原發(fā)性涎腺黏液表皮樣癌臨床病理特征及MAML2基因重排的意義

吳 鈴，王方平，張 敏，夏紅珍，吳 景，何 杰

黏液表皮樣癌(mucoepidermoid carcinoma, MEC)是涎腺最常見的惡性腫瘤，以兒童和年輕人最常見。最近研究表明，MEC一半以上存在t(11;19)(q21;p13)易位，該易位導(dǎo)致11號(hào)染色體Mastermind-like基因家族(MAML2)成員的第2～5號(hào)外顯子斷裂重排，并與19號(hào)染色體上的CRTC1外顯子1產(chǎn)生融合(CRTC1-MAML2)[1-2]。約5%的MEC存在t(11;15)(q21;q26)易位和該易位導(dǎo)致的CRTC3-MAML2基因融合[2]，在低級(jí)別或中級(jí)別MEC中該基因融合發(fā)生率高，而高級(jí)別MEC一般未見CRTC1/3-MAML2基因融合，少數(shù)病例可見EWSR1-POU5F1基因融合，且高級(jí)別MEC中存在多個(gè)基因失衡，導(dǎo)致頻繁復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移，預(yù)后不良[1-5]。有研究發(fā)現(xiàn)，MEC患者發(fā)生MAML2基因重排的生存率明顯高于未融合者[6-7]。MAML2基因重排的檢測(cè)還有助于MEC和Warthin瘤、腺鱗癌、透明細(xì)胞癌等進(jìn)行診斷、鑒別診斷。本文收集28例原發(fā)于涎腺的MEC，采用MAML2基因重排、免疫組化、特殊染色、HE染色等檢測(cè)方法，分析MEC分子遺傳學(xué)和臨床病理特征，為診斷和鑒別診斷及臨床生物學(xué)行為的判斷提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料收集2015年12月～2020年10月中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué)附屬第一醫(yī)院(安徽省立醫(yī)院)臨床病理中心及中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué)附屬第一醫(yī)院(安徽省腫瘤醫(yī)院)病理科手術(shù)切除的28例MEC的臨床病理資料。28例MEC患者男性10例，女性18例；均行腫瘤完整切除手術(shù)，其中12例術(shù)后行放療，2例伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移；患者年齡14～76歲，中位年齡50歲。發(fā)生于腮腺部位者13例，非腮腺部位者15例。按照AJCC第八版涎腺惡性腫瘤分期標(biāo)準(zhǔn)對(duì)原發(fā)性涎腺M(fèi)EC患者進(jìn)行臨床分期：Ⅰ～Ⅱ期 24例(86%)，Ⅲ～Ⅳ期4例(14%)。

1.2 方法標(biāo)本均經(jīng)10%中性福爾馬林固定，常規(guī)脫水、石蠟包埋，4 μm厚連續(xù)切片，行免疫組化EnVision兩步法染色。一抗CK7、p63、CK5/6、S-100、CD117和Ki-67，均為即用型抗體(北京中杉金橋公司)。在Ventana XT(羅氏公司)全自動(dòng)免疫組化儀中進(jìn)行操作，二抗及DAB顯色系統(tǒng)為儀器自帶封閉配套試劑。特殊染色AB/PAS試劑盒購自珠海貝索生物公司，具體操作步驟嚴(yán)格按試劑盒說明書進(jìn)行。MAML2基因斷裂探針試劑盒購自武漢康錄生物公司；顯微鏡下確認(rèn)腫瘤細(xì)胞，根據(jù)MAML2雙色斷裂探針試劑盒說明書進(jìn)行熒光原位雜交(fluorescence in situ hybridization， FISH)檢測(cè)。

1.3 病理分級(jí)根據(jù)WHO(2006)頭頸部腫瘤推薦的病理評(píng)分[8]標(biāo)準(zhǔn)對(duì)病例進(jìn)行組織學(xué)分級(jí)：囊性成分少于20%為2分；伴神經(jīng)侵犯為2分；伴壞死為3分；核分裂象≥4個(gè)/10 HPF為3分；退行性發(fā)育為4分。總分：0～4分為低級(jí)別，5～6分為中級(jí)別，≥7分為高級(jí)別。

1.4 結(jié)果判斷

1.4.1免疫組化判斷標(biāo)準(zhǔn) 腫瘤細(xì)胞標(biāo)記呈棕黃色為陽性，其中CK5/6、CK7、CD117、S-100陽性定位于細(xì)胞質(zhì)，p63和Ki-67陽性定位于細(xì)胞核。高倍鏡下隨機(jī)選取10個(gè)視野，按陽性細(xì)胞著色程度及所占百分比進(jìn)行結(jié)果判定。(1)按陽性細(xì)胞著色計(jì)分：不著色為0分，弱著色或淡黃色為1分，中等著色或棕黃色為2分，強(qiáng)著色或棕褐色為3分。(2)按陽性細(xì)胞百分比計(jì)分：陽性細(xì)胞<25%為1分，25%～50%為2分，51%～75%為3分，>75%為4分。兩項(xiàng)得分相加：0～4分為陰性，>4分為陽性。特殊染色AB/PAS的判讀標(biāo)準(zhǔn)：腫瘤細(xì)胞胞質(zhì)染色呈藍(lán)色及紅色均為陽性。

1.4.2FISH判斷標(biāo)準(zhǔn) 在1 000×油鏡下計(jì)數(shù)腫瘤細(xì)胞核內(nèi)熒光信號(hào)，正常細(xì)胞為綠色和紅色融合呈黃色，MAML2斷裂分離的細(xì)胞呈紅色信號(hào)與綠色信號(hào)分離，或者單獨(dú)出現(xiàn)紅色信號(hào)。每例至少計(jì)數(shù)100個(gè)腫瘤細(xì)胞核中的信號(hào)，紅、綠信號(hào)分離超過2個(gè)信號(hào)長(zhǎng)度為異常信號(hào)，當(dāng)異常信號(hào)的細(xì)胞數(shù)>20%則判讀為陽性。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)數(shù)資料比較采用Pearson χ2檢驗(yàn)和Fisher精確概率法。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 眼觀腫瘤多為實(shí)性不規(guī)則結(jié)節(jié)，直徑0.5～8.0 cm，腫瘤切面呈灰白色、灰褐色，質(zhì)地較軟，常伴囊性變，囊內(nèi)含黏稠的膠凍樣物。

2.2 鏡檢MEC是由黏液細(xì)胞、中間型細(xì)胞和表皮樣細(xì)胞構(gòu)成，并以不同比例混合，可見3種腫瘤細(xì)胞之間相互移行過渡。本組結(jié)果顯示：17例為低級(jí)別MEC，表皮樣細(xì)胞分化較好，中間型細(xì)胞偏少，黏液細(xì)胞較常見(圖1)，核分裂象、壞死較少見。其中有1例為Warthin瘤樣變異型，與Warthin瘤相似，鏡下見腫瘤由多個(gè)腺樣乳頭狀結(jié)構(gòu)構(gòu)成，內(nèi)層為柱狀嗜酸性細(xì)胞，部分區(qū)域可由多層上皮構(gòu)成，周圍環(huán)繞具有生發(fā)中心的淋巴樣組織，可見散在分布的黏液細(xì)胞(圖2)；5例為中級(jí)別MEC，有1例為透明細(xì)胞變異型，腫瘤為胞質(zhì)透明的多邊形細(xì)胞，可見少量黏液細(xì)胞(圖3)；6例為高級(jí)別MEC表皮樣細(xì)胞及中間型細(xì)胞較多見，黏液細(xì)胞少見，細(xì)胞中-重度異型，呈彌漫實(shí)性巢團(tuán)狀(圖4)，核分裂象、壞死易見，周圍可見典型的低級(jí)別或中級(jí)別MEC區(qū)域。

圖1 低級(jí)別MEC：表皮樣細(xì)胞分化較好，中間型細(xì)胞偏少，黏液細(xì)胞較常見 圖2 Warthin瘤樣MEC：類似于Warthin瘤，內(nèi)層為柱狀嗜酸性細(xì)胞，周圍環(huán)繞著具有生發(fā)中心的淋巴樣組織，可見散在分布的黏液細(xì)胞 圖3 透明細(xì)胞變異型MEC：胞質(zhì)透明的多邊形細(xì)胞，可見少量黏液細(xì)胞(箭頭) 圖4 高級(jí)別MEC可見少量黏液細(xì)胞(箭頭)，表皮樣細(xì)胞及中間型細(xì)胞多見，呈彌漫實(shí)性巢、團(tuán)狀 圖5 腔面內(nèi)層上皮中CK7呈彌漫強(qiáng)陽性，EnVision兩步法 圖6 外圍基底細(xì)胞p63呈陽性，EnVision兩步法 圖7 AB/PAS呈陽性，特殊染色 圖8 MAML2基因重排陽性：出現(xiàn)紅色與綠色信號(hào)的分離，F(xiàn)ISH法 圖9 MAML2基因重排陰性：紅色與綠色信號(hào)融合呈黃色，F(xiàn)ISH法

2.3 免疫組化及特殊染色上皮樣細(xì)胞CK7(圖5)、p63(圖6)、CK5/6均陽性，S-100、CD117均陰性，Ki-67增殖指數(shù)低(27例為2%～10%，1例約60%)。28例MEC均可見AB/PAS陽性的黏液細(xì)胞(圖7)。

2.4 FISH檢測(cè)28例MEC中17例檢測(cè)出MAML2基因重排(圖8)，11例檢測(cè)陰性(圖9)，檢出率為60.7%(17/28)。17例MAML2基因重排中有14例低級(jí)別、3例中級(jí)別MEC，其中包含Warthin瘤樣變異型和透明細(xì)胞變異型。另外，3例低級(jí)別、2例中級(jí)別及6例高級(jí)別MEC中，均未檢測(cè)出MAML2基因重排。

2.5 涎腺M(fèi)EC中MAML2基因重排與臨床病理特征的關(guān)系MAML2基因重排與腫瘤部位相關(guān)，以腮腺部位陽性率最高(46.4%，13/28)，而非腮腺部位陽性率最低(21.4%，6/28)，兩者差異有顯著性(P<0.05)。本組結(jié)果顯示：MAML2基因重排與病理分級(jí)相關(guān)，級(jí)別越低MAML2基因重排陽性率越高，兩者差異有顯著性(P<0.05)；MAML2基因重排與患者年齡、性別、腫瘤最大徑、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及臨床分期無相關(guān)性(P>0.05，表1)。

表1 涎腺M(fèi)EC中MAML2基因重排與臨床病理特征的關(guān)系

2.6 隨訪28例患者隨訪時(shí)間為2～60個(gè)月，有27例患者存活，包含1例術(shù)后復(fù)發(fā)，1例骨轉(zhuǎn)移患者；1例患者因腫瘤轉(zhuǎn)移死亡。存活的27例患者中16例檢出MAML2基因重排，其中術(shù)后復(fù)發(fā)者也為陽性，11例陰性包括1例骨轉(zhuǎn)移者。

3 討論

3.1 臨床病理特征MEC是兒童和年輕人最常見的原發(fā)性涎腺惡性腫瘤，患者平均發(fā)病年齡約45歲，腫瘤約一半發(fā)生在大涎腺(腮腺約占45%)，少數(shù)腫瘤位于小涎腺或鼻腔等部位，口腔內(nèi)最常見的發(fā)病部位是腭和頰黏膜。MEC常見的臨床癥狀多表現(xiàn)為實(shí)性、固定的無痛性腫塊，還可以出現(xiàn)面神經(jīng)麻痹、感覺異常、吞咽困難等癥狀。

盡管大多數(shù)涎腺原發(fā)的MEC在組織學(xué)上可以直接做出診斷，但其罕見的變異易引起誤、漏診，F(xiàn)ujimaki等[9]首次檢測(cè)CRTC1-MAML2融合基因，確診了嗜酸細(xì)胞變異型MEC。新近研究發(fā)現(xiàn)[10-11]，MEC還可出現(xiàn)纖毛變異型和Warthin瘤樣變異型，F(xiàn)ISH均檢測(cè)出MAML2基因重排，而114例經(jīng)典的Warthin瘤均未檢測(cè)出MAML2基因重排。本組28例MEC中也發(fā)現(xiàn)1例Warthin瘤樣組織學(xué)形態(tài)、MAML2基因重排，支持變異型MEC的診斷。本組還發(fā)現(xiàn)1例透明細(xì)胞變異型也檢出MAML2基因重排，說明MAML2基因重排對(duì)MEC的診斷具有特異性。因此對(duì)于難以確診的病例，行FISH檢測(cè)MAML2基因重排有助于輔助診斷MEC的變異型。

目前大多數(shù)文獻(xiàn)報(bào)道[1,4,7]MAML2基因重排在低級(jí)別MEC中發(fā)生率較高，概率為64.0%。本組MAML2基因重排在涎腺M(fèi)EC的檢出率為60.7%，MAML2基因重排與病理分級(jí)相關(guān)，級(jí)別越低MAML2基因重排陽性率越高。MAML2基因重排陽性與腫瘤部位相關(guān)，腮腺部位陽性率高，而非腮腺部位陽性率低。

3.2 分子遺傳學(xué)特征染色體t(11;19)(q12;p13)易位重排是MEC特有的分子遺傳學(xué)改變，該易位導(dǎo)致11號(hào)染色體上MAML2基因斷裂重排，并與19號(hào)染色體上的CRTC1基因融合[1,12-13]。目前多數(shù)文獻(xiàn)報(bào)道[1,4-7,9-12,14]通過FISH檢測(cè)MAML2基因重排和實(shí)時(shí)熒光聚合酶鏈反應(yīng)(real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction,qRT-PCR)法檢測(cè)CRTC1/MAML2融合基因，兩者的檢測(cè)結(jié)果一致性較好[7,12]。MAML2基因重排陽性的MEC患者與陰性病例相比，表現(xiàn)出良好的臨床病理特征：如患者年齡較輕、腫瘤較小，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移頻率、臨床分期、組織學(xué)分級(jí)均較低，總生存期和無瘤生存期長(zhǎng)[14]。

3.3 診斷及鑒別診斷大多數(shù)涎腺原發(fā)的MEC可以依據(jù)腫瘤的病理形態(tài)學(xué)特點(diǎn)和特征性的MAML2基因重排做出明確診斷，由于高級(jí)別MEC和一些罕見的變異型MEC與其他涎腺腫瘤在形態(tài)學(xué)上鑒別較困難，需與以下疾病進(jìn)行鑒別。(1)腺鱗癌：分化程度較低，腫瘤細(xì)胞的異型性及多形性顯著，核分裂象多見；MEC多數(shù)分化比較好，以表皮樣細(xì)胞為主，其間可見少量黏液細(xì)胞，核分裂象一般少見。(2)非特異性透明細(xì)胞癌：特征是由單一的多邊形細(xì)胞組成，且細(xì)胞質(zhì)透明，一般無黏液細(xì)胞，腫瘤細(xì)胞PAS染色陽性，而AB染色陰性。文獻(xiàn)報(bào)道透明細(xì)胞癌分子檢測(cè)顯示EWSR1-ATF1或EWSR1-CREM基因融合[15-16]，而透明細(xì)胞變異型MEC可見少量黏液細(xì)胞，AB染色陽性，本組1例透明細(xì)胞變異型MEC中MAML2基因重排檢測(cè)陽性。(3)Warthin瘤伴囊性變及黏液細(xì)胞化生：Warthin瘤內(nèi)層的上皮常發(fā)生黏液化生，但無細(xì)胞學(xué)上的異型性或侵襲性生長(zhǎng)模式。相反，Warthin瘤樣MEC無典型Warthin瘤的雙層上皮，腫瘤細(xì)胞與典型的Warthin瘤中高柱狀嗜酸性細(xì)胞相比，其矮而少[10]。文獻(xiàn)報(bào)道，典型的Warthin瘤雙層結(jié)構(gòu)中管腔面內(nèi)層上皮表達(dá)CK7，外圍基底細(xì)胞表達(dá)p63。Warthin瘤樣MEC的中間型細(xì)胞及表皮樣則顯示全層彌漫表達(dá)p63、CK5/6和CK7。FISH檢測(cè)MAML2基因重排陽性可有助于診斷Warthin瘤樣MEC[17-18]。

3.4 治療與預(yù)后目前，手術(shù)切除仍是涎腺M(fèi)EC的首選治療方法，而術(shù)后放療則主要用于高級(jí)別、晚期、不可切除和復(fù)發(fā)的MEC患者。近年文獻(xiàn)報(bào)道，MEC的5、10年總生存率分別為83.1%和73.6%[19]。本組28例MEC均行腫瘤完整切除，有1例術(shù)后復(fù)發(fā)，1例骨轉(zhuǎn)移，1例死亡，整體預(yù)后較好。MAML2基因重排的相關(guān)機(jī)制還需積累更多病例進(jìn)行分析，尋找潛在的治療靶點(diǎn)，為MEC的治療提供新方向。