一株豬A型多殺性巴氏桿菌的分離鑒定及藥敏試驗

李天芝，于新友

（山東綠都生物科技有限公司，山東 濱州 256600）

多殺性巴氏桿菌（Pasteurella multocida,Pm）是巴氏桿菌科巴氏桿菌屬細菌，可感染豬、牛、羊、兔、雞等多種動物和人，是一種重要的人獸共患病原菌[1]。Pm可在健康動物上呼吸道定植，是一種條件性致病菌，分為A、B、D、E和F等5個血清型[2]。目前報道除E型外，其余血清型均可感染豬后引起豬巴氏桿菌病（即豬肺疫）[3]。豬巴氏桿菌病臨床表現主要為敗血癥、肺炎、萎縮性鼻炎等，該病廣泛存在于世界各地，隨著我國禁抗時代的來臨，該病呈高發態勢，給養豬業造成了巨大的經濟損失[4]。

2020年11月東營某豬場豬精神沉郁，采食量減少，體溫升高，口鼻有白色泡沫流出，個別豬只呈犬坐姿勢，呼吸極度困難，嚴重者死亡，剖檢可見死豬氣管內充滿泡沫，肺出血、間質增寬、水腫。本試驗無菌采集病死豬肝臟、肺臟等樣品，進行細菌分離、形態學觀察、生化試驗、藥敏試驗、致病性試驗及PCR鑒定，現報告如下。

1 材料

1.1 病料

對東營某豬場疑似巴氏桿菌病死豬剖檢，無菌采取肝臟、肺臟等。

1.2 試驗動物

10只16～20 g昆明小白鼠購自山東省實驗動物中心。

1.3 試劑

普通瓊脂平板、含5%血清的TSA瓊脂平板、TSB液體培養基、革蘭氏染色液如草酸銨結晶紫、革蘭氏碘液、石炭酸復紅染液等均由山東綠都生物科技有限公司質量監察部提供；糖發酵管及生化反應試劑和藥敏紙片購自杭州天和微生物試劑有限公司；PCR反應試劑Taq酶、10×PCR Buffer、DL 2 000 DNA Marker、瓊脂糖DNA凝膠純化回收試劑盒、質粒小量提取試劑盒等購自百泰克生物科技有限公司；pMD18-T載體購自大連寶生物公司。

1.4 PCR引物設計

參照文獻[5]設計巴氏桿菌PCR鑒定和分型引物，鑒定引物為巴氏桿菌通用引物，擴增基因片段大小為457 bp，分型引物用于擴增A、B、D、E、F等不同巴氏桿菌血清型，擴增目的基因片段長度分別為1 048 bp、758 bp、647 bp、512 bp和852 bp。引物由通用生物系統（安徽）有限公司合成。

2 方法

2.1 直接涂片鏡檢

無菌采取病死豬肝臟、肺臟，玻片直接觸片，干燥，固定后，革蘭氏染色，顯微鏡鏡檢觀察。

2.2 細菌分離培養

將采集的豬心血、肝臟、脾臟無菌劃線接種于血液瓊脂平板，37 ℃培養24 h，觀察生長情況，對可疑菌落進行涂片，革蘭氏染色鏡檢[5]。挑取單個可疑菌落接種于麥康凱營養瓊脂培養基上，37 ℃培養24 h。

2.3 生化鑒定

分離菌經含5%血清的TSA瓊脂平板純培養24 h后，進行糖發酵試驗及其他生化試驗。

2.4 藥敏試驗

藥敏試驗采用紙片瓊脂擴散法，將分離菌純化后，接種TSB液體培養基進行純培養，進行適當稀釋后，無菌棉簽均勻涂布在TSA培養基上，用鑷子夾取藥敏紙片放置在平板上，保持紙片間適度距離，每個平板上最好不超過6張藥敏紙片。將平板置于37 ℃恒溫培養箱中培養24 h后，觀察結果，測量并記錄抑菌圈直徑。

2.5 致病性試驗

10只昆明小鼠，隨機分為兩組，試驗組和對照組，每組5只。吸取細菌純培養液，腹腔注射試驗組小鼠0.2 mL/只 （菌體含量6×109CFU/mL），5只對照組小鼠分別腹腔注射0.2 mL TSB液體培養基作對照。注射后隔離飼養，定期觀察小鼠狀態，并記錄觀察結果。

2.6 PCR鑒定及分型

挑取TSA瓊脂平板上分離菌單菌落，接種于含5%血清的TSB液體培養基中，37 ℃培養箱，200 r/min，振蕩培養24 h，提取細菌基因組DNA作模板，分別進行PCR擴增鑒定及分型檢測。反應體系（25 μL）：10×Buffer（含MgCl2）2μL，上、下游引物各1 μL（10 pmol/L）。dNTP 2 μL，Tag DNA聚合酶0.2 μL，模板1 μL，加水補足至20 μL。擴增反應程序：94 ℃ 3 min；95 ℃ 30 s，55 ℃ 45 s，72 ℃ 50 s，30個循環：72 ℃ 10 min。取2 μL PCR產物，1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測。將PCR產物純化回收后，連到pMD18-T載體，轉化感受態大腸桿菌DH5a，挑單菌落，搖床培養過夜，提取質粒，并初步鑒定正確后，送生工生物工程（青島）股份有限公司測序。

3 結果與分析

3.1 直接涂片鏡檢

肝臟、脾臟觸片后革蘭氏染色后鏡檢，可見單個、散在的紅色短桿狀細菌，符合巴氏桿菌特性。

3.2 細菌分離培養

普通瓊脂平板上無細菌生長，在鮮血瓊脂平板上37 ℃培養24 h后，可見灰白色、半透明、露珠樣、光滑圓潤、邊緣整齊菌液。挑取單個菌落涂片進行革蘭氏染色，鏡檢為革蘭氏陰性、兩端鈍圓、中間微凸，單個存在、散在排列的短小桿菌。在普通瓊脂平板培養基上無細菌生長。

3.3 生化試驗

結果見表1，所分離巴氏桿菌不能發酵水楊苷、肌醇、鼠李糖、衛矛醇、麥芽糖、菊糖、棉籽糖、乳糖，能發酵葡萄糖、纖維二塘、蔗糖、木糖、果糖、半乳糖、海藻糖、山梨醇， V-P試驗陰性，靛基質試驗陽性，與巴氏桿菌的生化特征一致。

表1 分離菌的生化反應結果

3.4 藥物敏感性試驗

由表2可知，分離菌對頭孢噻呋、恩諾沙星、氟苯尼考高度敏感，對環丙沙星、阿米卡星、磷霉素、慶大霉素、氨芐西林中度敏感，對阿奇霉素、大觀霉素、強力霉素、四環素、卡那霉素、林可霉素耐藥。

表2 分離菌株的藥物敏感性試驗結果 mm

3.5 致病性試驗

小鼠注射分離菌液4 h后，采食減少，不愛運動，呼吸急促，16 h后被毛粗亂，眼瞼水腫、四肢發紺、對外界刺激反應遲鈍，24 h后開始出現死亡，72 h內試驗組小鼠全部死亡。剖檢可見小鼠肝臟有白色壞死點、肺臟出血、脾臟腫大、出血，腸道出血。取肝臟組織觸片，革蘭氏染色鏡檢，可見呈革蘭氏染色陰性的紅色短小桿菌。對照組小白鼠全部健活。

3.6 PCR鑒定及分型

采用巴氏桿菌通用引物對分離菌進行PCR檢測，結果顯示，在457 bp位置有特異性目的條帶，說明分離菌為巴氏桿菌。隨后采用5對分型引物進行PCR檢測，結果顯示A型引物產物在1 048 bp出現特異性條帶，其余均無目的條帶，初步說明分離菌為A型巴氏桿菌。

3.7 基因克隆的測序分析

為進一步確認，將擴增的1 048 bp基因條帶切膠回收，純化后，連pMD18-T載體，轉化DH5a感受態大腸桿菌，采用PCR方法篩選陽性克隆，將含有插入片段的陽性質粒送去測序。將測得序列與GenBank中收錄的巴氏桿菌的進行同源性比較，結果顯示，分離菌與巴氏桿菌A型序列同源性為100%。

4 討論

豬巴氏桿菌病是豬的一種重要的細菌性傳染病，呈散發和地方流行性，無明顯季節性，當天氣劇變、飼養條件改變、長途運輸或豬群遭受其他應激因素影響時，或豬群抵抗力降低時容易誘發。豬巴氏桿菌病主要應以預防為主，加強飼養管理，飼喂優質全價配合飼料，飲用清潔水，提供適宜的溫度和濕度，做好通風換氣，較少豬群應激，做好其他常規疾病的免疫預防工作，也可以接種豬巴氏桿菌疫苗進行預防。發病后可用抗生素治療，隨細菌耐藥性的增加，有時盲目用藥，往往治療效果不理想，需要借助實驗室手段，提高豬群治療效果。

本試驗對東營某豬場死亡豬只送檢病料進行細菌分離、鑒定，血清型鑒別，藥敏試驗和小鼠致病性試驗。結果表明，所分離的A型巴氏桿菌，PCR血清分型方法的應用大幅縮短了巴氏桿菌血清分型鑒定時間，為進一步驗證，測定相關基因序列，并比對分析，符合率為100%，為今后豬巴氏桿菌快速分型鑒定提供了可靠依據。生化試驗結果表明，該分離菌生化特征與巴氏桿菌一致，不能發酵水楊苷、肌醇、鼠李糖、衛矛醇、麥芽糖、菊糖、棉籽糖、乳糖，能發酵葡萄糖、纖維二塘、蔗糖、木糖、果糖、半乳糖、海藻糖、山梨醇，V-P試驗陰性，靛基質試驗陽性。藥敏試驗結果表明，該分離株對頭孢噻呋、恩諾沙星、氟苯尼考高度敏感，對阿奇霉素、大觀霉素、強力霉素、四環素、卡那霉素、林可霉素耐藥。建議豬場發生巴氏桿菌病后，分離病原菌，進行藥敏試驗，篩選有效藥物，進行聯合用藥，或輪換和穿插用藥，提高治療效果，防止盲目用藥及重復用藥耐藥性的產生，達到事半功倍的功效。致病性試驗表明，分離菌可致小鼠發病，出現明顯癥狀，最終導致試驗組小鼠全部死亡，該分離菌具有較強毒力，為豬場自家苗研制奠定了基礎。