胰腺癌中Legumain的表達及其對胰腺癌細胞增殖和遷移的影響

張 波，王正峰，朱 駿，嚴 俊，陳浩斐，張寶騰，周文策,2

胰腺癌是一種高度致命的惡性腫瘤，發病率和病死率持續上升，5年生存率僅為9%，預計在未來20～30年其將成為癌癥相關死亡的第二大病因[1-2]；手術切除是唯一治愈的機會，但由于胰腺癌早期癥狀不典型且易轉移，缺乏有效的診療手段，大多數患者確診時已失去手術根治機會。因此，尋找有效的早期診斷生物標志物及治療靶點成為臨床研究的重點。Legumain(LGMN)是半胱氨酸蛋白酶C13家族的一員，最初發現于豆科植物中，也存在于人體內，其定位于人第14號染色體上，編碼433個氨基酸[3]。研究顯示LGMN為促癌基因，能夠促進多種腫瘤的發生和轉移，并參與調節患者的預后[4-5]。但是關于LGMN與胰腺癌的關系鮮有報道。慢性胰腺炎是胰腺癌的主要危險因素，研究發現[6]，LGMN通過激活TGF-β1促進慢性胰腺炎纖維的形成，作者推測LGMN參與胰腺癌的進展。本文通過檢測胰腺癌組織和癌旁組織中LGMN的表達，分析其臨床意義；并在細胞水平進行驗證，探討LGMN在胰腺癌中的作用情況，以期為胰腺癌的治療和預后提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1組織學標本 收集2015年6月～2019年12月蘭州大學第一醫院普外科實施根治性手術切除并經病理證實的胰腺癌組織67例及其對應癌旁組織61例，其中男性47例，女性20例，年齡30～79歲，平均60歲。所有病例臨床資料均完整，術前均未行放、化療等抗腫瘤治療。

1.1.2細胞及病毒 人胰腺癌細胞株AsPC-1和胰腺正常上皮細胞HPNE購自上海中科院，Legumain shRNA慢病毒和陰性對照組由上海漢尹生物公司合成。

1.1.3主要試劑 DAB試劑盒和SP試劑盒購自福州邁新生物公司，胎牛血清(FBS)和RPMI-1640培養基購自以色列BI公司，DMEM培養基購自美國Gibco公司，反轉錄和PCR擴增試劑盒購自日本Takara公司，引物GAPDH和Legumain購自上海生工公司，CCK-8試劑購自日本同仁公司，Transwell小室購自美國Corning公司，BCA蛋白定量試劑盒購自江蘇碧云天公司，BCL-2抗體購自美國Abcam公司，Bax、Legumain以及GAPDH抗體購自美國CST公司，二抗購自美國SAB公司，PVDF膜和ECL發光液購自美國Millipore公司。

1.2 方法

1.2.1免疫組化 采用免疫組化SP法檢測LGMN的表達，操作步驟嚴格按照試劑盒說明書進行。將4 μm厚切片用二甲苯脫蠟，梯度乙醇脫水，使用檸檬酸鹽緩沖液(pH 6.0)在壓力鍋中進行抗原修復，冷卻后PBS洗3次，加入100 μL兔抗人LGMN一抗(1 ∶800)，4 ℃冰箱過夜。待一抗復溫、PBS洗滌后，加入二抗，室溫孵育20 min，DAB顯色，蘇木精復染，中性樹脂封固。

結果判定：每張切片由兩名資深病理科醫師根據切片陽性細胞染色比例及染色強度綜合判定LGMN染色結果。(1)按染色強度計分：不著色為0分，淡黃色(弱陽性)為1分，棕黃色(中等陽性)為2分，棕褐色(強陽性)為3分；(2)按陽性細胞染色比例計分：無陽性腫瘤細胞為0分，陽性細胞數<20%為1分，20%～50%為2分，51%～70%為3分，>70%為4分；將上述兩項得分結果相乘作為最終結果：≥4分為高表達，≤3分為低表達。

1.2.2細胞培養與慢病毒轉染 AsPC-1細胞用含10%FBS的RPMI-1640培養基，HPNE細胞用含10%FBS的DMEM培養基，置于恒溫培養箱(37 ℃、5%CO2)中培養。將處于對數生長期的AsPC-1細胞消化后鋪在6孔板中，待細胞匯合度在30%～40%時進行病毒感染。共分為3組：以未干預的細胞作為空白對照組，轉染空白載體細胞為陰性對照組，LGMN敲低細胞為實驗組。根據慢病毒轉染指南，按MOI=20加入慢病毒液感染24 h，3天后在陰性對照組和實驗組中加入2 μg/mL的嘌呤霉素，隔天換液，篩選10天獲得穩定轉染的細胞株。

1.2.3RNA提取和RT-PCR TRIzol試劑盒提取細胞的總RNA，逆轉錄合成為cDNA，將此原液稀釋5倍后采用TB Green Premix Ex Taq Ⅱ進行RT-PCR反應，每組設3個復孔。引物序列如下：Legumain引物序列：上游5′-CGTTGTGATGATGTACGATGAC-3′，下游5′-GACTCCCTGATAGACATCTGTG-3′；GAPDH引物序列：上游5′-GTCTCCTCTGACTTCAA CAGCG-3′，下游5′-ACCACCCTGTTGCTGTAGCCAA-3′，運用2-ΔΔCt計算mRNA的相對表達量。

1.2.4CCK-8實驗 胰酶消化對數生長期的細胞，計數后調整密度為每毫升2×104個細胞，按每孔100 μL細胞懸液接種于96孔板，每組重復5次。將CCK-8溶液和無血清RPMI-1640培養基按1 ∶10配置，棄掉原液后，每孔加100 μL配置液，培養箱中孵育2 h，酶標儀測450 nm波長處的吸光度(OD)值，每天測1次，連測4天。采用GraphPad 7.00軟件繪增殖曲線。

1.2.5Transwell實驗 三組細胞胰酶消化后用無血清的培養基重懸；取600 μL RPMI-1640培養基(含30%FBS)加入Transwell下室、200 μL細胞懸液(含3×104個細胞)接種于上室，隨后將該24孔板移至孵箱中培養36 h；4%多聚甲醛固定、結晶紫染色，PBS洗滌后倒置顯微鏡下多視野拍照(200×)。

1.2.6Western blot法 提取各組細胞總蛋白，使用BCA法測其濃度，定量后100 ℃沸水中煮10 min使蛋白變性。配膠，上樣進行SDS-PAGE凝膠電泳，切膠，轉膜，5%脫脂牛奶室溫封閉1 h，加入一抗(LGMN、BCL-2、Bax及GAPDH，稀釋比均為1 ∶1 000)，4 ℃孵育過夜。復溫，TBST洗膜10 min×3次，加入HRP標記的二抗(稀釋比1 ∶2 000)室溫孵育1 h，TBST洗膜10 min×3次，ECL曝光顯影。采用Image J軟件行條帶灰度分析。

1.3 統計學分析利用SPSS 22.0軟件進行統計學分析，兩個樣本計數資料間差異采用四格表χ2檢驗，兩組間比較采用t檢驗，三組間比較采用單因素方差分析。每個實驗至少重復3次，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 胰腺癌及癌旁組織中LGMN的表達LGMN主要定位于細胞質，67例胰腺癌組織中44例(65.7%)高表達，23例(34.3%)低表達；61例癌旁組織中僅3例(4.9%)高表達，其余58例(95.1%)均為低表達；胰腺癌組織中LGMN的高表達率明顯高于癌旁組織(χ2=50.720，P<0.01)。高表達LGMN的胰腺癌組織可見腫瘤上皮細胞胞質呈棕黃色或棕褐色，染色面積大；癌旁組織胰腺正常上皮細胞中LGMN為陰性或呈淡黃色，同時發現LGMN在部分胰腺腺泡中也有一定的表達(圖1)。

ABC

2.2 LGMN表達與胰腺癌臨床病理特征的關系LGMN蛋白表達與胰腺癌患者性別、年齡、腫瘤大小、腫瘤位置、TNM分期、血管侵犯、CA19-9水平無關(P>0.05)，與腫瘤分化程度、淋巴結轉移有關(P<0.05)；腫瘤分化程度越低或有淋巴結轉移者，LGMN的表達量越高(表1)。

表1 胰腺癌中LGMN表達與臨床病理特征的關系[n(%)]

2.3 胰腺細胞系中LGMN的表達及其在AsPC-1細胞中的敲低情況RT-PCR結果顯示，LGMN mRNA在AsPC-1細胞中的相對表達量(2.159 0±0.108 2)顯著高于HPNE細胞(1.000 0±0.020 2)，差異有統計學意義(t=10.52，P=0.000 5)；同時發現AsPC-1細胞中的LGMN蛋白相對表達量(0.952 8±0.049 0)亦高于HPNE細胞(0.503 5±0.063 7)，差異有統計學意義(t=7.152，P=0.002，圖2A)。轉染慢病毒后，實驗組LGMN mRNA和蛋白相對表達量較對照組均顯著下降，差異有統計學意義(P<0.001)，對照組間差異無統計學意義(P>0.05，圖2B～D)。

圖2 胰腺細胞系中LGMN的表達及其在AsPC-1細胞中的敲低情況：A、B.LGMN蛋白表達電泳圖；C、D.LGMN mRNA和蛋白相對表達量直方圖；與陰性對照組相比，***P<0.001，****P<0.000 1

2.4 LGMN敲低對AsPC-1細胞增殖能力的影響CCK-8法比較24 h、48 h及72 h三組細胞的OD值，與空白對照組相比，陰性對照組細胞的OD值減小(P24 h=0.059 9，余P<0.01)；與空白、陰性對照組相比，LGMN敲低組細胞的OD值均明顯減小(P<0.001，圖3)；表明下調LGMN可抑制AsPC-1細胞的增殖能力。

圖3 LGMN敲低對AsPC-1細胞增殖能力的影響：與陰性對照組相比，**P<0.01，****P<0.000 1

2.5 LGMN敲低對AsPC-1細胞遷移能力的影響Transwell實驗檢測AsPC-1細胞遷移能力變化，與空白對照組相比，陰性對照組穿過的細胞數目略有減少(P=0.011 8)；與空白、陰性對照組相比，LGMN敲低組穿過的細胞數目明顯減小(P<0.000 1，圖4)；表明下調LGMN可抑制AsPC-1細胞的遷移能力。

圖4 LGMN敲低對AsPC-1細胞遷移能力的影響：與陰性對照組相比，*P<0.05，****P<0.000 1

2.6 LGMN敲低對凋亡相關蛋白的影響與空白、陰性對照組相比，LGMN敲低組BCL-2蛋白表達降低，BCL-2/Bax比值顯著降低，差異有統計學意義(P<0.01)；LGMN敲低組中Bax蛋白表達雖有升高，與對照組相比差異無統計學意義(P>0.05，圖5)；表明下調LGMN可促進細胞凋亡。

圖5 LGMN敲低對凋亡相關蛋白的影響：與陰性對照組相比，**P<0.01，***P<0.001

3 討論

2003年，研究人員首次報道LGMN在多種實體腫瘤中高表達，其結構相當保守，多由腫瘤細胞或腫瘤相關巨噬細胞表達并分泌，過表達LGMN可增強癌細胞的遷移和侵襲活性[7]。在腫瘤中，LGMN可能作為一種應激反應蛋白，在缺氧或熱休克等極端條件下產生，參與腫瘤的進展。LGMN是一種pH依賴性蛋白酶，在酸性溶酶體中活性最高，其活性升高可促進腫瘤的生長和轉移，并與患者預后不良呈正相關[3]，揭示了LGMN作為腫瘤治療靶標的潛力。LGMN在卵巢癌[8]、前列腺癌[9]、乳腺癌[10]、子宮頸癌[11]、胃癌[5,12]等癌組織或細胞中高表達；而且在卵巢癌[8]、乳腺癌[10]、胃癌[5]中，LGMN表達可作為獨立預后危險因素，其高表達患者預后更差。在治療方面，埃索美拉唑可通過抑制LGMN酶的活性來預防腫瘤轉移[13]；口服LGMN激活修飾的聚合物納米載體，負載索拉非尼，可增強口服給藥到腫瘤的能力，已被用于胃癌的光熱聯合化療[14]。通過GEPIA網站分析發現，LGMN mRNA在胰腺癌組織中的表達顯著高于胰腺正常組織，差異有統計學意義(P<0.01)[15]。提示LGMN可能作為促癌因素參與胰腺癌的進展。然而，LGMN在胰腺癌組織和細胞中的表達和作用尚未見報道。

本組實驗發現，LGMN在67例胰腺癌組織中的表達明顯高于癌旁組織；腫瘤分化程度和淋巴結轉移是影響胰腺癌患者預后的重要因素，LGMN表達越高，腫瘤分化程度越低或更易發生淋巴結轉移，提示LGMN與胰腺癌預后密切相關。Guo等[16]的實驗發現LGMN在282例胃癌組織中高表達，其高表達與TNM分期、遠處轉移顯著相關，LGMN表達越高，患者總生存期越短。這與本組實驗結果基本一致。在細胞水平，胰腺癌AsPC-1細胞中LGMN表達顯著高于胰腺正常上皮細胞。下調LGMN后，細胞增殖和遷移能力均明顯減弱，說明LGMN在胰腺癌中是一種腫瘤促進因子。Zhu等[9]研究發現LGMN在前列腺癌細胞中差異表達，敲低LGMN后，凋亡細胞比例明顯增加，通過激活PI3K/Akt信號通路抑制前列腺癌細胞的增殖和侵襲能力，過表達則相反。Meng等[11]研究發現子宮頸癌細胞中LGMN高表達，下調LGMN可以抑制子宮頸癌細胞的遷移和侵襲，其機制可能是通過抑制基質金屬蛋白酶(MMP-2、MMP-3)的激活。在胃癌中也發現類似的情況[12]。本組實驗在培養AsPC-1細胞時，發現LGMN敲低組死亡細胞較多，為探究其原因，遂檢測了凋亡相關蛋白的變化。Western blot法實驗結果顯示，與空白、陰性對照組相比，實驗組抑凋亡蛋白BCL-2表達顯著下降，凋亡相關蛋白Bax表達上升不明顯，但BCL-2/Bax比值顯著下降。Sun等[17]研究發現下調LGMN可顯著增加氧化低密度脂蛋白誘導的巨噬細胞凋亡及Caspase-3、Caspase-9和Bax的表達。何開明等[18]在肺癌細胞中研究發現Cyr61過表達可通過促進凋亡蛋白Bax和Caspase-3表達、抑制BCL-2表達來激活Caspase-3通路，從而抑制細胞的增殖。陳筱雪等[19]在破骨前體細胞中也發現了類似研究。表明下調LGMN可能通過BCL-2/Bax激活凋亡通路從而誘導胰腺癌細胞凋亡，造成實驗組和對照組死亡細胞差異。

綜上所述，LGMN在胰腺癌組織及細胞中高表達，下調LGMN可顯著抑制胰腺癌細胞AsPC-1的增殖和遷移能力，并通過調控BCL-2/Bax的表達，激活凋亡通路，促進AsPC-1細胞凋亡。LGMN對胰腺癌的發生、發展起重要促進作用，在分化程度更低或有淋巴結轉移的胰腺癌患者中預測更好，其可能成為胰腺癌治療和預后的新靶點，但其具體的作用機制仍待深入探究。