不同滅菌方式人參粉的皂苷含量、指紋圖譜分析及滅菌效果評價

白羽辛，王玥玥，貢濟宇，何文媛，李 妍，蔡廣知

（長春中醫藥大學, 吉林長春130000）

人參的藥用部位是根及根莖[1]，具有抗氧化[2-3]、改善記憶力[4]、保護肝臟[5]、調節免疫功能[6-7]、抗腫瘤[8]、抗抑郁[9]等作用。2015版《中國藥典》中對人參的用法用量有記載[1]，臨床應用中人參粉可輔助治療病毒性心肌炎，提高心臟造血能力，提升機體免疫力[10]，減輕早搏癥狀[11]。人參粉膠囊還用于治療心絞痛[12]，服用方便的粉類飲片是產業和消費者的共同訴求。因此人參粉的炮制關鍵技術及標準研究對建立科學全面的人參粉品質評價體系具有深遠的意義。

由于口服飲片對微生物有嚴格的控制要求，為保證產品質量，人參粉滅菌環節至關重要。中藥滅菌方式有多種，包括60Co輻照滅菌[13]、臭氧法[14]、微波干燥滅菌[15]、紫外滅菌[16]和濕熱滅菌[17-18]等。近年來藥品標準對中藥微生物限度要求越來越嚴格，隨著中藥產業發展水平與中藥質量標準的全面提升，如何因藥制宜選擇合適的滅菌方式顯得極其重要[19]。目前國內外對三七超微粉[20]、天麻、川芎、制何首烏等生藥粉[21]等均有研究。對于人參粉滅菌方式的相關研究報道較少，因此有必要對人參粉滅菌工藝進行考察。

本研究采用HPLC法建立14批不同滅菌方式人參粉樣品指紋圖譜[22]，結合聚類分析法、偏最小二乘判別分析法（PLS-DA）[23]以及模型變量投影（VIP）參數有效區分不同滅菌方式的人參粉樣品，通過比較不同滅菌方式對人參粉皂苷含量及微生物數量的影響，為選擇和確定人參粉滅菌工藝以及人參粉質量控制提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

人 參 皂 苷Rf（98.0%）、Rb1（91.1%）、Rg2（93.8%）、Rb2（93.8%）、Rd（92.1%）、Re（97.4%）、Rg1（93.6%） 批號分別為111719-201505、110704-201726、111779-200801、11715-201203、111818-201603、110754-201626、110703-201731，中國食品藥品檢定研究院；人參皂苷Rb3（97.6%）、Rc（98.0%）、Ro（98.0%） 批號分別為68406-26-81、11021-14-0、P15A6F2403，上海源葉科技有限公司；甲醇、乙腈 色譜純，賽默飛世爾科技有限公司；水 超純水。

LC-2030型高效液相色譜儀 日本島津公司；KQ3200DB超聲清洗機 昆山市超聲儀器有限公司；XFB-500型粉碎機 上海將來實驗設備有限公司；AL204萬分之一電子天平、AB135-S十萬分之一電子天平 梅特勒-托利多儀器有限公司；GB 19258紫外殺菌燈 東莞市毅萬光源有限公司；LS-35HJ濕熱滅菌鍋 上海精若科學儀器有限公司；臭氧滅菌器 大連博斯特科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 滅菌樣品制備 輻照滅菌樣品按不同劑量3、6、9 kGy制備，紫外滅菌樣品在紫外燈下照射2 h，濕熱滅菌樣品在121 ℃下滅菌10 min，臭氧滅菌樣品濃度為20 g/m3，滅菌時間為60 min，共14批人參粉樣品，見表1。

表1 樣品信息Table 1 Sample information

1.2.2 色譜條件 Agilent EC-C18柱（4.6 mm×150 mm，2.7 μm）；流動相乙腈（A）-0.1%磷酸水溶液（B）；柱溫40 ℃；流速1 mL/min；進樣量10 μL；檢測波長203 nm；梯度洗脫（0～23 min，18%～21% A；23～35 min，21%～28% A；35～80 min，28%～32% A）。

1.2.3 混合對照品溶液的制備 精密稱量對照品，加甲醇制成含人參皂苷Rg1、Re、Rf、Rg2、Rb1、Ro、Rc、Rb2、Rb3、Rd質量濃度分別為0.81、0.78、0.41、0.21、0.82、0.80、0.81、0.79、0.18、0.34 mg/mL的混合對照品儲備液，備用。

1.2.4 供試品溶液的制備 精密稱定人參粉樣品約1 g，加入20 mL 70%甲醇，稱重，超聲（500 Hz）提取30 min，放冷，以70%甲醇補足至超聲前質量，過0.22 μm濾膜，即得供試品溶液。

1.2.5 人參粉微生物數量測定 按照《中國藥典》2015版附錄“微生物限度檢查法”[24]進行微生物限度檢查，陰性組為空白培養基。

1.3 數據處理

所有數據均為三次平行實驗的平均值，采用Excel 2007對實驗數據進行處理，SPSS23.0進行方差分析和聚類分析，SIMCA-P 11.5軟件進行PLSDA分析。

2 結果與分析

2.1 人參粉的殺菌效果評價

2.1.1 微生物測定結果 2020版《中國藥典》非無菌藥品微生物限定標準（通則1107）規定含需氧菌總數≤105cfu/g、霉菌和酵母菌總數≤103cfu/g、不得檢出大腸埃希菌（1 g）；不得檢出沙門菌（1 g）；耐膽鹽革蘭陰性菌應小于104cfu（1 g）[25]。按照不同稀釋度進行檢測，可知輻照滅菌劑量高效果好，輻照強度越大，殺菌效果越好。由表2可知，輻照強度為6和9 kGy時，滅菌效果最佳。紫外滅菌能減少一定的微生物數量，但效果不佳。濕熱滅菌也能在一定程度上減少微生物的數量，但不適用于人參粉滅菌，會導致表面變色、結塊。

表2 滅菌人參粉微生物結果Table 2 Microbial results of sterilized ginseng powder

2.1.2 穩定性考察 人參粉樣品放置6個月后，對樣品（S1～S14）微生物數量進行測定，結果見表3。由此可知，放置6個月后，人參粉微生物數量有所上升，但與0個月（表2）差異不大，表明人參粉陰涼處密封放置時，微生物數量較穩定。

2.2 HPLC檢測皂苷

2.2.1 樣品的測定 按“1.2.4”項下色譜條件進行測定，混合對照品和人參粉供試品溶液（編號S1）色譜圖見圖1、圖2。

表3 滅菌人參粉6個月后微生物結果Table 3 Microbial results of sterilized ginseng powder

2.2.2 HPLC指紋圖譜的生成 采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統》（2004版），以編號S1為參照譜，因人參皂苷Rb1的峰型較好面積大且穩定，因此選擇其為參照峰。14批人參粉供試品溶液色譜圖如圖3所示，共確認出30個共有峰，指認出10個共有峰，本次實驗所建立的指紋圖譜能夠較全面的反映人參粉的指紋圖譜信息。共有峰相對保留時間和相對峰面積見表4、表5。

圖1 混合對照品圖譜Fig.1 Chromatograms of mixed control

圖2 人參粉指紋圖譜Fig.2 Fingerprint of ginseng powder

圖3 14 批人參粉指紋圖譜Fig.3 Fingerprints of 14 batches of ginseng powder

表4 共有峰相對保留時間（S1～S14）Table 4 Relative retention time of common peaks (S1～S14)

表5 共有峰相對峰面積（S1～S14）Table 5 Relative peak of common peaks (S1～S14)

表6 人參粉相似度結果Table 6 Similarity results of ginseng powder

2.2.3 相似度評價 整體相似度評價14批樣品見表6。結果顯示，未滅菌、濕熱滅菌樣品S1、S8、S6、S13的相似度為0.981～0.995，分為一類。輻照滅菌、紫外滅菌S2～S5、S9～S12相似度為0.971～0.977，為一類，臭氧滅菌樣品S7和S14相似度為0.784和0.863，為一類。

2.3 方法學考察

2.3.1 線性及范圍 精密量取人參皂苷Rg1、Re、Rf、Rg2、Rb1、Ro、Rc、Rb2、Rb3、Rd的對照品儲備溶液0.1、0.3、0.5、0.7、0.9、1 mL，并稀釋至1 mL，分別吸取10 μL進樣測定。以濃度為橫坐標（x），色譜峰的峰面積為縱坐標（y）繪制標準曲線，計算回歸方程及相關系數見表7，結果可知，方程線性關系良好。

2.3.2 精密度試驗 取供試品溶液（編號S1），按“1.2.4”項下方法制備供試品溶液，按“1.2.2”項下色譜條件連續進樣6次，參照峰為人參皂苷Rb1。共有峰相對峰面積的RSD＜1.62%，相對保留時間的RSD＜0.48%，表明儀器精密度良好。

2.3.3 穩定性試驗 取同一人參粉供試品溶液（編號S1），分別于0、4、6、8、12、24h時進樣測定。共有峰相對峰面積的RSD＜1.87%，相對保留時間的RSD＜0.51%，表明樣品24 h內穩定。

2.3.4 重復性試驗 取同一批人參粉供試品（S12），按“1.2.4”項下方法平行制備6份供試品溶液，進樣測定。共有峰相對峰面積的RSD＜2.74%，相對保留時間的RSD＜0.37%，表明重復性良好。

表7 線性范圍結果Table 7 Results of linear range

2.3.5 加樣回收率試驗 取已知含量的人參粉0.5 g，精密稱定9份，按樣品皂苷含有量的50%、100%、150%精密加入對照品溶液，依色譜條件測定，計算得出人參皂苷Rg1、Re、Rf、Rg2、Rb1、Ro、Rc、Rb2、Rb3、Rd的平均回收率依次為98.68%、98.22%、99.20%、98.67%、98.75%、99.87%、98.63%、99.75%、98.47%、98.95%，RSD依次為0.46%、1.25%、1.23%、1.02%、1.48%、1.20%、1.44%、1.43%、1.37%、1.12%，結果表明方法的準確度良好。

2.4 人參粉滅菌前后皂苷含量測定結果

將14批人參粉按“1.2.4”項下方法制備成供試品溶液，按“1.2.2”項下色譜條件進樣，每組實驗重復3次，取平均值，結果見表8。濕熱滅菌人參皂苷Rg1、Re、Rf的含量升高，人參皂苷Ro、Rc、Rb1、Rb2含量下降，隨著輻照滅菌劑量的升高人參皂苷Rg1、Re、Rb1、Rf的含量均明顯升高。臭氧滅菌Rg1、Re、Rb1、Rf、Ro、Rc、Rb2含量均明顯下降。使用SPSS 23.0軟件進行方差分析見表9。結果表明，不同滅菌方式對人參皂苷Rg1、Re、Rb1、Rc含量差異的影響極顯著（P＜0.01），對人參皂苷Ro、Rb2、Rd含量差異的影響也具有顯著性（P＜0.05）。

2.5 不同滅菌方式人參粉化學模式分析

2.5.1 聚類分析 以歐式距離為測度，選用平均連接法，指標確定為各共有峰的峰面積，用SPSS 23.0分析，見圖4。歐式距離為7.5～10時，14批樣品可聚為4類：未滅菌、紫外滅菌、低劑量輻照滅菌樣品（S1、S2、S5、S8、S9、S12）聚為一類，臭氧滅菌樣品（S7、S14）聚為一類，高劑量輻照滅菌樣品（S3、S4、S10、S11）聚為一類，濕熱滅菌樣品（S6、S13）為一類，由聚類分析可知高劑量輻照滅菌、濕熱滅菌、臭氧滅菌對人參粉皂苷含量影響較明顯。

2.5.2 PLS-DA分析 對14批樣品進行PLS-DA分析，自變量（X）和因變量（Y）確定為共有峰的峰面積和樣品，繪制PLS-DA模型得分圖，詳見圖5。可知，濕熱滅菌、臭氧滅菌樣品（S6、S7、S13、S14）為一類，分布在右側；未滅菌、紫外滅菌和輻照滅菌人參粉（S1～S5、S8～S12）分布在左側，聚為一類。相似度評價、聚類分析與PLS-DA結果大體一致。Q2=0.524，R2Y=0.518，均大于0.5，表示所建模型成立。由圖6可知，人參皂苷、Ro、Rc、Rb1的VIP值分別為1.620、1.463、1.099。這3個峰的VIP值均大于1，可知3個變量貢獻相對較大。

表8 人參粉皂苷相對含量（%）Table 8 Contents determination results of ginseng powder (%)

表9 人參粉皂苷含量的方差分析Table 9 Variance analysis of ginsenoside content in ginseng powder

2.6 滅菌前后穩定性考察

圖4 聚類分析樹狀圖Fig.4 Cluster analysis dendrogram

圖5 PLS-DA模型得分圖Fig.5 PLS-DA score plot

圖6 共有峰的VIP值Fig.6 VIP value of common peaks

人參粉樣品放置6個月后，采用“1.2.2”項下色譜條件對樣品（S1～S7）測定，對比放置6個月樣品（S1～S7）滅菌前與滅菌后含量變化見表10。結果可知，放置6個月過程中皂苷變化較小，含量相對穩定。

表10 皂苷含量穩定性考察Table 10 Stability of content of saponins

3 結論

本研究建立的HPLC指紋圖譜能較好的反映人參粉的整體特征，紫外滅菌對樣品皂苷含量影響不大，能有效減少微生物數量，但不能達到藥典要求。濕熱滅菌人參皂苷Rg1、Re的含量升高，人參皂苷Ro、Rc、Rb1、Rb2含量下降，會使人參粉變色、結塊，故不能用于人參粉滅菌。由滅菌樣品（S2～S4、S9～S11）可知，隨著輻照滅菌劑量的升高人參皂苷Rg1、Re、Rb1、Rf、Ro的含量均明顯升高，其余皂苷含量無明顯變化。臭氧滅菌指紋圖譜的相似度較低，分析原因臭氧滅菌后的人參粉可能發生了皂苷轉化。CFDA 2015年版本的《中藥輻照滅菌技術指導原則》建議中藥最大總體平均輻照劑量原則上不超過10 kGy，且滅菌放置6個月相對穩定，結合微生物數量和皂苷含量結果，可知人參粉選用輻照滅菌劑量為6 kGy是可行的。本實驗可為人參粉滅菌工藝提供理論支撐，但滅菌后的人參粉中多糖、還原糖、蛋白質含量、抗氧化活性以及藥效作用是否存在變化，是否能夠保證人參粉臨床應用的有效性和安全性，有待今后進一步研究。