乳腺癌中肽轉運蛋白1的表達及臨床病理意義

王志皓，盛有璟，彭煒東，吳 強，

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤，也是全球女性癌癥死亡的主要原因。截至2020年，全球乳腺癌新發病例230萬，占女性新發惡性腫瘤的11.7%，其死亡人數占女性死亡病例的6.9%[1]。乳腺癌根據受體類型不同分為四種亞型：Luminal A型、Luminal B型、HER-2過表達型和三陰型乳腺癌(triple negative breast cancer, TNBC)[2]。非三陰型乳腺癌(non-triple negative breast cancer, non-TNBC)的治療方法以內分泌治療或抗HER-2靶向治療為主，再輔以化療，患者預后良好。TNBC是一組ER、PR及HER-2均為陰性的乳腺癌，與non-TNBC相比，其發病年齡早，復發率較高[3-5]。目前，TNBC由于缺乏藥物靶向受體，治療效果不甚理想，國際推薦全身化療為首選治療方案[6]。根據TNBC分子亞型的不同，化療方案的組合繁多，預后差異較大[7-10]。因此，探索預測乳腺癌治療的生物學標志物，對乳腺癌特別是TNBC有重要意義。肽轉運蛋白1(peptide transporter 1，PEPT1)屬于跨膜轉運蛋白，最早被發現在小腸黏膜組織中高表達，其介導寡肽吸收并可促進藥物吸收[11]。近年，PEPT1在消化、呼吸和泌尿系統腫瘤中的表達及作用受到關注[12-15]，但在乳腺癌中的表達及其與患者預后的相關性未見報道。本文采用免疫組化MaxVision法檢測乳腺癌中PEPT1的表達，探討其與乳腺癌臨床病理特征及預后的關系，為預測臨床療效提供新思路。

1 材料與方法

1.1 臨床資料收集2014～2018年安徽醫科大學第一附屬醫院病理科存檔的80例女性乳腺浸潤性導管癌手術組織蠟塊、40例癌旁正常乳腺手術組織蠟塊，術前均未進行放、化療。患者中位年齡50.0歲(31～80歲)；腫瘤中位直徑3.0 cm(0.5～7.0 cm)。根據WHO(2019)乳腺腫瘤分類標準進行病理學分類、分級[16]，其中Ⅰ級16例、Ⅱ級35例、Ⅲ級29例。根據第八版美國癌癥聯合會(the American Joint Committee on Cancer, AJCC)TNM分期標準進行分期[17]，所有病理切片均經兩位主治及以上病理醫師共同閱片，ER、PR、HER-2及Ki-76的數據均來源于既往病理學報告的復核數據。術后根據分子亞型接受不同方案的全身系統性治療：Luminal型內分泌治療+化療，HER-2過表達型靶向抗HER-2+化療，TNBC僅化療。術后隨訪6～80個月，患者有復發、遠處轉移、死亡或失聯時截止。

1.2 主要試劑兔抗人Anti-SLC15A1/PEPT1多克隆抗體(克隆號：ab78020)，購自Abcam公司。酶標山羊抗小鼠/抗兔IgG聚合物(通用型)、PBS磷酸緩沖鹽粉末、檸檬酸鈉緩沖液粉末、內源性過氧化物酶阻斷劑及DAB顯色液，均購自福州邁新公司。

1.3 方法

1.3.1生物信息學數據分析 登錄TIMER 2.0數據庫(http://timer.comp-genomics.org/)，檢索PEPT1 mRNA在乳腺癌和正常乳腺組織中的相對表達量。登錄Kaplan-Meier Plotter數據庫(https://kmplot.com/analysis/index.php?p=background)，分析 PEPT1 mRNA表達與乳腺癌患者預后的相關性。

1.3.2免疫組化 采用免疫組化MaxVision法染色檢測PEPT1的表達。切片經脫蠟、抗原修復后，4 ℃過夜孵育一抗，孵育二抗后DAB顯色，蘇木精復染后，脫水，透明，封固。

1.4 結果判讀本實驗采用半定量法進行判斷，PEPT1以棕黃、棕褐染色顆粒定位于細胞膜為陽性。(1)根據細胞著色強度計分：無著色為0分，淺黃色為1分，淺棕色為2分，棕褐色為3分。(2)根據陽性細胞百分比計分：無陽性細胞為0分，1%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，76%～100%為4分。將兩項得分結果相乘：0～2分為不表達，3～5分為低表達，6分及以上為高表達。

1.5 統計學分析采用Graphpad Prism 8.3.0軟件進行統計學分析，樣本率組間比較采用χ2檢驗，Fisher精確檢驗。應用Spearman等級相關檢驗分析相關性，采用Kaplan-Meier進行生存分析。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 TIMER 2.0數據庫PEPT1 mRNA在正常乳腺組織和乳腺癌不同分子亞型中的表達采用TIMER 2.0數據庫，分析1 093例浸潤性乳腺癌和112例正常乳腺組織中PEPT1 mRNA的相對表達量。結果顯示：PEPT1 mRNA在正常乳腺和乳腺癌組織中的表達差異有顯著性(P<0.001)；在Luminal A、Luminal B型乳腺癌中稍低于正常乳腺組織。PEPT1 mRNA在HER-2過表達型、TNBC中明顯高于正常乳腺組織，TNBC的PEPT1相對表達量在乳腺癌的四種分型中最高(圖1)。

圖1 PEPT1 mRNA在正常乳腺組織和乳腺癌四種分子亞型中的表達

2.2 Kaplan-Meier Plotter數據庫中PEPT1的表達與乳腺癌預后的關系利用Kaplan-Meier Plotter數據庫分析PEPT1表達與乳腺癌四種亞型患者預后的關系。結果顯示：Luminal A、Luminal B型及TNBC中PEPT1高表達，患者20年無復發生存期(relapse-free survival, RFS)明顯高于低表達者(HR=0.7，95%CI0.59～0.83vsHR=0.65，95%CI0.52～0.8vsHR=0.73，95%CI0.58～0.91)；HER-2過表達型PEPT1表達與20年RFS無明顯相關性(圖2)。

圖2 PEPT1的表達與乳腺癌四種亞型患者RFS的關系：A.Luminal A型；B.Luminal B型；C.HER-2型；D.TNBC

2.3 乳腺癌及癌旁正常組織中PEPT1的表達本組采用免疫組化MaxVison法對80例乳腺浸潤性導管癌石蠟包埋組織和40例癌旁正常組織進行PEPT1蛋白檢測。PEPT1陽性染色顆粒主要定位于癌細胞及少數乳腺上皮細胞，37例細胞核呈彌漫陽性，其中4例同時可見胞質弱陽性。45例癌旁組織中4例高表達，占8.9%；80例乳腺癌患者中33例PEPT1高表達，占41.2%。乳腺癌中PEPT1高表達顯著升高(P<0.000 1，表1，圖3)。乳腺癌四種分子亞型中PEPT1的高表達占比存在明顯差異，TNBC(65.7%)明顯高于non-TNBC(22.2%)(表2)。

圖3 癌旁正常組織、乳腺癌組織中PEPT1 的表達，MaxVision法：A.癌旁正常組織中PEPT1呈陰性；B.部分乳腺癌組織中PEPT1呈胞核彌漫陽性；C.部分乳腺癌組織中PEPT1呈陰性

表1 癌旁正常組織和乳腺癌組織中PEPT1的表達[n (%)]

表2 PEPT1的表達與乳腺癌分子分型的相關性

2.4 乳腺癌中PEPT1表達與臨床病理特征的關系本組結果顯示：PEPT1高表達與患者淋巴結轉移(P<0.001)及遠處轉移(P=0.03)呈負相關。PEPT1高表達與患者年齡、腫瘤直徑、組織學分級及ER、PR、HER-2表達、Ki-67增殖指數均無相關性(P>0.05，表3)。

表3 乳腺癌中PEPT1表達與臨床病理特征的關系[n (%)]

2.5 PEPT1表達與乳腺癌不同分子亞型患者預后的關系本組80例乳腺癌患者中發生遠處轉移、復發或死亡的患者合計34例，占42.5%。Kaplan-Meier生存曲線分析顯示，PEPT1高表達與術后化療的TNBC患者3年無進展生存期(progression free survival，PFS)呈顯著的正相關(P<0.01，圖4)。PEPT1的高表達，與Luminal A、Luminal B型和HER-2過表達型患者3年PFS無明顯相關性(P>0.05)。

圖4 TNBC患者PEPT1高表達與術后化療后PFS的相關性：A.Kaplan-Meier生存分析；B.直方圖

3 討論

PEPT1屬于跨膜轉運蛋白，是細胞吸收蛋白質等營養物質的重要介質[11]。近年，PEPT1在不同腫瘤中的表達及作用被相繼報道。有學者發現PEPT1在前列腺癌、膀胱癌、胃癌和肝癌細胞中表達增多[12-15]，推測其表達增加可能與腫瘤細胞高代謝特性有相關性。Gong等[15]利用肝癌細胞PEPT1高表達的特性，把PEPT1作為藥物轉運載體，將阿霉素靶向傳遞至肝癌細胞內，增加其抗腫瘤效果。Huo等[18]報道前列腺癌細胞系PC3和腦膠質細胞瘤細胞系U118中，PEPT1可轉運褪黑激素到腫瘤細胞的線粒體內，促進腫瘤細胞凋亡，提示PEPT1可提高褪黑素的療效。我們利用TIMER 2.0數據庫，發現正常乳腺組織和乳腺癌不同亞型的PEPT1表達量具有差異性，TNBC中PEPT1表達量明顯高于non-TNBC和正常乳腺組織。PEPT1在Luminal型乳腺癌中和正常乳腺組織表達量差值較少，推測可能由于Luminal型乳腺癌生物學行為較為惰性，腫瘤在某些代謝水平可能與正常細胞相近，故PEPT1表達量較為接近，本研究后續將設計實驗探究兩者的詳細機制。本組采用免疫組化MaxVision法檢測80例乳腺癌患者中PEPT1的表達，結果發現TNBC中PEPT1高表達者占65.7%，明顯高于癌旁正常組織(8.9%)和non-TNBC(22.2%)。PEPT1的高表達與乳腺癌患者的淋巴結轉移和遠處轉移呈負相關(P均<0.05)；與患者年齡、腫瘤直徑、組織學分級及ER、PR、HER-2表達、Ki-67增殖指數均無顯著相關性(P>0.05)。本組結果提示，PEPT1在乳腺癌和癌旁正常組織中表達差異，可能與乳腺癌的進展相關。

目前，PEPT1表達與乳腺癌患者預后生存的關系尚未見報道。本組結合免疫組化檢測和隨訪結果發現，PEPT1高表達的TNBC患者術后化療效果較好，≥3年PFS患者的PEPT1高表達組高于不表達+低表達組(67%vs40%)。PEPT1高表達與患者3年PFS有顯著相關性(P<0.01)，提示PEPT1的表達與TNBC患者預后相關，且PEPT1高表達者的預后優于不表達+低表達者。本實驗結果與Kaplan-Meier Plotter數據庫的分析結果一致。數據庫分析表明PEPT1高表達的Luminal型乳腺癌20年RFS更佳，本組隨訪結果顯示其與患者3年PFS無相關性，可能與Luminal型預后佳、生存期長且PEPT1高表達占比低有關。因此，需進一步隨訪并積累更多該分子亞型病例加以驗證。

本組發現PEPT1高表達與乳腺癌不同分子亞型患者預后的關系不一致，其是否與不同分子亞型全身治療方案的差異有關還需進一步分析。2019年第16屆圣加侖國際乳腺癌大會指出：依據乳腺癌分子亞型制定針對性治療方案，可顯著改善乳腺癌患者的預后[19]。對激素受體陽性乳腺癌患者采用內分泌治療即可獲得較為良好的預后，僅少部分患者可從增加化療中獲益[20-22]。HER-2靶向抗體特異性作用于腫瘤細胞表面HER-2受體，極大改善了HER-2過表達患者的預后[19]。化療作為經典的系統治療手段，可見于大部分的乳腺癌治療方案中，也是TNBC唯一療效明顯的全身治療方法[6]。多項研究評估乳腺癌不同分子亞型的化療療效，雖然TNBC單純化療的療效較為有限，但是對純化療的敏感性比non-TNBC稍高[23-25]。Prat等[26]評估451例新輔助化療乳腺癌患者的病理完全緩解(pathologic complete response，pCR)率，結果顯示Luminal A、Luminal B型、HER-2過表達型和TNBC中pCR率分別為5%、15%、16%和36%，差異有統計學意義。Prat等[25]還分析180例接受新輔助化療乳腺癌患者的穿刺活檢病理報告，結果發現Luminal A、Luminal B型、HER-2過表達型和TNBC殘余腫瘤負荷(residual cancer burden, RCB)評級為0/1的占比分別為9.3%、20.0%、14.3%和50.0%。兩項研究結果均顯示TNBC比non-TNBC對化療藥物有更好療效。本實驗通過數據庫及免疫組化檢測不同亞型乳腺癌中PEPT1的表達，結果顯示：TNBC中PEPT1高表達者高于non-TNBC，且TNBC中高表達PEPT1患者術后化療明顯優于不表達+低表達者。因此，我們推測PEPT1的表達可能與TNBC化療療效有關，其高表達與化療效果的相關性可作為后續分析的重點。

綜上所述，本組首次探討PEPT1在乳腺癌不同分子亞型中的表達差異，結果表明PEPT1高表達與TNBC患者化療預后關系密切，有望成為預測TNBC患者療效的新生物學指標。