添加不同物質凍藏對鯉魚肌肉蛋白功能性的影響

李艷青，郭 暢，鄭 云，鹿保鑫

（黑龍江八一農(nóng)墾大學食品學院，黑龍江大慶 163319）

冷凍魚糜是將魚肉經(jīng)過清洗、采肉、漂洗、脫水等工序制得的初加工魚肉制品，將冷凍魚糜擂潰、調味后，利用不同方式成型后進行加熱處理，得到的水產(chǎn)制品即為魚糜制品[1]。魚糜制品種類豐富，具有高蛋白、低脂肪的特點，因此深受消費者青睞。冷凍魚糜的生產(chǎn)原料很豐富，可以是海水魚，也可是淡水魚，在我國淡水漁業(yè)中，鯉魚所占比例相當大，因此，利用鯉魚生產(chǎn)魚糜制品具有廣闊的前景[2]。魚糜經(jīng)過凍結和長期的低溫貯藏，極易發(fā)生品質劣變，引發(fā)品質劣變的主要原因是蛋白質由于周邊的結合水凍結后發(fā)生冷凍變性，失去魚糜的特性，具體表現(xiàn)為肉質發(fā)生變化，如失去柔性、保水性降低、凝膠形成能下降等。這些現(xiàn)象可以通過添加冷凍變性抑制物質來緩解，現(xiàn)常用的抑制劑有砂糖、山梨醇、聚合磷酸鹽等物質，統(tǒng)稱為抗凍劑[3]。除此之外，冷凍魚糜在冷凍貯藏過程中，蛋白酶引發(fā)的蛋白質降解、蛋白質發(fā)生氧化、脂肪發(fā)生氧化等也容易引起冷凍魚糜品質的劣變[4]，其中由肌肉蛋白質氧化引起的蛋白功能特性變化近些年引起人們極大的關注。有研究表明，蛋白質氧化首先導致其結構的改變，如羰基衍生物的生成、氨基酸殘基的暴露、蛋白質的聚集以及肽鏈的斷裂等[5]，進而引起蛋白質功能特性如乳化性、凝膠特性、持水性等發(fā)生顯著的改變[6-8]。

目前國內外已有一些關于冷凍魚糜蛋白質氧化的研究報道，主要表現(xiàn)在魚糜在長時間的凍藏過程中，蛋白質發(fā)生氧化反應會導致其功能特性下降，從而給食用口感和營養(yǎng)價值帶來負面的影響[9-11]，但關于如何阻止淡水魚糜在冷凍過程中蛋白質氧化的研究還相對較少，本文主要針對如何抑制魚糜冷凍過程中發(fā)生的蛋白質氧化進行研究，從而保證魚糜優(yōu)良品質。目前食品工業(yè)中主要應用抗氧化劑來抑制食品發(fā)生氧化反應，使用的氧化劑有合成抗氧化劑，如二叔丁基羥基甲苯（Butylated Hydroxytoluene，BHA）、叔丁基羥基茴香醚（BHA）、沒食子酸丙酯（PG）、及TBHQ等，以及天然氧化劑，如香辛料和中草藥提取物，茶多酚，抗氧化蛋白多肽等。本實驗將兩種不同的抗氧化劑代表（PG和乳清蛋白水解肽）結合抗凍劑加入冷凍魚糜中，研究二者對魚肉蛋白在凍藏過程中發(fā)生的氧化反應有何作用，尋求抑制魚糜品質劣變的新途徑。

本試驗前期研究了鯉魚魚糜添加不同抗凍劑和抗氧化劑后凍藏過程中肌原纖維蛋白理化特性發(fā)生的變化，主要表現(xiàn)在隨著凍藏時間的延長，肌原纖維蛋白質羰基含量升高、總巰基含量逐漸降低，蛋白質溶解度下降，表明鯉魚肌原纖維蛋白在冷凍貯藏過程中發(fā)生了氧化變性，導致其理化性質和結構發(fā)生變化[12]。結構的變化與其功能性質密切相關，因此本試驗主要研究冷凍魚糜在凍藏過程中添加抗凍劑和兩種抗氧化劑對魚糜肌原纖維蛋白功能特性的影響，對提高冷凍魚糜的品質具有一定的理論指導意義。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

新鮮鯉魚（1.5 kg）、金龍魚大豆油 購買于本地超市；氯化鈉、磷酸鈉 分析純，天津市化學試劑一廠；蔗糖、山梨醇 分析純，黑龍江萬太生物試劑公司；十二烷基磺酸鈉（SDS） Sigma試劑公司；乳清蛋白水解肽 實驗室自制凍干品。

GL-12M型冷凍離心機 上海盧湘儀離心機儀器有限公司；電色ZE-6000型色差儀 日本電色公司；TA-XT plus型質構分析儀 英國Stable Micro System公司；MAL1038384型流變儀 英國馬爾文有限公司；S-3400N型掃描電鏡 日本日立公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品處理 尸僵后的鯉魚采肉后在低溫下（0～4 ℃）處理成魚糜，經(jīng)漂洗后分成4大份（每份約為800 g），分別加入：未添加（對照）、添加抗凍劑、添加抗凍劑；+PG（0.2%）、添加抗凍劑+乳清蛋白水解肽（1.0%），攪拌均勻后的魚糜，隨機分成15小份（每份約為50 g），封口后放置于-25 ℃，經(jīng)0、30、60、90和180 d后，從每個樣品中隨機取3份測定肌原纖維蛋白的乳化性、凝膠特性和流變學特性。

1.2.2 鯉魚肌原纖維蛋白的提取 參照Chin等[13]的方法提取肌原纖維蛋白。取適量冷凍魚糜加入4倍體積的20 mmol/L的冰磷酸鹽緩沖溶液勻漿2次（每次30 s）后置于4 ℃冷凍離心機中，8000×g離心10 min，取沉淀用4倍體積的pH7.5、20 mmol/L的磷酸鹽緩沖溶液清洗3次，再次冷凍離心，所得沉淀即為肌原纖維蛋白樣品。

1.2.3 肌原纖維蛋白乳化性的測定 采用濁度法[14]測定鯉魚肌原纖維蛋白的乳化性。乳化活力（EAI）和乳化穩(wěn)定性（ESI）分別由下面公式來表示：

式中：φ為油相體積分數(shù)(v/v)（φ=0.2）；C為蛋白質濃度；A0、A10為乳狀液在0 min、10 min時在500 nm處的吸光值。

1.2.4 鯉魚肌原纖維蛋白凝膠性測定

1.2.4.1 凝膠質構的測定 制備凝膠參照文獻[2]，以質構剖面分析方法測定其凝膠的硬度和彈性[2,15]。

質構儀參數(shù)設定如下：探頭型號為P/0.5（直徑為12 mm），物性儀重力傳感器選擇5 kg，下壓距離為10 mm（變形率為40%），測試速度為120 mm/min，每個樣品進行三次平行試驗，取平均值。

1.2.4.2 凝膠白度值的測定 測凝膠定L、a、b值，利用如下公式計算凝膠白度值：

1.2.4.3 肌原纖維蛋白凝膠保水性測定 肌原纖維蛋白根據(jù)Salvador等[16]的方法并做適當?shù)男薷暮鬁y定。

在50 mL的離心管底部稱取5 g蛋白凝膠，3000 r/min離心10 min后稱重。WHC計算公式如下：

式中，m1，m2為離心前后的重量，g；m0為空離心管的重量，g。

1.2.4.4 凝膠微觀結構的觀察 凝膠微觀結構觀察參照王博等方法進行[17]。取待測凝膠樣品，固定化處理后，冷凍干燥。掃描時將凝膠樣品切片后放置于樣品臺上，用E-1010（Giko）型離子濺射鍍膜儀在樣品表面鍍上一層15 nm厚的金屬膜，將樣品放入樣品盒中，放大1000倍條件下進行掃描拍攝。

1.2.5 流變學特性測定 肌原纖維蛋白動力流變學特性測試方法參照楊振等[18]的方法。用0.1 mol/L NaCl將提取的鯉魚肌原纖維蛋白稀釋至40 mg/mL后置于檢測平板上（直徑為60 mm）。

參數(shù)設定如下：平行板間的空隙選擇1 mm，溫度范圍為30～85 ℃，加熱速率為1 ℃/min，并在85 ℃保持10 min，振蕩頻率設定為1 Hz，應力振幅為0.02。

1.3 數(shù)據(jù)分析

除電鏡實驗外，所有實驗重復三次取平均值，數(shù)據(jù)分析用Statistix 10.0進行，通過Turkey test程序進行平均數(shù)之間顯著性差異（P＜0.05），采用Sigmaplot 12.0作圖。

2 結果與分析

2.1 肌原纖維蛋白乳化性的變化

在凍藏過程中，添加不同物質的魚糜肌原纖維蛋白乳化活性變化如圖1A所示。如圖可知，隨著凍藏時間的增加，各組樣品的乳化活性都呈不斷下降趨勢，乳化活性的降低是由于肌原纖維蛋白在長時間凍藏過程中發(fā)生冷凍變性和氧化變性，導致肌球蛋白發(fā)生交聯(lián)，從而喪失了表面吸附脂肪顆粒的能力[2]。添加抗凍劑和抗氧化劑后，在凍藏90 d時，添加抗氧化劑的兩組樣品的乳化活性高于對照組（P＜0.05），但是在凍藏180 d，添加乳清蛋白水解肽的樣品的乳化活性略低于對照組，以上結果說明，添加抗氧化劑對蛋白氧化變性起到了很好的抑制作用，有效延緩了蛋白結構的變化，從而保護肌原纖維蛋白的乳化活性，但長期凍藏時（＞180 d），添加乳清蛋白水解肽作為抗氧化劑效果較差。

不同樣品凍藏過程中肌原纖維蛋白乳化穩(wěn)定性發(fā)生的變化如圖1B所示。其變化趨勢和乳化活性相似，即隨著凍藏時間的增加，樣品的乳化穩(wěn)定性不斷降低。從實驗結果可知，凍藏90 d之前，各組試樣乳化穩(wěn)定性下降趨勢較平緩，說明添加抗凍劑和抗氧化劑對蛋白結構起到較好的保護作用，當凍藏時間達到180 d時，各組試樣的乳化穩(wěn)定性下降明顯，甚至低于對照組，說明長時間凍藏后肌原纖維蛋白原有的穩(wěn)定結構被破壞嚴重，導致蛋白質發(fā)生交聯(lián)和聚集[12]，因此不能作為有效的表面活性劑，從而降低了蛋白的乳化穩(wěn)定性。

圖1 鯉魚肌原纖維蛋白乳化活性和乳化穩(wěn)定性的變化Fig.1 Changes of EAI and ESI of common carp MP

2.2 肌原纖維蛋白凝膠性的變化

2.2.1 凝膠質構（TPA）的變化 添加不同物質后凍藏的鯉魚肌原纖維蛋白凝膠彈性和硬度的變化如圖2所示，二者變化趨勢相似。從圖中可以看出，隨著凍藏時間的增加，四組試樣的凝膠彈性和硬度都呈不斷下降的趨勢，如經(jīng)過180 d凍藏后，對照組、添加抗凍劑組、添加抗凍劑+PG組、添抗凍劑+WPI水解肽組試樣凝膠彈性分別降低了47.5%、38.9%、28.6%和34.8%，凝膠硬度分別降低了55.3%、59.2%、42.0%和46.8%，由圖還可得出，添加兩種抗氧化劑組試樣的凝膠彈性和硬度始終優(yōu)于對照組試樣和添加抗凍劑試樣（P＜0.05）。

凍藏后鯉魚肌原纖維蛋白凝膠特性的持續(xù)下降，主要是由于蛋白質氧化變性導致肌球蛋白間的交聯(lián)作用減弱，未能形成良好的三維網(wǎng)絡結構，蛋白凝膠形成能力下降[19-20]。而抗氧化劑的加入能有效抑制蛋白質氧化的發(fā)生，減緩了蛋白質凝膠彈性和持水能力的下降。

2.2.2 凝膠保水性和白度的變化 圖3A是添加不同物質凍藏過程中冷凍魚糜肌原纖維蛋白凝膠保水性的變化。如圖所示，四組試樣的凝膠保水性隨著凍藏時間的延長不斷下降，兩組添加抗凍劑+抗氧化劑試樣的凝膠保水性高于對照組（P＜0.05），實驗結果表明添加抗凍劑和抗氧化劑后凍藏的鯉魚肌原纖維蛋白凝膠具有更高的持水性，這意味著形成的凝膠具有更好的三維網(wǎng)狀結構。凍藏過程中凝膠保水性降低的主要原因是蛋白質在氧化過程在中發(fā)生了羰氨反應，導致維持三維網(wǎng)狀結構的氫鍵形成能力下降[21]，加入抗氧化劑抑制了蛋白質發(fā)生氧化，從而使得蛋白變性程度較小，因此呈現(xiàn)較好的保水性。

圖2 鯉魚肌原纖維蛋白凝膠彈性和硬度的變化Fig.2 Changes of gel springiness and hardness of common carp MP

圖3 鯉魚肌原纖維蛋白凝膠保水性和白度的變化Fig.3 Changes of gel water holding capability and whiteness of common carp MP

圖3 B是添加不同物質后凍藏過程中鯉魚肌原纖維蛋白凝膠白度的變化。由圖可知，隨著凍藏時間的增加，四組樣品的凝膠白度值均呈不斷下降趨勢，添加抗凍劑+抗氧化劑組試樣的凝膠白度值始終大于對照組，且差異顯著（P＜0.05）。凝膠白度值的降低可能是由于冷凍貯藏過程中肌肉蛋白氧化引起的，也可能是由于脂肪氧化引起色素蛋白與肌肉蛋白交聯(lián)引起的[22]。在相同凍藏條件下，添加抗凍劑和抗氧化劑試樣白度值高于未添加抗凍劑試樣是因為二者在一定程度上抑制了鯉魚魚糜肌原纖維蛋白的氧化。

2.2.3 凝膠微觀結構的變化 如圖4所示，新鮮肉（圖4F）提取蛋白形成的凝膠組織狀態(tài)好，凝膠表面光滑，孔洞均勻、細致，蛋白束平滑，具有良好的三維網(wǎng)狀結構。經(jīng)過凍藏后樣品提取的肌原纖維蛋白形成凝膠的微觀結構出現(xiàn)了不同程度的損傷。圖中A組（對照組）隨著凍藏時間的延長，凝膠微觀結構變化最為嚴重，凝膠網(wǎng)狀結構逐漸疏松、不均勻，蛋白質束出現(xiàn)斷裂，凍藏180 d時，凝膠網(wǎng)狀結構凝斷裂嚴重，出現(xiàn)塌陷。B組（抗凍劑）隨著凍藏時間的延長，凝膠微觀結構也發(fā)生不同程度的損傷，180 d時凝膠微觀結構發(fā)更明顯的斷裂并出現(xiàn)更大的孔洞，而添加抗氧化劑的兩組樣品（圖4C和圖4D），隨著凍藏時間的延長，凝膠結構雖然也發(fā)生不同程度的破損，但凍藏30和90 d后，凝膠結構明顯優(yōu)于A和B組，凍藏180 d時，凝膠網(wǎng)狀結構也出現(xiàn)大小不等的孔洞并發(fā)生斷裂。

從總體來看，所有樣品經(jīng)過不同時間的凍藏其凝膠結構都有不同程度劣化，但添加PG和蛋白水解肽的樣品凝膠結構變化相對較小，尤其是在短時間凍藏（＜90 d），說明二者可以在凍藏過程中防止蛋白質氧化，從而起到保護蛋白質凝膠結構的作用。

2.3 添加不同抗凍劑凍藏對鯉魚肌原纖維蛋白流變特性的影響

通過測定動力流變學的貯存模量（G'）和損失模量（G''），可以闡明蛋白質凝膠及其網(wǎng)狀結構形成的機理[23]。如圖5所示，新鮮鯉魚的肌原纖維蛋白加熱后，代表彈性性能的G′先上升后下降，然后再次上升，二次峰值分別出現(xiàn)在46和70 ℃，兩次峰值分別代表“凝膠形成”和“凝膠加強”的溫度，加熱結束后，蛋白質之間的產(chǎn)生交聯(lián)，形成一個堅固的、不可逆的熱誘導凝膠。

圖4 鯉魚肌原纖維蛋白凝膠微觀結構的變化Fig.4 Changes of microstructure of commom carp MP gels

由圖5可以看出，隨著凍藏時間的增加，所有樣品的G′都呈不斷下降趨勢，并且G′出現(xiàn)峰值的溫度也有所下降。如凍藏30 d時，對照組、添加抗凍劑組、添加抗凍劑+PG、添加抗凍劑+WPI水解肽組的第一個峰值從新鮮魚肉的3666 Pa分別降至1934、2537、3209、2827 Pa，其對應的峰值溫度也從46 ℃分別降至42.9、43.8、45.2、44.3 ℃。凍藏90 d后，四組樣品的第一個峰值從新鮮魚肉的3666 Pa分別降至1653、2013、2911、2310 Pa，其對應的峰值溫度也從46 ℃分別降至41.2、42.8、44.2、43.1 ℃，凍藏180 d后，各組樣品的G′已無明顯差別，故沒有對其進行測定分析。以上結果說明，凍藏過程中，各樣品的彈性性能均有所下降，凍藏時間越長，彈性性能下降越嚴重。Wang[24]等指出較低的G′可能是由于蛋白質凝膠的三維網(wǎng)狀結構的破裂，也可能是維持α-螺旋結構的氫鍵發(fā)生斷裂，α-螺旋結構解折疊造成的。這個解折疊過程主要發(fā)生在肌原纖維蛋白中的肌球蛋白上，同時也弱化了肌原纖維蛋白的彈性成分，引起蛋白凝膠彈性的下降。實驗中各組樣品凝膠彈性下降的主要原因是，在凍藏過程中肌原纖維蛋白質發(fā)生氧化變性，引起蛋白結構及蛋白分子間和分子內作用力的變化，從而導致三維網(wǎng)狀結構破裂[25]，添加抗凍劑和抗氧化劑后，對蛋白起到了保護作用，尤其是添加抗氧化劑組的彈性性能優(yōu)于其他組。

圖5 鯉魚肌原纖維蛋白流變學特性的變化Fig.5 Changes of rheological properties of common carp MP

G′′一般用來描述凝膠體系的粘度性能。G′′的峰值變化趨勢一般與G′相似，本實驗中添加抗凍劑和抗氧化劑的試樣與對照組的損耗模量G′′變化趨勢同G′變化，實驗結果得出添加抗氧化劑組樣品的粘度性能優(yōu)于其他實驗組。

樣品的粘彈性的改變可以通過G′′/G′（損失因子）來說明。G′′/G′是蛋白凝膠形成過程中“粘性”與“彈性”的相對分布比值，也就是說G′′/G′值越高，樣品系統(tǒng)更粘稠或缺乏彈性[26]。表1比較了各樣品在加熱終點時的粘彈性（G′′/G′）的變化，在加熱結束時，新鮮樣品的G′′/G′為0.16，凍藏30 d后，對照組、添加抗凍劑組、添加抗凍劑+PG組、添加抗凍劑+WPI水解肽組的G′′/G′分別為0.29、0.23、0.20和0.21。凍藏90 d后，四組樣品對應的G′′/G′分別為0.30、0.26、0.21和0.23。G′/G′數(shù)值的改變說明當鯉魚肌原纖維蛋白在凍藏過程中形成的凝膠粘彈性均有所損失，但添加抗凍劑和抗氧化劑組樣品的粘彈性損失較少，說明抗凍劑和抗氧化在一定程度上能抑制蛋白質的冷凍變性，尤其是抗氧化劑的添加，更能有效的保護蛋白質的凝膠性。這一結果與本試驗中蛋白凝膠的質構特性、凝膠微觀結構等相一致。

3 結論

以冷凍魚糜為研究對象，在凍藏過程中添加不同抗凍劑和抗氧化劑，以期抑制魚糜冷凍過程中由水分冷凍和蛋白質氧化引起的品質劣變。實驗研究得出，冷凍魚糜在凍藏過程中肌原纖維蛋白肌原纖維蛋白乳化性、凝膠性、流變特性均降低，但添加不同物質后凍藏，下降程度也有所不同，在凍藏90 d時，添加抗凍劑+PG和抗凍劑+乳清蛋白水解肽組樣品的乳化性、凝膠性、流變特性明顯優(yōu)于對照組和只添加抗凍劑組，凝膠微觀結構也相對較完整，說明添加抗氧化劑可以在一定程度上抑制凍藏過程中肌原纖維蛋白質氧化的發(fā)生，從而抑制其功能性下降，本試驗創(chuàng)新性地將蛋白質氧化問題引入冷凍魚糜凍藏過程，并提出在凍藏過程中添加化學和天然抗氧化劑均可抑制蛋白質功能性的劣變，從而提高其功能性，對冷凍魚糜的實際生產(chǎn)具有一定的指導意義。

表1 加熱終點時添加不同物質樣品的G′、G′′、G′′/G′值Table 1 G′、G′′、G′′/G′ of every samples with different additives at the end of heating