肝細胞生長因子對大鼠大腦中動脈梗塞后凋亡變化的實驗分析

許璐璐，湯 宏，高 寧，沈 倩，陳 杰，吳海波

腦卒中是人類致殘及致死率較高的疾病之一，隨著中國社會老齡化、居民不健康生活，腦卒中的發生率每年增長約8.3%，其中以缺血性卒中占比最多[1]。由于腦梗塞發生后出現急性局部血流中斷，從而發展為缺血缺氧、腦組織軟化壞死，甚至出現相應的神經系統癥狀，嚴重的會導致昏迷和死亡[2]。隨著醫療環境及技術的發展，缺血性腦卒中治療已經飛速發展，如阿司匹林等一系列抗血小板藥物的臨床應用，以及近些年興起的溶栓取栓操作，均使缺血性腦卒中的治療有了明顯改善，但缺血性腦卒中引起的致殘率及帶給患者家庭的經濟負擔是無法估計的。

肝細胞生長因子(hepatocyte growth factor, HGF)是一種能調節血管和神經再生、組織重建及抗凋亡信號的細胞因子，HGF與其受體c-Met結合激活信號通路從而產生生物學效應[3]。研究表明，HGF與激活的c-Met結合能保護心臟避免心肌缺血引起的損傷，以及有助于缺血后的心室重塑等[4]，HGF在Alzheimer疾病和脊髓軸索損傷中能起到神經保護作用[5-6]，但其在顱內卒中的研究報道較少。本實驗將探究大鼠大腦中動脈栓塞(middle cerebral artery occlusion, MCAO)模型建立后HGF對腦組織凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組雄性SD大鼠62只，每只重250～300 g，由美國羅馬琳達大學動物實驗中心提供，隨機分為Sham組、MCAO組及HGF組，實驗組按不同取材時間點分為模型后6、24、72 h。具體分組如下：實驗1組：將大鼠隨機分為Sham組、MCAO組(6、24、72 h)，每組6只大鼠，Western blot檢測取材使用的腦組織為大鼠受傷側/右側大腦半球腦組織；實驗2組：將大鼠隨機分為Sham組、MCAO組(24 h)，每組4只大鼠，用于免疫熒光共染定位c-Met與神經元；實驗3組：將大鼠隨機分為Sham組、MCAO組(24 h)、HGF組，每組6只大鼠，在模型制作成功后24 h進行行為學評定，并處死大鼠，行TTC染色；實驗4組：將大鼠隨機分為Sham組、MCAO組(24 h)、HGF組，每組4只大鼠，用于TUNEL染色評估細胞死亡。

1.2 主要試劑及儀器重組人HGF(美國Abcam公司)，兔抗c-Met抗體(美國Aabcam公司)，德國徠卡熒光顯微鏡，TUNEL試劑盒(美國Roche公司)，TTC試劑(美國Sigma Aldrich公司)。

1.3 模型制作MCAO模型制作參照文獻[7]，氯胺酮(80 mg/kg)/甲苯噻嗪(20 mg/kg)腹腔注射麻醉成功后，仰臥位平躺暴露頸部，正中切開皮膚分離皮下組織及肌肉，顯露右側頸總動脈、頸內動脈及頸外動脈，結扎頸外動脈遠端，用顯微動脈阻斷夾臨時阻斷頸總動脈血流，并在頸外動脈近端剪一小口，將線栓經小口逐步放入頸內動脈至右側大腦中動脈處，感覺到阻力或線栓進入長度達1.8～2 cm即為達到大腦中動脈處，此時結扎固定線栓，縫合皮膚，放置37 ℃溫箱復蘇。Sham組僅將線栓放入大腦中動脈位置后立即拔出[8]。HGF組大鼠在MCAO造模成功后1 h經鼻腔內給藥，每只大鼠10 μg/kg。

1.4 神經行為學評分修定的Garcia評分和平衡木測試用于大鼠的神經行為學評分，Garcia評分共有6組(自發運動、四肢對稱性運動、前肢外伸、爬行、身體本體感覺及胡須觸覺反應)，每組評分范圍0～3分。平衡木為測試大鼠在狹長的木棍上行走1 min的能力，評分范圍0～5分[9]。

1.5 梗塞面積評估模型制作成功后24 h處死大鼠，斷頭取腦，切片放入TTC中浸泡，待腦組織顏色改變后取出拍照，梗塞區面積使用Image J軟件統計。

1.6 免疫熒光、TUNEL染色大鼠在模型制作成功后24 h再次麻醉大鼠，斷頭取腦，經10%中性福爾馬林、30%蔗糖浸泡，冷凍切片機10 μm厚切片，分別經過兔抗c-Met抗體過夜及相應二抗，最后在熒光顯微鏡下拍照。TUNEL染色同樣取10 μm厚切片，按照試劑盒說明書步驟進行操作，最后在顯微鏡下拍照[10]。

1.7 Western blot法模型制作成功后在相應的時間點斷頭處死大鼠，取右側梗塞大腦半球腦組織快速放入液氮并轉移至-80 ℃低溫冰箱保存。待所有時間點準備完成后按說明書操作提取蛋白，制備10%分離膠+4%積層膠，待電泳轉膜后，加入一抗孵育過夜，次日孵育二抗，再曝光顯影，曝光條帶使用Image J軟件分析。

1.8 統計學分析采用Prism 6.0軟件進行統計學分析，不同組間數據分析采用Student-test或One-way ANOVA，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 大鼠MCAO模型建立后腦組織中c-Met的表達Western blot結果顯示，大鼠MCAO模型建立后腦組織中c-Met表達逐漸增多，并在24 h達峰值，與Sham組相比，差異有統計學意義(P<0.05，圖1)。

圖1 MCAO模型建立后腦組織中c-Met的表達：與Sham組比較，*P<0.05

2.2 大鼠MCAO模型建立后24 h腦組織神經元中c-Met的表達免疫熒光雙標顯示，c-Met在大鼠腦組織神經元中表達，且MCAO組的表達明顯多于Sham組(圖2)。

圖2 A.c-Met與神經元標志物(NeuN)定位：綠色為c-Met，紅色為NeuN，藍色為DAPI；B.從缺血半暗帶區域選取的圖片

2.3 HGF給藥對大鼠行為學評分和梗塞面積的影響HGF給藥組Garcia和平衡木評分較Sham組和MCAO組有明顯改善，差異有顯著性(P<0.05)，同時TTC染色顯示HGF組梗塞面積小于MCAO組，差異有顯著性(P<0.05，圖3)。

圖3 大鼠在MCAO模型后的行為學評分和TTC染色：A、B.分別是Modified Garcia和平衡評分;C、D.分別是大鼠腦組織TTC染色和梗塞面積統計；與Sham組比較，*P<0.05，與MCAO組比較，#P<0.05

2.4 HGF給藥對神經元凋亡的影響TUNEL染色示，HGF給藥組TUNEL陽性細胞明顯少于MCAO組，差異有顯著性(P<0.05)，取材點為梗塞區附近的半暗帶(圖4)。

圖4 HGF給藥對神經元凋亡的影響：A.TUNEL與神經元免疫熒光染色，紅色為TUNEL，綠色為神經元，藍色為DAPI核；B.三組TUNEL陽性神經元的百分比，與Sham組相比，*P<0.05；與MCAO組相比，#P<0.05；C.從缺血半暗帶區選取的圖片

3 討論

本實驗發現，大鼠腦梗塞后給予HGF治療能明顯減輕梗塞面積及提高大鼠行為學評分，而且能使TUNEL陽性的凋亡細胞減少。首先實驗通過大鼠MCAO模型建立后不同時間點確定HGF的受體c-Met在24 h達峰值。其次實驗用免疫熒光法證明c-Met在大鼠腦組織神經元中表達。實驗再次證明HGF給藥后大鼠的梗塞面積減少且行為學評分升高，可能是通過抗凋亡減輕TUNEL陽性細胞產生作用。

目前卒中是全球第二大主要致死疾病，僅次于缺血性心臟疾病。據WHO統計，每年約有1 500萬人發生卒中[11]。缺血性卒中很大比例是由動脈粥樣硬化所致，隨著知識的普及，人們逐漸認識到高血壓、糖尿病、吸煙等均與缺血性卒中的發生密切相關[12]。目前對于缺血性卒中，全國各大醫院成立了卒中中心，爭取在發病6 h以內進行干預治療，挽救缺血壞死腦組織，然而對于中國這樣發展中國家，各個地域發展不均衡，尤其是偏遠地區患者很難及時送診，因此積極探討藥物對卒中影響的研究有著至關重要的作用。

HGF是一種能調節血管再生、神經再生、組織重建的細胞因子，同時也發現HGF能通過AKT調節抗凋亡信號[13]。c-Met是一種絡氨酸激酶受體，其主要表達于上皮細胞、內皮細胞、肝細胞以及神經元[14]，HGF是c-Met的特異性配體，并且與c-Met結合后能導致一系列生物反應，如增殖、遷移、血管再生等。Nakamura等[15]在對心臟的研究發現，缺血發生后使用HGF的特殊抗體使內源性HGF失效，則導致心肌細胞死亡明顯升高，梗塞面積擴大，從而證明HGF對缺血心臟有明顯保護作用。蔣晨雪等[16]在腫瘤的研究中發現HGF/c-Met通路可通過PI3K/Akt促進腫瘤血管生成，抑制腫瘤細胞凋亡以及促進腫瘤細胞轉移。然而HGF與c-Met結合在腦細胞產生作用的機制尚未明確。因此本實驗從大鼠MCAO模型建立后腦組織神經元中c-Met的表達，證明HGF/c-Met信號存在于神經細胞中，并可能產生一系列的作用。

凋亡是缺血性腦卒中后常見的病理現象，腦組織的缺氧損傷誘發細胞凋亡，凋亡發生能直接影響缺血半暗帶區腦組織的存活，是腦梗進一步加重的機制之一[17]。在心肌梗塞和腫瘤的研究中均發現HGF/c-Met信號通路存在抗凋亡功能，本實驗重點探究缺血性腦卒中后調節凋亡細胞能否改善半暗帶區腦組織的功能。Hong等[18]的研究證實內源性HGF通過血液再通進入腦組織產生抗凋亡功能。本實驗結果顯示c-Met在大鼠MCAO模型建立后表達升高，且在24 h達峰值，3天時表達仍偏高，說明大鼠在腦梗塞發生后腦組織可能出現自我保護機制，促進c-Met受體增多，在此時給予外源性HGF使之與c-Met結合，產生級聯生物學反應，調控凋亡細胞挽救缺血半暗帶區的腦組織，從而減輕大鼠腦組織梗塞面積，并改善大鼠的行為學評分。

卒中發生后腦組織會出現一系列的病理反應過程，如氧化應激、炎癥、凋亡、血腦屏障的破壞及自噬的發生等，本文僅從凋亡角度探討HGF對腦組織缺血性卒中發生的作用，存在局限性，后續實驗可以進一步探究HGF對其他作用的影響。綜上所述，HGF可以減輕大鼠腦梗塞后的凋亡，也許能成為研究治療梗塞的機制之一。