小球藻紫果西番蓮多糖復合飲料研制及其對小鼠運動耐力的影響

李 奕

（中國戲曲學院體育部，北京 100073）

小球藻屬于綠藻門小球藻科的單細胞綠藻，含有多糖、蛋白質、維生素、食用纖維及多種礦物元素。有研究顯示[1-2]，其主要成分多糖的體外抗氧化作用較好，可增強機體免疫力，Okada等[3]指出該多糖緩解機體疲勞的活性較乳糖有顯著性差異，因此被大量用于保健食品的研究開發。由于藻類食品通常存在特殊腥味，受歡迎程度較低，龐庭才等將其制備成相關發酵乳及復合飲料，以改善口感[4-5]；而史瑞琴等[6]則利用小球藻多糖制備相應口服液，使得口感提升。紫果西番蓮是西番蓮科多年木質藤本植物的果實，氣味芬香濃郁，被贊譽為“果汁之王”，富含多糖、有機酸、維生素、氨基酸等營養物質[7-8]，賀銀菊等[9]通過超聲輔助提取其果肉多糖，發現其對活性氧自由基的清除作用較好。

由于運動性疲勞通常源于機體運動產生的大量活性氧自由基，促使體內氧化應激反應發生，造成組織損傷和肌肉收縮能力下降、出現“身心俱疲”現象[10-11]。而一般天然化合物的體內外活性高度相關[12]，且目前尚未有文獻公開探討小球藻與紫果西番蓮相關食品的體內抗疲勞活性，因此本研究以上述兩種物質的多糖為原料，利用紫果西番蓮抑制小球藻異味，研制小球藻紫果西番蓮多糖復合飲料，通過相關動物實驗，觀察其對機體運動耐力的影響，從而為相關運動食品的開發提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

健康雄性小鼠 150只，體質量19～25 g，由北京實驗動物中心提供（SYXK（京） 2015-0046），生長環境溫度20～25 ℃，相對濕度50%～70%；小球藻粉

西安瑞爾麗生物工程有限公司；紫果西番蓮、蔗糖

北京明光寺水果批發市場；西洋參口服液 山東鶴王生物工程有限公司；葡萄糖標準品 中國食品藥品檢定研究院；苯酚、硫酸均為分析純 國藥集團化學試劑有限公司；檸檬酸 濟南鑫越化工有限公司；羧甲基纖維素鈉 河北百優生物科技有限公司；試驗用水為蒸餾水。

YP-1000型電子天平 上海越平儀器有限公司；TL-150Y型超聲波細胞粉碎機 江蘇天翎儀器有限公司；PHS-3C型雷磁pH計 上海儀電科學儀器股份有限公司；X5型紫外可見分光光度計 上海元析儀器有限公司；FB-110Q型高壓均質機 上海勵途超高壓設備有限公司；BKQ-B75II型立式壓力蒸汽滅菌器 愛來寶（濟南）醫療科技有限公司；ZX-2200DE型超聲波器 上海知信實驗儀器技術有限公司；FD-1A-80型真空冷凍干燥機 上海蘭儀實業有限公司；H1850R型臺式離心機 湖南湘儀檢測設備有限公司；動物恒溫游泳池 上海艾研生物科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 工藝流程

1.2.2 操作要點

1.2.2.1 小球藻多糖提取 以蒸餾水為提取溶劑，小球藻粉以1:20質量體積比，于100 W超聲破碎，97 ℃熱水浸提3 h后，在8000 r/min下離心10 min，取上清液，加入4%三氯乙酸，4 ℃靜置過夜離心（8000 r/min、10 min），取上清液加入95%乙醇，4 ℃靜置過夜離心（8000 r/min、10 min）取沉淀，冷凍干燥即得小球藻粗多糖[6]。

1.2.2.2 紫果西番蓮多糖提取 以蒸餾水作提取溶劑，紫果西番蓮果肉以1:5質量體積比，于330 W超聲破碎，70 ℃熱水浸提30 min后離心（5000 r/min、10 min），濾液冷凍干燥即得紫果西番蓮粗多糖[8]。

1.2.2.3 調配 50%小球藻多糖水溶液和50%紫果西番蓮多糖水溶液以固定比例混合后，加入一定劑量食品添加劑（相對多糖混合液的百分比）調配。

1.2.2.4 均質、灌裝與滅菌 調配后的料液均質攪拌2次后灌裝（溫度：60～70 ℃，壓力：20～25 MPa），于121 ℃滅菌10 min，冷卻，即得小球藻紫果西番蓮多糖復合飲料[13]。

1.2.3 復合飲料配方優化

1.2.3.1 單因素實驗設計 根據預實驗結果，分別考察小球藻與紫果西番蓮的多糖溶液體積比、蔗糖用量、檸檬酸用量及羧甲基纖維素鈉用量對小球藻紫果西番蓮多糖復合飲料的感官評分和離心沉降率的影響，具體如下：（1）固定蔗糖用量3%、檸檬酸用量0.2%、羧甲基纖維素鈉用量0.3%，考察小球藻與紫果西番蓮的多糖溶液體積比（3:1、2:1、1:1、1:2、1:3）的影響；（2）固定小球藻與紫果西番蓮的多糖溶液體積比1:2、檸檬酸用量0.2%、羧甲基纖維素鈉用量0.3%，考察蔗糖用量（1%、3%、5%、7%、9%）影響；（3）固定小球藻與紫果西番蓮的多糖溶液體積比1:2、蔗糖用量3%、羧甲基纖維素鈉用量0.3%，考察檸檬酸用量（0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%）的影響；（4）固定小球藻與紫果西番蓮的多糖溶液體積比1:2、蔗糖用量3%、檸檬酸用量0.2%，考察羧甲基纖維素鈉（0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%）用量的影響。

1.2.3.2 響應面試驗設計 在單因素實驗基礎上，以兩種物質多糖溶液體積比（A）、蔗糖（B）、檸檬酸（C）和羧甲基纖維素鈉（D）的用量為響應因素，感官得分為響應值（Y），設計四因素三水平響應面試驗，利用Design-Expert軟件的Box-Behnken試驗設計原理，優化各組分配比，試驗因素水平見表1所示。

表1 響應面試驗因素水平Table 1 Factors and levels in response surface design

1.2.4 飲料感官品質評價

1.2.4.1 感官評價標準 參考相關飲料評價標準[14-15]，并結合小球藻紫果西番蓮多糖復合飲料特性，制定該復合飲料的感官評價標準，具體見表2所示，同時邀請10位食品專業人員，分別按照該標準，對不同組分配比制得的飲料進行感官評價，最終評分取結果的平均值。

表2 飲料感官評價標準Table 2 Sensory evaluation criteria of the beverage

1.2.4.2 離心沉淀率 稱取復合飲料m0，置于離心管中，以3000 r/min，離心10 min后，對管內上清液稱重記為m，照公式W（%）=（m0- m）/m0計算飲料的離心沉淀率W（%），平行測定六次[16]。

1.2.5 理化指標檢測

1.2.5.1 pH值測定 利用pH計檢測復合飲料的pH值。

1.2.5.2 多糖含量測定 葡萄糖對照品經120 ℃干燥恒重后，按照文獻操作步驟[17]，分別加入苯酚與濃硫酸預處理樣品后，于490 nm波長測定吸光度值，另作空白對照，隨后以對照品溶液的質量濃度為橫坐標，吸光度值為縱坐標，繪制標準曲線，得到標準曲線回歸方程：y=1.026x+0.052 （r=0.9989），另于相同波長下測定該復合飲料的吸光度值，根據標準曲線回歸方程，計算其多糖含量。

1.2.6 微生物指標檢測 按照國家標準操作步驟[18]，分別檢測小球藻紫果西番蓮多糖復合飲料的微生物菌落總數、大腸桿菌和致病菌。

1.2.7 動物實驗

1.2.7.1 分組與給藥設計 150只健康雄性小鼠適應性喂養7 d后，按體質量隨機分為五組，即空白對照組，陽性對照組，復合飲料低、中、高劑量組，每組各30只，陽性對照組給予西洋參口服液灌胃0.20 mL/（g·d），低、中、高劑量組則分別灌胃復合飲料0.10、0.20、0.30 mL/（g·d），而空白對照組則以0.85%生理鹽水替代飲料灌胃，全部動物每天灌胃1次，連續灌胃30 d，灌胃期間可自由喂食與飲水[19]。

1.2.7.2 負重游泳試驗 末次灌胃后，各組動物于鼠尾負重5%體重重物，置于25 ℃游泳池內開展負重游泳試驗，記錄小鼠自入水開始游泳至沉沒超過10 s的時間，即為動物力竭游泳時間[20]。

1.2.7.3 體內生化指標檢測 負重游泳試驗結束后，快速切除動物肝臟，制成10%肝臟勻漿，按照相關試劑盒說明書要求，檢測各組小鼠體內的丙二醛（MDA）濃度及總超氧化物歧化酶（T-SOD）和谷胱甘肽過氧化物歧化酶（GSH-Px）活力[21]。

1.3 數據處理

相關評價指標均采用均數、標準差描述，利用SPSS 19.0進行方差分析，檢驗水準α=0.05，當P＜0.05表示具有顯著性差異，P＜0.01表示具有極顯著性差異。

2 結果與分析

2.1 單因素實驗結果

2.1.1 小球藻與紫果西番蓮的多糖溶液體積比對飲料品質影響 不同小球藻與紫果西番蓮的多糖溶液體積比對飲料的品質影響，結果見圖1。當小球藻與紫果西番蓮的多糖溶液體積比為1:2時，復合飲料的感官得分最高，此時溶液為淺黃綠色、透亮，且酸甜適中。若紫果西番蓮多糖用量過多，溶液澄清度下降，離心沉淀率超過1%，而小球藻多糖用量過多，則飲料又異味明顯，為便于響應面試驗條件考察，因此確定小球藻與紫果西番蓮的多糖溶液體積比1.5:1、1:1、1:2作為響應面因素考察水平。

圖1 溶液體積比對飲料感官評價的影響Fig.1 Effect of volume ratios on the sensory evaluation of beverage

2.1.2 蔗糖用量對飲料品質的影響 不同蔗糖用量對飲料的品質影響，結果見圖2。從圖2可見，隨著蔗糖用量增多，飲料的感官評分先增大后減小，離心沉淀率基本不變，這可能歸因于蔗糖用量較少，溶液澀味較重，但過多又甜味突出，因此選擇蔗糖用量1%、3%、5%作為響應面因素考察水平。

圖2 蔗糖用量對飲料感官評價的影響Fig.2 Effect of sucrose amount on the sensory evaluation of beverage

2.1.3 檸檬酸用量對飲料品質的影響 檸檬酸的添加不僅豐富飲料的口感，同時可調節溶液的酸堿性質，使得飲料品質長期穩定，因此考察不同檸檬酸用量對飲料的品質影響，結果見圖3。從圖3可知，當檸檬酸用量達到0.2%再增加時，飲料的感官評分開始下降，且離心沉淀率不斷升高，這可能源于檸檬酸用量過多，會導致飲料的酸味明顯，口感變差，而兩種多糖在弱酸性條件溶解性較好，因此選擇檸檬酸的用量0.1%、0.2%、0.3%作為響應面因素考察水平。

圖3 檸檬酸用量對飲料感官評價的影響Fig.3 Effect of citric acid amount on the sensory evaluation of beverage

2.1.4 羧甲基纖維素鈉對飲料品質的影響 由于小球藻和紫果西番蓮的多糖提取物中仍含有蛋白質、氨基酸等高分子雜質，致使飲料長期存放時，容易出現分層，因此采用羧甲基纖維素鈉改善飲料的長期穩定性，考察不同羧甲基纖維素鈉用量對飲料的品質影響，結果見圖4。從圖4可知，隨著羧甲基纖維素鈉用量遞增，感官評分逐漸升高，至0.3%后才下降。這歸因于羧甲基纖維素鈉的添加，有助于溶液的離心沉淀率下降，但用量過多會造成溶液黏稠，進而影響口感，因此選擇羧甲基纖維素鈉用量0.2%、0.3%、0.4%作為響應面因素考察水平。

2.2 響應面優化試驗

圖4 羧甲基纖維素鈉用量對飲料感官品質的影響Fig.4 Effect of sodium carboxymethylcellulose amount on the sensory evaluation of beverage

2.2.1 試驗結果 按照Box-Behnken設計原理，分別以小球藻與紫果西番蓮的多糖溶液體積比（A）、蔗糖（B）、檸檬酸（C）及羧甲基纖維素鈉（D）用量為響應面考察因素，感官評分為（Y）為響應值，進行四因素三水平響應面分析，結果見表3所示。

表3 響應面試驗結果Table 3 Results of the response surface experiment

上述試驗結果進行多元回歸擬合，得到以感官得分為目標函數，各參數編碼值的二次多項回歸模型：Y=84.97+2.64A+0.78B+1.20C+0.23D+0.14AB-0.56AC+0.45AD-0.082BC-0.22BD-0.22CD-0.40A2-0.73B2-0.79C2-0.16D2，對該模型進行顯著檢驗與方差分析，結果見表4所示。

表4 響應面方差分析Table 4 The variance analysis of response surface experiment

從表4可知，該回歸模型P＜0.01，表明該模型回歸效果顯著，較好反映實際結果，R2=0.9222顯示模型擬合值與實際結果高度相關，而失擬項P=0.7752表明該模型方程不顯著（P＞0.05）可準確反映各因素與響應值關系，一次項A、B、C對飲料的感官得分影響均極顯著（P＜0.01），二次項B2、C2對感官得分影響也均顯著（P＜0.05），但交互項AB、AC、BC、CD、AD、BD的影響均不顯著（P＞0.05），另從表中F值得到，各因素對飲料的感官得分影響順序為：小球藻與紫果西番蓮的多糖溶液體積比（A）＞檸檬酸用量（C）＞蔗糖用量（B）＞羧甲基纖維素鈉用量（D）。

2.2.2 響應曲面分析與驗證實驗 圖5為不同考察因素的交互作用對飲料的感官得分影響，響應曲面越陡峭，感官得分(Y)受不同因素的交互作用影響越大[22-23]，從圖5可知，兩兩因素交互響應面坡面陡峭順序為：AC＞AD＞CD＞BD＞AB＞BC，即兩種物質多糖溶液體積比和檸檬酸用量的交互作用響應面最陡峭，表明二者交互作用對飲料的感官品質影響最大，另對二次多項回歸擬合方程進行極值分析，確定小球藻紫果西番蓮多糖復合飲料的最佳配方為：小球藻與紫果西番蓮的多糖溶液體積比1:2、蔗糖2.35%、檸檬酸0.14%、羧甲基纖維素鈉0.4%，最高預測值為87.94分，按照1.2.4.1步驟評價，實際得分為（88.71±0.87）分，表明該回歸模型可較好預測復合飲料的最佳配方。

2.3 復合飲料的質量指標結果

采用上述最佳配方制得的復合飲料呈淺黃綠色、色澤均一，紫果西番蓮香味濃郁，酸甜適中，室溫靜置6個月未有明顯沉淀與分層。該復合飲料的pH值為5.7；離心沉淀率為0.59%；多糖含量為5.62%；微生物菌落總數≤100 CFU/100 mL，未有大腸桿菌和其它致病菌檢出。

2.4 復合飲料對小鼠力竭游泳時間的影響

負重游泳試驗常被用于考察動物力竭游泳時間，以客觀反映動物的運動耐力，利用該試驗分別考察各組小鼠的運動耐力，結果見表5所示。從表5可見，與空白對照組相較，中劑量組小鼠的力竭游泳時間顯著延長（P＜0.05），高劑量組小鼠的力竭游泳時間極顯著延長 （P＜0.01），而低劑量組力竭游泳時間雖有一定延長，但無顯著性差異（P＞0.05），另外高劑量組與陽性對照組的力竭游泳時間差異，具有統計學意義 （P＜0.05），表明一定劑量的復合飲料有助于提高動物的運動耐力，但相同劑量的作用效果弱于西洋參。

2.5 復合飲料對小鼠生化指標的影響

劇烈運動導致機體耗氧量增加，出現大量活性氧與自由基，進而發生氧化應激反應，生成丙二醛（MDA），損傷細胞膜、蛋白質和DNA[24]。總超氧化物歧化酶（T-SOD）和谷胱甘肽過氧化物歧化酶（GSH-Px）是體內重要的抗氧化酶，其中T-SOD可有效清除超氧陰離子自由基，使其轉化為過氧化氫，隨后被GSH-Px還原成H2O和醇代謝[25]，使得體內過氧化作用被減輕，不同組別小鼠運動后的體內MDA含量和T-SOD、GSH-Px活力，見表6所示。

從表6可知，與空白對照組相較，中、高劑量復合飲料有助于明顯增強動物體內T-SOD、和GSHPx活力(P＜0.01)，其中T-SOD活力增強率為9.33%、13.95%，GSH-Px活力增強率為10.07%、16.69%，并極顯著降低體內生成的MDA含量（P＜0.01），下降率分別為18.18%、41.18%，而低劑量組的T-SOD、GSH-Px活力雖有一定增加，且MDA含量輕微下降，但差異無統計學意義（P＞0.05），另外高劑量組的T-SOD、GSH-Px與MDA含量與陽性對照組相較，具有顯著性差異（P＜0.05）。上述試驗結果表明，小球藻紫果西番蓮多糖復合飲料既能減少自由基引起的脂質過氧化反應，又可提高體內抗氧化酶活性，從而增強機體運動耐力。

3 結論

本研究以小球藻和紫果西番蓮多糖為原料，輔以蔗糖、羧甲基纖維素鈉研制小球藻紫果西番蓮多糖復合飲料。通過單因素與響應面試驗優化得到飲料的最佳配方為：小球藻與紫果西番蓮的多糖溶液體積比1:2、蔗糖2.35%、檸檬酸0.14%、羧甲基纖維素鈉0.4%，感官評分為（88.71±0.87）分，制得飲料呈淺黃綠色、色澤均一，紫果西番蓮香味濃郁，酸甜適中，靜置后未有明顯沉淀與分層。中、高劑量的小球藻紫果西番蓮多糖復合飲料可顯著提高動物的運動時間，既能減少自由基引起的脂質過氧化反應，又可增強體內抗氧化酶活性，因而具有一定體內抗疲勞活性，從而在體育運動食品領域具有較好推廣前景，但對該飲料在體內抗疲勞活性的具體機制，尚需進一步研究。

圖5 兩因素交互作用的響應面Fig.5 Response surface of effect interaction between two factors

表5 復合飲料對小鼠力竭游泳時間的影響Table 5 Effect of compound beverage on exhaustive swimming time of mice

表6 復合飲料對MDA含量、T-SOD和GSH-Px活力的影響Table 6 Effect of compound beverage on MDA content and T-SOD,GSH-Px activity of mice