TRAP染色與免疫組化套染技術在骨組織損傷修復染色中的應用

李 麗，陳 菲，包春娟，周琪琪，包 驥

抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate-resistant acid phosphase, TRAP)是破骨細胞的特異性標志酶，TRAP染色顯示破骨細胞胞質中TRAP的活性，是破骨細胞的特異性染色[1]。本文首次采用TRAP染色與免疫組化套染技術，幫助研究者實現在同一張脫鈣骨組織石蠟切片上觀察破骨細胞與血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)共表達情況，該套染技術在國內外尚未見報道。脫鈣骨組織制片比軟組織制片過程繁瑣且易出現脫片、染色背景深等問題，作者經反復摸索優化實驗步驟，現將該套染技術介紹如下。

1 材料與方法

1.1 材料(1)樣本制片：兔股骨髁骨缺損處填充直徑為7 mm的羥基磷灰石生物材料，造模后于不同時間點取材，離體骨組織立即用10%中性緩沖福爾馬林固定，固定后用硬組織切片機將兔股骨切成3 mm厚薄片再繼續固定48 h，用改良EDTA脫鈣液脫鈣[2]，脫鈣液置于37 ℃水浴鍋，每2天更換1次脫鈣液。待骨組織脫鈣完全后行常規石蠟包埋，4 μm厚連續切片，其中1片行常規HE染色。(2)試劑：TRAP染色試劑盒購自德國Sigma-Aldrich(387A-1KT)；Rabbit anti-VEGF抗體(1 ∶100，Abcam公司，貨號ab28775)；抗體稀釋液(DAKO公司，貨號：S2022)；Wash Buffer(DAKO公司，貨號DM831)；免疫組化試劑盒REAL EnVision(DAKO公司，K5007)；蘇木精染液(Thermo公司，貨號7211)。(3)耗材：Super PAP Pen超級免疫組化油筆(福州邁新公司，貨號PEN-0002)。(4)大型設備：硬組織切片機(西安藍茗醫療科技公司)；全自動封片儀(Thermo，ClearVue)；WSI全數字切片掃描儀(3DHISTECH，Pannoramic SCAN)。

1.2 方法

1.2.1TRAP染色 (1)石蠟切片常規脫蠟至流水沖洗；(2)雙蒸水充分洗滌后，將裝有待染切片的雙蒸水染色盒放入37 ℃水浴鍋中靜置15 min；(3)按照TRAP染色試劑盒說明書配制TRAP孵育液，即用即配；(4)將待染切片放入37 ℃ TRAP孵育液內避光浸染60 min；(5)37 ℃雙蒸水快洗2次，每次5 s；(6)流水沖洗5 min，雙蒸水充分洗滌。

1.2.2免疫組化染色 實驗在TRAP的基礎上，再疊加免疫組化染色。(1)阻斷內源性過氧化物酶，1.5%H2O2(甲醇配制)室溫避光封閉10 min[3]；(2)流水沖洗5 min，蒸餾水充分洗滌后用免疫組化油筆在組織周圍畫圈，置入Wash Buffer液中洗滌3次，每次2 min；(3)滴加100 μL一抗VEGF工作液于組織上，4 ℃冰箱孵育過夜；(4)Wash Buffer洗滌3次后，滴加100 μL EnVision試劑盒中的A液，37 ℃孵育30 min；(5)Wash Buffer洗滌3次后DAB顯微鏡下控制顯色；(6)蘇木精復染，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，全自動封片儀封片，全數字切片掃描。

2 結果

大體可見兔股骨髁骨缺損處填充的生物材料與周圍宿主骨組織連接緊密，HE染色可見大量生物材料被吸收，其內散在炎細胞、破骨樣細胞浸潤，材料內可見較多新生骨組織形成(圖1)。TRAP單染可見兔股骨髁骨缺損處生物材料內散在細胞胞質暗紅色，細胞核藍色，胞體大，核數量不等的破骨細胞分布，其余細胞胞質不顯色，TRAP染色與VEGF免疫組化套染可見兔股骨髁骨缺損處生物材料內VEGF在新生骨組織細胞、部分破骨細胞、新生血管內皮及部分炎細胞胞質呈棕黃色表達，破骨細胞胞質暗紅色，胞核藍色，其余細胞胞核藍色、胞質不顯色且背景干凈(圖2)。

圖1 A.兔股骨髁骨缺損造模后大體所見，箭頭所示類圓形區域為股骨髁骨缺損處填充的生物活性材料；B.HE染色可見填充的生物材料與周圍宿主骨組織連成一片，生物材料被吸收，其內散在炎細胞、破骨樣細胞浸潤，生物材料內可見較多新生骨組織形成

圖2 A.兔股骨髁骨缺損處生物材料內可見細胞質暗紅色，細胞核為藍色，胞體大，核數量不等的破骨細胞散在分布，其余細胞質不顯色，TRAP單染；B.兔股骨髁骨缺損處生物材料內可見VEGF在新生骨組織細胞、部分破骨細胞、新生血管內皮及部分炎細胞胞質呈棕黃色陽性，破骨細胞胞質暗紅色，胞核藍色，其余細胞核藍色、胞質不顯色，背景干凈，TRAP+VEGF套染

3 討論

骨組織損傷修復基礎研究中，VEGF增強缺損處血管通透性，誘導新骨形成的同時也加速破骨細胞的骨吸收，促進骨愈合[4]。破骨細胞起源于造血干細胞，與執行骨形成功能的成骨細胞處于動態平衡。研究者試圖在同一張脫鈣骨組織石蠟切片上觀察破骨細胞與VEGF的共表達。本實驗采用TRAP染色與VEGF免疫組化套染技術，經反復實驗發現該套染技術成功需要注意以下幾方面。(1)骨組織離體后處理：骨組織離體后除立即使用10%中性緩沖福爾馬林固定外[5]，還使用硬組織切片機將骨組織修切成3 mm厚薄片，以便固定液充分滲透到骨組織內部得到最佳固定效果。骨組織比軟組織致密，若不切開固定，固定液滲透慢導致固定欠佳，導致不能較好地保存骨組織內部細胞形態結構、TRAP酶及抗原。固定不佳的組織后續脫水處理不佳，增加組織脫片的風險。本實驗脫鈣液選擇文獻報道的改良脫鈣液[2]，脫鈣和固定同時進行，脫鈣使用37 ℃水浴加快脫鈣速度，以保證在最短的時間內脫鈣完全。組織離體后進行該處理方法可大大降低脫片、TRAP酶及抗原丟失的風險。(2)TRAP染色：TRAP染液容易失效，每次實驗前待染切片置于37 ℃水浴鍋中靜置15 min時即可配制TRAP孵育液，現用現配。機體離體后應立即充分固定，盡量避免因操作不當造成TRAP酶丟失導致實驗出現假陰性。TRAP孵育液結束后用37 ℃雙蒸水沖洗2次，不容易出現脫片，且背景干凈無文獻里提到的顆粒沉淀[1]。為保證每張切片的染色質量，TRAP染色不建議使用滴染，本文連續切片行TRAP染色實驗中滴染的破骨細胞數少于浸染操作的破骨細胞數量，滴染破骨細胞胞質內暗紅色程度也較浸染弱。(3)VEGF免疫組化染色：本實驗采用EnVision非生物素檢測系統，能較好避免組織內源性生物素干擾導致的非特異背景表達。然而DAB顯色系統不可避免內源性過氧化物酶存在產生非特異背景表達。本實驗采用1.5%H2O2(甲醇配制)室溫避光封閉10 min，能避免脫片及降低非特異背景著色[3]。石蠟切片行免疫組化染色時，為最大程度暴露10%中性緩沖福爾馬林固定交聯的抗原表位，需采用最佳抗原修復條件[6]。本文采用胃酶、胰酶消化、檸檬酸水浴修復及不修復4種不同抗原修復方式，結果顯示不修復切片VEGF表達最強且背景最弱，脫片率最低。這與文獻報道的骨組織行免疫組化時如一抗選用多克隆抗體可以不經過抗原修復結果一致[7]。黃建平等[8]也報道對大多數抗原一般提倡抗原修復，但對于某些特殊抗原如HBcAg未修復的切片表達效果較好。

綜上所述，TRAP染色與VEGF免疫組化套染技術雖步驟較多，但操作簡便，染色效果較好，值得推廣。