDa截留分子量的超濾管對收集的洗脫液進行超濾換液，將溶液置換為強陰離子柱平衡液，第二步利用強陰離子柱進行純化，純化后兩種蛋白利用抗His標簽抗體進行WesternBlot鑒定。

將純化后的SrtA、G-HC、LHN-LPETG蛋白按照摩爾比1:1:1混合后分裝于EP管中，每支20 μL，分別置于37和30 ℃孵育0.5、1、2、4 h進行蛋白連接。孵育完成后進行SDS-PAGE鑒定及Western Blot鑒定，Western Blot所用一抗為特異性針對GHC的抗體，二抗為山羊抗人IgG抗體。

1.2.7 分子篩純化BoNT/A失活突變體 利用SuperdexG200分子篩（平衡液為20 mmol/L PBS、150 mmol/L NaCl）純化連接體系中的BoNT/A失活突變體，少量多次收取穿過液，待完全收集穿過液后進行SDS-PAGE鑒定。

1.3 數(shù)據(jù)處理

利用DNAMAN軟件比對分析陽性克隆序列是否正確；使用Gelpro Analyzer軟件分析純化蛋白純度。

2 結(jié)果與分析

2.1 pTIG-srtA質(zhì)粒構(gòu)建

高活性突變型srtA基因序列按大腸桿菌表達系統(tǒng)密碼子偏好性進行優(yōu)化，并送公司進行全基因合成。PCR擴增后經(jīng)EcoRI+XhoI雙酶切連入pTIG質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)，菌液PCR篩選陽性克隆，結(jié)果如圖1所示，PCR擴增片段大小與srtA基因大小相符。陽性克隆測定序列經(jīng)DNAMAN軟件比對，結(jié)果顯示與預期序列一致，表明成功構(gòu)建pTIG-srtA基因表達載體。

2.2 SrtA蛋白表達

圖1 pTIG-SrtA/DH5α菌落PCR鑒定Fig.1 Colony PCR identification of recombinant plasmid pTIG-SrtA

將表達載體pTIG-srtA基因轉(zhuǎn)化至BL21（DE3）感受態(tài)，挑單菌落至LB（Amp）液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對數(shù)期，加入IPTG，誘導表達過夜，收集菌體經(jīng)超聲裂解后進行SDS-PAGE分析。結(jié)果如圖2所示，與陰性對照相比，1～5泳道都有特異性蛋白表達條帶，分子量為20 kDa左右，與SrtA蛋白大小相符；而且目的蛋白大部分在菌體裂解上清部分，說明SrtA蛋白主要為可溶性表達。Gelpro Analyzer軟件分析SrtA蛋白表達量占全菌蛋白55%。

圖2 SrtA蛋白表達的SDS-PAGE鑒定Fig.2 SDS-PAGE identification ofSrtA protein expression

2.3 SrtA蛋白純化

挑取新鮮pTIG-srtA/BL21（DE3）單菌落至LB（Amp）液體培養(yǎng)基培養(yǎng)活化，轉(zhuǎn)接至LB（Amp）液體培養(yǎng)基培養(yǎng)至對數(shù)生長期，加入IPTG置于16 ℃誘導過夜。離心收集菌體并超聲裂解，第一步使用強陽離子柱進行純化，收集洗脫液后液通過 3 kDa截留分子量的超濾管進行超濾換液，將溶液置換為Ni2+柱平衡液。第二步通過Ni2+親和層析柱進行二次純化，收集洗脫液20%～40%部分的洗脫峰（圖3）進行SDS-PAGE鑒定，各泳道為分段接取的洗脫液，于20 kDa附近可見清晰條帶。采用3 kDa截留分子量的超濾管進行超濾換液脫鹽，經(jīng)SDS-PAGE分析純化蛋白純度，Gelpro Analyzer軟件分析純化的結(jié)果表明SrtA蛋白純度＞95%（圖4）。Western Blot分析表明純化的SrtA蛋白能特異性地與抗His標簽抗體結(jié)合（圖5）。

圖3 Ni2+親和層析純化SrtA蛋白SDS-PAGE鑒定（20%～40%部分洗脫液）Fig.3 SDS-PAGE identification of SrtA protein purified by Ni2+ affinity chromatography column（20%～40% elution buffer）注：M：蛋白分子質(zhì)量相對標志物；其余泳道為分段接取的純化洗脫液。

2.4 SrtA蛋白活性鑒定

將表達載體pTIG-G-HC、pTIG-LHN-LPETG分別轉(zhuǎn)化至BL21（DE3）感受態(tài)中進行表達，利用SDSPAGE鑒定蛋白表達方式，Gelpro Analyzer軟件分析蛋白表達量。如圖6（a）所示，各泳道為分段接取的洗脫液，在50 kDa 附近有清晰條帶，分子量大小與G-HC蛋白相符，表達量占全菌蛋白40%，且主要為可溶性表達。如圖6（b）所示，各泳道為分段接取的洗脫液，在100 kDa附近有特異表達條帶，分子量大小與LHN-LPETG蛋白相符，表達量占全菌蛋白25%，且主要為可溶性表達。

圖4 SrtA蛋白超濾換液后SDS-PAGE鑒定Fig.4 SDS-PAGE identification of SrtA protein after ultrafiltrate

圖5 Western Blot鑒定G-HC、LHN-LPETG、SrtA蛋白Fig.5 Western Blot identification protein of G-HC,LHN-LPETG, SrtA

SDS-PAGE鑒定結(jié)果表明，G-HC及LHN-LPETG表達蛋白經(jīng)純化后得到較高純度目的蛋白（圖7）；Western Blot分析表明純化的G-HC及LHN-LPETG蛋白蛋白能特異性地與抗His標簽抗體結(jié)合（圖5）。

圖6 G-HC、LHN-LPETG表達形式SDS-PAGE鑒定Fig.6 SDS-PAGE identification of G-HC、LHN-LPETG expression

圖7 Ni2+親和層析柱純化后的G-HC、LHN-LPETG蛋白SDS-PAGE鑒定Fig.7 SDS-PAGE identification ofprotein purified by Ni2+ affinity chromatography column

圖8 SDS-PAGE鑒定不同孵育時間下連接生成的BoNT/A失活突變體Fig.8 SDS-PAGE identification of inactivated BoNT/A generated by connection at different incubation times

將純化后的SrtA、G-HC、LHN-LPETG蛋白按照摩爾比1:1:1混合后分裝于EP管中，于37和30 ℃連接0.5、1、2、4 h，結(jié)果如圖8所示。隨著連接時間的增加，在150 kDa附近逐漸出現(xiàn)條帶，大小與BoNT/A失活突變體全長蛋白相符。如圖9所示，Western Blot鑒定結(jié)果表明，連接蛋白可以與抗GHc抗體結(jié)合，進一步表明150 kDa處連接蛋白為BoNT/A失活突變體全長蛋白。

圖9 Western Blot鑒定連接生成的BoNT/A失活突變體Fig.9 Western Blot identification of mutant of BoNT/A generated by connection

連接體系經(jīng)分子篩純化后收集目的蛋白洗脫峰，SDS-PAGE電泳結(jié)果顯示在150 kDa附近有可見條帶，表明純化得到全長BoNT/A活性突變體蛋白（圖10）。

圖10 SDS-PAGE鑒定SuperdexG200分子篩純化的BoNT/A失活突變體Fig.10 SDS-PAGE identification of purified mutant of BoNT/A by Superdex G200 molecular sieve

3 結(jié)論

大腸桿菌表達系統(tǒng)是一種應用廣泛的蛋白制備技術(shù)，其具有操作難度低、成本低廉、 制備周期短等優(yōu)點[26-27]，實驗室前期嘗試在大腸桿菌原核表達系統(tǒng)中表達未經(jīng)密碼子優(yōu)化的srtA基因，但與文獻報道結(jié)果一致，原始SrtA蛋白表達水平低而且主要為包涵體[11]，后續(xù)純化難度較大且需要復性[28],其原因可能是在原核細胞表達系統(tǒng)中，由于蛋白合成速度過快，導致目的蛋白存在來不及正確折疊及組裝的情況，會形成無生物活性的蛋白聚集物即包涵體[29-30]。本研究將srtA基因按大腸桿菌表達系統(tǒng)偏好性進行密碼子優(yōu)化，并克隆入pTIG表達載體與硫氧還蛋白（Trx）進行共表達，結(jié)果表明在大腸桿菌BL21（DE3）中經(jīng)16℃低溫誘導過夜實現(xiàn)了SrtA蛋白的可溶性高表達，表達量占全菌蛋白的50%以上。進一步親和層析純化得到了純度＞95%的SrtA蛋白。純化的SrtA蛋白能夠完成帶有特征識別序列的BoNT/A失活突變體的兩部分片段LHN-LPETG和G-HC的酶法連接，得到全長的BoNT/A失活突變體蛋白，這充分說明在大腸桿菌中表達純化的SrtA蛋白具有轉(zhuǎn)肽酶活性。