EBER原位雜交檢測中手工與BenchMark ULTRA自動化染色差異

侯 俊，廖 瓊，周成敏，譚燕勤

與EBV感染相關(guān)的疾病有鼻咽癌、NK/T細胞淋巴瘤、EBV相關(guān)性胃癌、淋巴上皮瘤樣癌、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤等。原位雜交是檢測組織EBV感染的金標準，與PCR和免疫組化相比，原位雜交具有高度靈敏性和特異性，組織定位明確。目前最常用的EBER原位雜交試劑分別有適用于手工和全自動免疫組化染色儀兩種類型的試劑盒。本實驗使用北京中杉金橋公司的手工檢測試劑盒和羅氏EBER全自動檢測試劑盒同時對淋巴瘤、EBV相關(guān)性胃癌、鼻咽癌幾種不同類型標本進行檢測，現(xiàn)將檢測結(jié)果報告如下。

1 材料與方法

1.1 標本選取四川省腫瘤醫(yī)院2014～2020年EBV感染相關(guān)病例20例(手術(shù)切除標本8例、活檢小組織8例、穿刺組織4例)。常規(guī)石蠟切片，切片厚度4 μm。每個樣本連續(xù)切片3張，分別使用陽離子防脫載玻片2張(用于手工檢測及HE染色)和日本松浪基膜載玻片1張(用于全自動檢測)。待檢切片均使用65 ℃烤片60 min。

1.2 儀器設(shè)備BenchMark ULTRA、恒溫孵育箱。

1.3 試劑地高辛染色液試劑盒(北京中杉金橋公司)、二甲苯、95%乙醇、無水乙醇、TBS緩沖液、蒸餾水、中性樹膠、蘇木精染色液、水溶性伊紅染色液，羅氏原位雜交EBER試劑盒以及配套的儀器使用試劑。

1.4 方法

1.4.1全自動染色檢測 切片使用Benchmark ULTRA全自動檢測：加熱模塊升溫EZ液脫蠟，CC2細胞修復(fù)95 ℃ 4 min，Reaction Buffer清洗，加EBER探針雜交，86 ℃雜交8 min，SSC清洗；加Iview anti-fluorescein(鼠抗FITC一抗)去結(jié)合探針，孵育20 min；加Iview blue biotinylated Ig(生物素標記的山羊抗鼠Ig)孵育8 min；加Iview blue SA_AP(堿性磷酸酶標記的鏈霉親和素)孵育16 min；加Iview blue enhancer(MgCl2)孵育8 min；加Iview blue NBT和Iview blue BCIP孵育32 min顯色；加Red Stain II復(fù)染4 min；染色結(jié)束，蒸餾水洗；40 ℃烤箱烤干切片，用新鮮二甲苯漂洗切片(忌乙醇)；中性樹膠封固。

1.4.2手工染色檢測 切片脫蠟至95%乙醇后，空氣干燥5 min；每張切片滴加足夠量的胃酶工作液入37 ℃孵箱孵育10～20 min；棄去胃酶工作液，95%乙醇、無水乙醇脫水、空氣干燥；切片滴加5～20 μL EBER探針，加蓋硅化蓋玻片，37 ℃雜交過夜(孵育盒內(nèi)保濕)；TBS緩沖液洗去蓋玻片；TBS緩沖液洗3 min×3次；滴加HRP標記抗地高辛抗體50～100 μL，37 ℃孵育30 min；TBS緩沖液沖洗3 min×3次，暗處DAB顯色3 min；回收DAB顯色液，蒸餾水沖洗，蘇木精復(fù)染，乙醇脫水、二甲苯透明、中性樹膠封固。

2 結(jié)果

全自動檢測試劑盒染色EBER陽性部位顯示為紫色(BCIP/NBT顯色)，核固紅復(fù)染，呈紅色；手工檢測試劑盒染色EBER陽性部位顯示為棕色(DAB顯色)，蘇木精復(fù)染細胞核呈藍紫色。兩種檢測方式均得到了很好的染色效果(圖1、2)。其中2例穿刺樣本組織形態(tài)結(jié)構(gòu)疏松，條形組織的兩側(cè)邊緣出現(xiàn)了明顯擠壓、牽拉，全自動檢測，視野內(nèi)陽性為30%，組織邊緣出現(xiàn)非特異著色(圖3)；使用手工檢測，視野內(nèi)陽性為50%，組織邊緣未見非特異性著色(圖4)。

圖1 肺淋巴上皮瘤樣癌使用BenchMark ULTRA自動化染色，原位雜交 圖2 肺淋巴上皮瘤樣癌使用手工檢測，原位雜交 圖3 鼻咽癌頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移穿刺樣本使用BenchMark ULTRA自動化染色，原位雜交 圖4 鼻咽癌頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移穿刺樣本使用手工檢測，原位雜交

3 討論

兩種EBER原位雜交檢測方法均適用于手術(shù)切除標本和活檢小組織。穿刺取樣可能對組織形態(tài)和結(jié)構(gòu)造成不可逆影響，在組織形態(tài)和結(jié)構(gòu)受到破壞的區(qū)域，細胞內(nèi)的蛋白質(zhì)和核酸無法得到很好保存，導致這些區(qū)域出現(xiàn)非特異染色或陽性染色信號減少。本組選取了4例5～6年前手術(shù)切除樣本，兩種檢測方式均能取得很好的檢測結(jié)果。由此推斷，在樣本前處理得當?shù)那闆r下，EBV核酸能夠在常規(guī)石蠟樣本中有效保存較長時間不被降解，可選用5年內(nèi)前處理良好的蠟塊進行EBER原位雜交。

在穿刺樣本檢測中，手工染色檢測與全自動染色檢測相比，具有相對更好的特異性和敏感性(圖3、4)。本組2例穿刺樣本使用全自動檢測陽性約為30%，組織邊緣出現(xiàn)非特異著色；使用手工檢測陽性約為50%，組織邊緣未見非特異性著色。由此得出結(jié)論：在穿刺樣本檢測中，使用手工檢測的特異性、敏感性方面優(yōu)于全自動檢測，使用全自動檢測存在假陰性的風險，我們需評估全自動檢測帶來的假陰性風險，穿刺樣本建議使用手工試劑盒檢測。全自動免疫組化平臺在規(guī)范化、標準化檢測方面對比手工檢測有著不可比擬的優(yōu)勢，然而并非所有類型的樣本均適用于全自動檢測。

本實驗在EBER原位雜交檢測使用中體會：(1)載玻片的選擇：使用手工染色檢測時建議使用陽離子載玻片。使用全自動Benchmark ULTRA平臺需選用儀器適配的基膜載玻片。(2)對照設(shè)置：在檢測過程中，建議每個待測樣本均設(shè)立陽性對照[1]。(3)切片厚度：推薦4 μm厚。切片過薄，手工檢測酶消化時間不容易把握、陽性信號強度較弱；切片過厚，細胞重疊不利于觀察，也更容易掉片。(4)結(jié)果判讀：手工檢測使用DAB顯色，蘇木精復(fù)染，形態(tài)結(jié)構(gòu)清晰，判讀容易；全自動檢測EBER陽性部位顯示為紫色(BCIP/NBT顯色)，背景染色為核固紅。核固紅在細胞中的著色較均勻一致，與組織形態(tài)對比度略顯不夠[2]。(5)樣本前處理：手術(shù)切除標本需在標本離體后30 min內(nèi)用4～10倍中性緩沖福爾馬林進行固定[3]；小組織樣本，如需當日進行脫水處理的小組織樣本，需保證至少固定6 h[4]。(6)操作步驟嚴格按照實驗室SOP進行，試劑盒說明書提供的相關(guān)流程僅作為實驗室相關(guān)SOP的參考。(7)胃蛋白酶消化：消化恰當與否需把握好2個關(guān)鍵點，①充分暴露靶核酸；②保留組織細胞輪廓。對細胞較為密集的淋巴結(jié)常選用20 min消化時間；對細胞相對疏松的鼻咽部活檢組織常選用10～15 min消化時間；對評分較低的樣本和玻片，常使用不超過10 min的酶消化處理。而全自動原位雜交EBER試劑盒染色暴露靶核酸的方式選用檸檬酸加熱，對組織細胞輪廓能很好的保留。(8)探針的類型和特點：全自動檢測試劑盒為寡核苷酸探針、手工試劑盒為DNA探針。DNA探針的特點是特異性高、形成的雜交體穩(wěn)定、不產(chǎn)生自身粘連，不需滅活RNA酶，但實驗全程需佩戴口罩、手套，寡核苷酸探針的特點是特異性高、雜交時間短、特異性和敏感性相對略低。(9)不同樣本類型建議選擇不同的適合的檢測方法。(10)全自動免疫組化檢測并不能完全替代手工檢測。