醇溶性和水溶性伊紅在活檢小組織標本預染上的應用比較

熊紅梅，卓小花，邱曉明

近年各種內鏡及細針穿刺活檢小組織標本越來越多，由于取材的局限性，取材組織數(shù)量少、體積小，給技術員在制片過程中帶來困難。目前國內外對于小標本的預處理方法不盡相同，有酸化的伊紅液[1]、未酸化的伊紅液、伊紅-固定液[2]等預染法，均采用水溶性伊紅配成的各種預染液。由于試劑配置方法、劑量等均無統(tǒng)一標準，采用常規(guī)的伊紅滴染法效果不佳。為了增加組織的肉眼識別度，提高包埋、切片的速度和質量，筆者在日常外檢工作中采用醇溶性伊紅在脫水中對活檢小標本進行預染，取得滿意效果，現(xiàn)介紹如下。

1 材料與方法

1.1 材料收集2018年1月福建省龍巖市第一醫(yī)院病理科胃腸鏡、陰道鏡活檢標本及肺、乳腺、前列腺穿刺組織標本合計200例，直徑均小于0.3 cm，隨機分成2組：水溶性伊紅預染法組、醇溶性伊紅預染法制作組，每組各100例。標本取材均使用相同規(guī)格的正方形包埋紙，應用相同的折疊方式包裹組織防止漏檢，兩組均用櫻花Vip5脫水機，常規(guī)固定、脫水、透明，水溶性及醇溶性伊紅粉劑購自上海試劑三廠。

1.2 試劑0.5%水溶性伊紅配置：0.5 g水溶性伊紅溶于100 mL蒸餾水。0.05%醇溶性伊紅配置：1.75 g醇溶性伊紅溶于脫水機第1道3 500 mL無水乙醇中。

1.3 方法(1)水溶性伊紅預染法：取材時用0.5%水溶性伊紅滴1～2滴于每一例組織上，再用包埋紙包好后放入包埋盒，入脫水機處理。(2)醇溶性伊紅預染法：取材時不滴染伊紅，直接包埋紙包好放入包埋盒，入脫水機處理，在換脫水液時在第1道3 500 mL無水乙醇中加入1.75 g醇溶性伊紅，稍攪伴溶解均勻，直到下一次更換脫水液時為止。本科室每天檢測150～200個活檢小標本，使用1個月，中間無需添加伊紅。兩種方法均使用相同機器和流程，脫水時間12 h，比較組織的肉眼識別度及鏡下HE染色結果。

1.4 結果判定根據(jù)蠟塊組織標準進行評判[2]，包埋時肉眼觀察活檢小組織：鮮紅色為()，淡紅色為(+)，極微弱紅色或完全不著色為(-)。鏡下評判標準根據(jù)《臨床技術操作規(guī)范·病理學分冊》進行染色評判。

1.5 統(tǒng)計學方法采用SPSS 19.0軟件進行統(tǒng)計學分析，計數(shù)資料采用秩和檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 兩種方法在脫水后的組織著色對比水溶性伊紅滴染的胃腸鏡活檢標本及陰道鏡子宮頸活檢標本均有不同程度的褪色，包埋時呈淡紅色，穿刺組織呈微弱或完全不著色，包埋后組織與石蠟對比不明顯，識別度較低。醇溶性伊紅預染法各種活檢小標本均呈鮮紅色，包埋時組織與石蠟對比鮮明，明顯優(yōu)于水溶性伊紅滴染法(P<0.001，表1，圖1～6)。

圖1 水溶性伊紅預染法：穿刺組織，不著色 圖2 醇溶性伊紅預染法：穿刺組織，鮮紅色 圖3 水溶性伊紅預染法：胃組織，不著色 圖4 醇溶性伊紅預染法：胃組織，鮮紅色 圖5 水溶性伊紅預染法：子宮頸組織，微弱紅色 圖6 醇溶性伊紅預染法：子宮頸組織，鮮紅色 圖7 水溶性伊紅預染法：胃組織，細胞核呈藍色，細胞質呈紅色，紅細胞呈鮮紅色 圖8 醇溶性伊紅預染法：胃組織，細胞核呈藍色，細胞質呈紅色，紅細胞呈鮮紅色

表1 兩種方法脫水后的組織著色對比

2.2 兩種方法組織結構對比鏡下觀察兩種方法制作切片的HE染色，結果顯示組織均結構完整，細胞核呈藍色，細胞質呈紅色，紅細胞呈鮮紅色，對比清晰，染色效果無明顯差異(圖7、8)。

3 討論

臨床病理工作中，取材醫(yī)師肉眼觀察活檢小標本直徑為0.01～0.2 cm，呈點狀或米粒狀。穿刺組織呈條索狀，由于體積小，標本又極其珍貴，若預染不當，包埋時組織與石蠟顏色相近，不易識別，易造成遺漏或丟失現(xiàn)象。常規(guī)方法在取材時逐個滴染水溶性伊紅，組織經(jīng)脫水機第一缸10%中性福爾馬林固定及梯度乙醇脫水后均有不同程度脫色，導致包埋時顏色淡或不著色。由于伊紅是酸性染料，組織成分的等電點3.3～5.2，著色后的組織經(jīng)10%中性福爾馬林固定，pH>5.0，伊紅的結合能力下降，染液結合牢度減弱，在乙醇脫水過程中易快速褪色[3]。醇溶性伊紅預染法將組織浸泡在脫水的第1道無水乙醇中30 min，再經(jīng)二道無水乙醇脫水。因此醇溶性伊紅預染法與水溶性伊紅預染法相比，其優(yōu)點如下：(1)易識別、醒目，提高包埋、切片的速度與質量，不致于過切或少切，提高制片效率。水溶性伊紅預染法屬于滴染法，醇溶性伊紅預染法屬于浸染法，有學者研究使用水溶性伊紅的浸染固定法與滴染法之間著色差異無顯著性[4]，但浸染法與滴染法的制片時間差異有顯著性[4]。醇溶性伊紅預染法是將醇溶性伊紅加入無水乙醇中，不易脫色。伊紅浸染固定法是將水溶性伊紅加入10%中性福爾馬林，將組織浸泡在含伊紅的固定液中固定，再經(jīng)后續(xù)的各級濃度乙醇脫水后，乙醇會使已染上伊紅的組織不同程度脫色，此水溶性伊紅浸染固定法與水溶性伊紅滴染法著色無顯著性，醇溶性伊紅浸染法與水溶性伊紅滴染法著色差異有顯著性。(2)節(jié)省試劑用量及配制時間，水溶性伊紅預染法所需的伊紅試劑多、濃度高，配制較麻煩，醇溶性伊紅預染法無需另外配制，只需在脫水無水乙醇試劑內按0.05%濃度直接加入醇溶性伊紅粉劑，試劑用量少，配制簡單。(3)縮短取材時間，減少工作流程，提高工作效率。無論是不同酸類酸化或未酸化水溶性伊紅滴染法[1]或蘇木精滴染法[4]，取材時每例均滴上1～2滴預染液，耗時，影響取材速度，對于活檢小標本工作量大的單位尤其不適用。盡管有些學者用0.4%伊紅-福爾馬林固定液[2]或0.15%蘇木精-福爾馬林固定液[4]對活檢小標本浸染固定法均能獲取良好的效果，但需增加浸染的時間和流程。醇溶性伊紅預染法無需額外增加時間和工作流程，在脫水中預染，明顯提高工作效率。(4)脫水機堵管：丁偉等[3]報道將伊紅加入95%或無水乙醇中，使用時間久后，可能會引起伊紅在脫水機管路中沉淀、累積，導致機器堵塞，筆者經(jīng)2年實踐，將醇溶性伊紅加入無水乙醇中并未發(fā)現(xiàn)堵管現(xiàn)象。按本科室每天150～200個蠟塊工作量，使用1個月后更換脫水試劑時用乙醇計測得第1道無水乙醇濃度降為96%，第1道95%乙醇濃度降為80%，第2道95%乙醇濃度降為90%。第1道無水乙醇濃度降為96%能使0.05%醇溶性伊紅徹底溶解，缸底未發(fā)現(xiàn)有伊紅沉淀現(xiàn)象。如果將醇溶性伊紅加入脫水的第1道或第2道95%乙醇，會出現(xiàn)少許沉淀現(xiàn)象。文獻報道[5]將少許伊紅加入80%脫水乙醇中使活檢小標本染上伊紅色，由于醇溶性伊紅在低濃度乙醇中溶解度低，隨著脫水液使用周期延長，乙醇濃度下降易導致堵管現(xiàn)象的發(fā)生。因此，為防止脫水機故障，將伊紅加在第1道無水乙醇中為佳。

總之，用酸化伊紅液滴染[1]、蘇木精滴染、蘇木精浸染固定法[4]進行預染，均取得良好效果。本科室使用醇溶性伊紅預染法切片顏色鮮艷，效果穩(wěn)定，非常方便，值得臨床推廣應用。