黏液性與非黏液性結直腸腺癌中PD-L1、CD8的表達

李貴蘭，陸麗平，饒曉松

結直腸癌的發病率、病死率均較高，腺癌是其常見類型，根據其組織病理學特點可將腺癌分為多種亞型，其中黏液性結直腸腺癌(mucinous colorectal adenocarcinoma, MCA)占結直腸腺癌的15%～20%，與非黏液性結直腸腺癌(non-mucinous colorectal adenocarcinoma, non-MCA)相比，MCA分化程度低且惡性度高，MCA患者常表現較高的轉移風險，手術和化療后效果不佳，預后較差[1]。近年免疫檢查抑制劑在癌癥免疫療法中備受關注，應用程序性死亡蛋白-1(programmed death protein-1, PD-1)或程序性死亡蛋白-配體1(programmed death protein-ligand 1, PD-L1)抑制劑的免疫療法已成為治療惡性腫瘤的有效手段，如非小細胞肺癌、腎細胞癌、黑色素瘤等[2-5]。在惡性腫瘤組織中PD-L1通過結合T細胞上的PD-1能抑制宿主T細胞對腫瘤組織的免疫反應[4-5]。PD-L1發揮作用與T細胞密切相關，特別是抗腫瘤CD8+T細胞，PD-L1陽性腫瘤細胞和CD8+T細胞是新輔助化療治療局部晚期直腸癌患者預后的關鍵標志物[6]。本文應用免疫組化法檢測MCA和non-MCA中PD-L1和CD8的表達，探討兩者之間是否存在差異，以期為臨床免疫療法提供線索。

1 材料與方法

1.1 材料收集2017年1月～2020年6月北京大學國際醫院接受手術治療的結直腸癌患者106例，其中non-MCA 90例，MCA 16例，所有患者無免疫系統疾病，未合并其他腫瘤，術前均未接受治療。查閱患者臨床病理資料，男性68例，女性38例，年齡40～80歲，≤50歲者35例，>50歲者71例。

1.2 免疫組化鼠抗人PD-L1購自Gene Tech公司，鼠抗人MLH1購自徠卡公司，鼠抗人CD8、MSH2、MSH6、PMS2均購自北京中杉金橋公司，阿辛藍/PAS染色試劑盒購自珠海貝索生物公司。應用徠卡全自動免疫組化儀(BOND-MAX，徠卡公司，德國)進行PD-L1、CD8、MLH1、MSH2、MSH6和PMS2染色，免疫組化染色采用EnVision兩步法。

1.3 結果判定本組分別評估腫瘤細胞與腫瘤間質中PD-L1的免疫組化染色結果，腫瘤細胞陽性標準為僅有細胞膜染色(無論完整與否以及染色強度)。腫瘤間質免疫細胞(淋巴細胞、巨噬細胞和樹突細胞)的細胞膜或細胞質著色均判為陽性：PD-L1陽性細胞≥5%為陽性[7]。計算腫瘤組織中PD-L1陽性率的均數，高于均數為高表達，低于均數為低表達。200倍視野下隨機選取5個10 000 μm2腫瘤間質中CD8+T細胞的數量，計算其均數，即代表為該腫瘤組織中CD8+T細胞的表達量，再計算腫瘤組織中CD8+T細胞數量的均數，高于均數為CD8高表達，低于均數為低表達。檢測腫瘤錯配修復系統蛋白MLH1、MSH2、MSH6、PMS2的表達，其中≥1項陰性則判定腫瘤為微衛星不穩定(microsatellite instability, MSI)，而MLH1、MSH2、MSH6、PMS2均陽性則判定為微衛星穩定(microsatellite stability, MSS)。

2 結果

2.1 MCA與non-MCA組織學特征MCA表現為腸壁內不規則腺體浸潤，腺腔內外充滿黏液，腫瘤細胞核大深染，異型性明顯；non-MCA表現為腸壁內不規則腺體浸潤，腺腔內無或含少量黏液，間質炎細胞彌漫浸潤，腫瘤細胞核大，空泡狀，核仁明顯，可見核分裂象(圖1、2)。MCA組與non-MCA組相比，其內含大量黏液，占腫瘤組織面積的50%以上(圖3、4)。

①②③④⑤⑥⑦A⑦B

2.2 MCA與non-MCA組織中PD-L1的表達兩組腫瘤組織中PD-L1多表達于腫瘤間質的免疫細胞(圖5、6)。本組僅7例腫瘤組織的癌細胞中有PD-L1表達，占總標本的6.6%，且在腫瘤細胞中占比較小(<1%腫瘤細胞)，腫瘤細胞呈乳頭狀生長，間質血管豐富，擴張充血，腫瘤細胞呈假復層結構排列，核呈長橢圓形，空泡狀，核仁明顯，胞質粉染(圖7)。本組non-MCA組織中PD-L1表達高于MCA，差異有統計學意義(P<0.001，圖8)。

圖8 黏液性結直腸腺癌(MCA)與非黏液性結直腸腺癌(non-MCA)組織中PD-L1的表達

2.3 MCA與non-MCA組織中CD8+T細胞的表達免疫組化結果顯示，在non-MCA組織中23%的PD-L1和CD8同時高表達，48%的PD-L1和CD8同時低表達，7%的PD-L1高表達和CD8低表達，22%的PD-L1低表達和CD8高表達。在MCA組織中有40%的PD-L1和CD8同時低表達，60%的PD-L1低表達而CD8高表達。

2.4 MCA與non-MCA組織中CD8+T細胞的表達本組non-MCA組織的單位面積腫瘤間質中CD8+T細胞數量為15.3，MCA組織為9.2，盡管non-MCA組CD8+T細胞數量的絕對值高于MCA組，但兩者差異無統計學意義(圖9)。

圖9 黏液性結直腸腺癌(MCA)與非黏液性結直腸腺癌(non-MCA)組織中CD8+ T細胞的表達

2.5 MCA與non-MCA組織中的MSI和MSS本組實驗結果顯示，PD-L1陽性的non-MCA中有11%為MSI，89%為MSS；PD-L1陽性的MCA中有14%為MSI，86%為MSS。另外，本組還分析PD-L1陽性的結直腸腺癌的發生部位，其中50%為直腸，25%為乙狀結腸，13%為升結腸，4%為橫結腸，5%為降結腸，3%為全結腸。

3 討論

結直腸癌為消化道常見的惡性腫瘤，其發病率與病死率較高[1,8]。MCA作為結直腸腺癌的亞型之一，與non-MCA相比，具有分化程度低，惡性度高，易轉移，手術和化療后的治療效果不理想，預后較差等特點[1]。研究MCA與non-MCA分子表型差異，將為結直腸腺癌的治療及預后評估等提供線索。目前手術、化療和放療是治療結直腸癌的主要方法。近年腫瘤微環境越來越受重視，研究腫瘤細胞和免疫微環境之間的關系越來越受到關注。應用免疫檢查點抑制劑調節免疫功能逐漸成為一種新興的治療方法[2,9]，該療法被應用于晚期腫瘤患者、腫瘤發生轉移患者以及不適合一線多藥物化療的患者[9]。文獻報道PD-L1陽性的腫瘤對于抗PD-1/PD-L1治療表現出更強的敏感性，且療效更好，提示檢測腫瘤組織中PD-L1的表達對于預測免疫治療效果有一定的價值[2,9-11]。本組實驗探討MCA和non-MCA的腫瘤細胞及間質中相關免疫細胞PD-L1的表達及差異，結果顯示：不同于非小細胞肺癌及腎細胞癌等，結直腸腺癌中PD-L1主要表達于腫瘤間質的免疫細胞，且non-MCA組織中PD-L1表達比MCA高。結合文獻和本組實驗結果，表明non-MCA患者應用PD-L1/PD-1抑制劑的效果可能優于MCA患者，但實際臨床效果需進一步驗證。另外，在肺癌和卵巢癌中亦發現，黏液性肺癌和黏液性卵巢癌中PD-L1表達比非黏液性肺癌和卵巢癌低[12-13]。

有研究發現，在腫瘤細胞表面PD-L1表達缺失，而腫瘤間質細胞表達PD-L1的小鼠中，應用PD-L1/PD-1抑制劑依然能抑制腫瘤的免疫逃逸反應，提示腫瘤間質細胞表達PD-L1在腫瘤免疫逃逸中發揮重要作用[14]。有研究表明巨噬細胞可通過表達PD-L1與T淋巴細胞表面PD-1結合，抑制T淋巴細胞增殖和活化，并誘導效應T細胞凋亡，導致T淋巴細胞對腫瘤細胞殺傷作用下降，引起腫瘤細胞免疫逃逸[15]。本組實驗結果顯示，結直腸腺癌中PD-L1主要表達于腫瘤間質的免疫細胞，應用PD-L1/PD-1抑制劑治療結直腸癌的相關機制值得深入探究。

CD8+T細胞的表達多用來評估癌癥患者預后，PD-L1與CD8+T細胞在腫瘤組織中高表達提示對PD-L1/PD-1抑制劑敏感性更強，預后較好[16]。本組non-MCA中有23%的PD-L1和CD8同時高表達，MCA中PD-L1表達均較低。研究發現在結直腸癌中PD-L1 mRNA表達與γ干擾素(interferon-γ, IFN-γ)基因表達有關，T細胞分泌的IFN-γ能促進活化的免疫細胞表達PD-L1[17]。但依然有7%的non-MCA組織中PD-L1高表達和CD8低表達，22%的PD-L1低表達和CD8高表達，這表明PD-L1表達和調控還受其它因素影響。

盡管目前研究結果顯示，對于結直腸腺癌，PD-1/PD-L1抑制劑主要在MSI-H腫瘤中表現較好的療效[18]，但亦有研究表明細胞毒性T淋巴細胞相關抗原-4(cytotoxic T-lymphocyte associated antigen-4, CTLA-4)和PD-1/PD-L1雙重抑制對于治療MSS結直腸癌有一定療效[19]，研究顯示地西他濱能增強PD-1/PD-L1抑制劑治療MSS結直腸癌的作用[20]，這表明PD-1/PD-L1抑制劑用于治療MSS結直腸癌的應用前景值得進一步探索。此外，本組實驗結果顯示，PD-L1陽性的結直腸腺癌主要表達于直腸和乙狀結腸。

綜上所述，結直腸腺癌中PD-L1主要表達于腫瘤間質的免疫細胞，進一步研究免疫細胞PD-L1的作用機制及其表達和調控，將對應用免疫療法治療結直腸腺癌提供重要理論基礎。