胃癌組織中腺苷酸激酶4和HIF-1α的表達及其臨床意義

夏 林，王勁松

胃癌是消化系統常見的惡性腫瘤之一，近年來隨著胃鏡技術的發展，胃癌的早期發現和診斷已有所提高，但晚期胃癌的發病率仍然較高。晚期胃癌的治療主要是手術結合化療及靶向治療，但患者術后5年生存率較低，主要原因是腫瘤細胞發生了侵襲、轉移。因此尋找和識別胃癌進展過程中參與的基因對于發現新的胃癌預后標志物和治療靶點具有重要意義。腺苷酸激酶(adenylate kinase, AK)是一種豐富的核苷酸磷酸轉移酶，其主要作用是通過將1個ATP或GTP分子中的1個磷酸基團轉移到AMP上，催化產生2個ADP分子，從而平衡細胞腺嘌呤核苷酸組成以維持能量穩態[1]。AK4是AK家族的成員之一，最近研究發現肺腺癌中AK4陽性提示肺癌患者預后差，其可促進肺癌細胞的轉移[2]。AK4在胃癌中的研究尚未見文獻報道，本文應用免疫組化EnVision法檢測胃癌組織中AK4和低氧誘導因子1α(hypoxia-inducible factor-1α, HIF-1α)的表達，旨在探討AK4在胃癌發生、發展中的作用及其與HIF-1α的關系，為胃癌的治療尋找新的治療靶點。

1 材料與方法

1.1 臨床資料收集2015年1月～2017年12月江蘇省揚中市人民醫院存檔的手術切除胃癌組織79例，其中男性49例，女性30例，患者年齡43～86歲，平均66.5歲，中位年齡67歲。所有患者術前均未行化療或放療，術后均有完整的病理診斷。79例胃癌分化程度：高分化6例，中分化37例，低分化36例；Lauren分型：腸型55例，彌漫型24例；腫瘤侵及肌層24例，侵及漿膜下及漿膜外者55例；有淋巴血管侵犯者33例，無淋巴血管侵犯者46例；有淋巴結轉移者44例，無淋巴結轉移者35例；pTNM分期中，Ⅰ期20例，Ⅱ期25例，Ⅲ期34例。取距離腫瘤>5 cm的癌旁正常胃黏膜組織作為正常對照。

1.2 試劑與方法鼠抗人AK4單克隆抗體(OTI3B1，LSbio公司，稀釋比1 ∶150)購自珠海泉輝公司；兔抗人HIF-1α單克隆抗體(EP118，稀釋比1 ∶100)與EnVision法檢測試劑盒均購自北京中杉金橋生物公司。所有手術標本均經10%中性福爾馬林固定，常規石蠟包埋，4 μm厚連續切片3張，分別行HE染色和免疫組化染色。免疫組化染色采用EnVision法，切片梯度乙醇脫蠟和水化后，高壓鍋高溫高壓進行抗原修復，然后滴加一抗，4 ℃冰箱內孵育過夜，次日依次滴加二抗，DAB顯色，鏡下控制反應時間，蘇木精復染，中性樹膠封固。用已知肺癌陽性組織作為陽性對照，PBS代替一抗作為陰性對照。

1.3 結果判斷AK4陽性定位于細胞質，呈顆粒狀，HIF-1α陽性定位于細胞質。結果判斷由兩名病理醫師采用雙盲法判讀，結果不一致者在多人共攬顯微鏡下達成意見一致。結果判斷依據文獻[3]，先根據染色強度分為：無染色為(-)，弱陽性為(1+)，中等陽性為(2+)，強陽性為(3+)；然后根據陽性細胞百分比為25%進一步分為2組，AK4和HIF-1α高表達定義為陽性細胞染色強度為(2+)或(3+)，且陽性細胞比例>25%。

1.4 統計學分析采用SPSS 23.0軟件進行統計學分析，AK4和HIF-1α表達與胃癌臨床病理參數之間的關系采用χ2檢驗及列聯系數進行分析，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 胃癌及癌旁組織中AK4和HIF-1α的表達AK4陽性信號為顆粒狀胞質陽性(圖1、2)，HIF-1α陽性信號為胞質伴或不伴胞膜陽性(圖3、4)。79例胃癌組織中AK4高表達率為73.4%(58/79)，高于癌旁正常組織(25.3%，20/79)，兩組相比差異有統計學意義(χ2=36.563，P<0.01)。胃癌組織中HIF-1α的高表達率為69.6%(55/79)，高于癌旁正常組織(16.5%，13/79)，差異有統計學意義(χ2=45.541，P<0.01)。

①②③④

2.2 胃癌組織中AK4和HIF-1α高表達與臨床病理特征的關系胃癌組織中AK4高表達率與淋巴結轉移、脈管侵犯和臨床分期密切相關，淋巴結陽性的胃癌組織AK4高表達率明顯高于淋巴結陰性的胃癌組織，伴有脈管侵犯的胃癌組織中AK4高表達率高于無脈管侵犯者，臨床分期Ⅲ+Ⅳ期胃癌組織AK4高表達率明顯高于Ⅰ+Ⅱ期胃癌，差異均有統計學意義(P均<0.05，表1)。HIF-1α在胃癌組織中的表達與腫瘤Lauren分型、淋巴結轉移及臨床分期有關(P<0.05)，與患者性別、年齡、分化程度、浸潤深度和脈管侵犯等無關(P>0.05，表1)。

表1 胃癌組織中AK4和HIF-1α高表達與臨床病理特征之間的關系

2.3 胃癌組織中AK4和HIF-1α表達的相關性統計分析顯示，胃癌組織中AK4和HIF-1α表達呈正相關(P<0.05，表2)。

表2 胃癌組織中AK4和HIF-1α表達的相關性

3 討論

近年來隨著內窺鏡技術的進展，早期胃癌的檢出率有所提高，且患者預后較好，但晚期胃癌患者目前尚缺乏有效的治療方法，預后仍較差。研究發現惡性腫瘤的發生、發展不僅涉及到原癌基因的激活和抑癌基因的失活，還涉及到能量代謝相關的基因。AK是生物活細胞中參與高能量磷酸化轉移反應的一種關鍵調節酶，在細胞的能量代謝中發揮重要作用[4]。目前研究發現AK有9種，不同類型AK在細胞內的定位不同，其中AK4定位于線粒體基質中[5]。位于線粒體基質中的AK4已被證明作為一種應激反應蛋白與線粒體ADP/ATP轉位酶物理性結合以維持細胞存活[6]。有研究顯示，沉默AK4表達可使細胞ATP水平提高到25%，同時增加ADP/ATP比例，活化AMPK信號，從而參與惡性腫瘤的發生、發展[7]。

本實驗采用免疫組化法分析了胃癌及其癌旁正常組織中AK4的表達，結果顯示AK4在癌組織中的高表達率明顯高于癌旁正常組織，且胃癌組織中AK4高表達率與胃癌淋巴結轉移、脈管侵犯和臨床分期密切相關，提示AK4不僅可能參與了胃癌的發生，而且可能在胃癌的侵襲、轉移過程中發揮重要作用。盡管AK4表達與胃癌的相關性國內外尚未見文獻報道，但AK4在其他一些惡性腫瘤中的表達已有相關研究。Jan等[2]采用微陣列研究發現AK4在肺腺癌組織中表達上調，且AK4高表達與腫瘤分期晚、疾病復發和預后差有關，提示AK4促進了肺腺癌的惡性進展。龐亮等[8]研究了85例肌肉浸潤性膀胱癌及對應癌旁組織中AK4的表達，結果顯示AK4在癌組織中高表達，在癌旁組織中無表達，進一步分析膀胱癌組織中AK4表達與臨床病理特征的關系，結果顯示AK4高表達與膀胱癌遠處轉移和脈管內瘤栓密切相關，生存分析顯示膀胱癌中AK4高表達患者的生存時間明顯低于低表達者。李辰運等[9]研究發現，胰腺癌組織中AK4的表達高于對應癌旁組織，且AK4表達與胰腺癌腫瘤分期、淋巴結轉移、神經侵犯和脈管內瘤栓相關。綜合文獻報道與本組實驗結果，提示AK4高表達可能參與多種惡性腫瘤的發生、發展。

缺氧是實體性惡性腫瘤的重要特征。研究發現低氧環境可增強癌細胞的侵襲能力，增加腫瘤細胞對放、化療的抵抗，使腫瘤細胞更易發生侵襲和轉移。HIF-1α是目前發現的一種介導細胞低氧反應中關鍵的轉錄抑制因子，其在常氧狀態下容易被細胞內蛋白酶體系泛素化降解，缺氧時在細胞內聚集，通過正性調節細胞生存、增加新生血管數量及腫瘤細胞糖酵解，從而促進腫瘤細胞的增殖、侵襲和轉移[10]。研究發現HIF-1α在多種腫瘤中均過表達，朱園園等[11]研究發現子宮內膜腺癌中HIF-1α表達與腫瘤臨床分期、組織學分級、肌層浸潤和淋巴結轉移有關。在胃癌研究中，倪小晴等[12]研究發現HIF-1α在胃癌組織中的表達高于正常組織，且HIF-1α表達與胃癌分化程度、浸潤深度、淋巴結轉移和TNM分期相關。崔立娟等[13]研究發現腫瘤直徑≥3 cm、中低分化腺癌、Ⅲ+Ⅳ期及有淋巴結轉移的胃癌組織高表達HIF-1α。本組實驗結果顯示，胃癌組織中HIF-1α的表達高于癌旁正常組織，且與胃癌Lauren分型、淋巴結轉移及臨床分期有關，與患者性別、年齡、分化程度、浸潤深度和脈管侵犯等無關，與文獻報道相符[14]。提示HIF-1α參與胃癌的發生、發展，并可作為預測胃癌侵襲性生物性行為的一種標志物。

Jan等[3]研究發現肺癌組織中AK4和HIF-1α表達呈正相關，且兩者結合可預測肺癌患者更差的存活率，同時分子生物學研究亦發現AK4過表達可通過增加細胞內ROS水平來提高HIF-1α表達，隨后在低氧條件下誘導腫瘤上皮-間質轉化而促進肺癌的進展。本實驗分析了胃癌組織中AK4和HIF-1α的相互關系，結果顯示兩者在胃癌中的表達呈正相關，提示AK4可能通過調控HIF-1α而促進胃癌的發生、發展，但具體的機制尚需要更進一步進行研究。

總之，本組實驗結果顯示，AK4可能通過調控HIF-1α參與了胃癌的發生、發展，檢測胃癌組織中AK4和HIF-1α的表達可有助于評估胃癌的生物學行為和患者預后，并可能為胃癌的治療提供一個基因靶點，但具體的機制尚需要進行深入的分子生物學研究。