正交試驗優選制洋金花的炮制工藝研究

夏永嚴 李 婭 秦昆明,3 楊 超 蔡寶昌,3, 金俊杰,3*

1.蘇州大學附屬張家港醫院藥劑科，江蘇 蘇州 215600；2.南京海昌中藥集團有限公司，江蘇 南京 210061；3.南京海源中藥飲片有限公司，江蘇 南京 210061；4.南京中醫藥大學 國家教育部中藥炮制規范化及標準化工程研究中心，江蘇 南京 210023

洋金花Daturaeflos為茄科植物白花曼陀羅DaturametelL.干燥花，性味辛溫、有毒[1]。研究表明洋金花具有麻醉人體中樞神經系統作用，伍玉哲等[2]對87例臨床患者進行鎮痛研究表明洋金花制劑鎮痛明顯，故洋金花以“中藥麻醉”臨床功效而被廣泛使用[3]。洋金花具有毒性，內服急性中毒報道6例[4]，多由誤服或用量過度所導致，在內服用量上需謹慎[5]。對于洋金花在臨床使用有明顯鎮痛效果，表明其具有臨床使用價值，但因其本身具有毒性或臨床使用量不精確，臨床上解決方法：一方面可以通過控制臨床用量，減少其毒性反應出現，另一方面對洋金花進行炮制，達到減毒增效和提高其內在質量穩定性的效果。對制洋金花的炮制工藝進行研究，獲得穩定的炮制工藝參數，形成質量均一穩定的制洋金花，有助于制洋金花的臨床使用安全有效。

制洋金花只有《上海市中藥飲片炮制規范》[6]收載：將生洋金花用生姜汁拌勻，待吸透，略潤，切成1～2 mm細絲，置鍋內，炒干，趁熱噴灑白酒，拌勻，稍悶，晾干(每生洋金花100 kg，用生姜25 kg打汁，60°白酒12.5 kg)。目前，《藥典》規定洋金花含量測定成分為東莨菪堿[1]，未有相關文獻對制洋金花的炮制工藝優化報道，對于炮制工藝中“將生洋金花用生姜汁拌勻”中生姜汁加水量及之后進行的悶潤時間和“置鍋內，炒干”中的炒制溫度和炒制時間未有明確的參數，為將其更好地用于臨床，本課題組對其進行最佳炮制工藝探索。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 LC-20AT型高效液相色譜儀(SPD-M20A二極管陣列檢測器)(日本島津公司)、BP211D型萬分之一電子天平(北京賽多利斯儀器系統有限公司)、FN1004N型十萬分之一電子天平(北京賽多利斯儀器系統有限公司)、PHS-3C精密數顯臺式酸度計PH計(上海雷磁儀器有限公司)、RE-52型旋轉蒸發儀(BUCHI)、KQ5200DE型數控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)、XL-10B型500g密封型搖擺式高速粉碎機(廣州市旭朗機械設備有限公司)、SHZ-D(III)型循環水式真空泵(鞏義市予華儀器有限責任公司)、榨汁機JYZ-D57(九陽)。

1.2 試藥 洋金花(產地安徽)和生姜(產地山東)，購自南京海源中藥飲片公司，并經南京海源中藥飲片有限公司首席質量官執業中藥師丁斐鑒定，洋金花Daturaeflos為茄科植物白花曼陀羅DaturametelL.干燥花。氫溴酸東莨菪堿對照品(成都普菲德生物技術有限公司，批號18113008，純度≥98%)。磷酸鈉、十二烷基硫酸鈉、磷酸、鹽酸、濃氨水、三氯甲烷均為分析純，乙腈為色譜純，水為純化水。

2 方法與結果

2.1 制洋金花中東莨菪堿含量測定方法的建立[1]

2.1.1 色譜條件 YMC-Pack ODS-A色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動相：乙腈-0.07 mol/L磷酸鈉溶液(含0.0175 mol/L十二烷基硫酸鈉，用磷酸調節pH值至6.0)(50∶100)為流動相；流速：1 mL·min-1；檢測波長為216 nm；柱溫：30 ℃；進樣量：10 μL。氫溴酸東莨菪堿對照品和供試品的HPLC圖譜如圖1所示。

2.1.2 對照品溶液的制備 取氫溴酸東莨菪堿對照品適量，精密稱定，加“2.1.1項下”流動相制成每1 mL含0.679 mg的溶液，即得(東莨菪堿重量=氫溴酸東莨菪堿重量/1.445)。

2.1.3 供試品溶液的制備 取制洋金花樣品粉末(過三號篩)約1 g，精密稱定，置錐形瓶中，加入2 mol/L鹽酸溶液10 mL，超聲處理(功率250 W，頻率40 kHz)30 min，放冷，濾過，濾渣和濾器用2 mol/L鹽酸溶液10 mL分數次洗滌，合并濾液和洗液，用濃氨試液調節pH值至9，用三氯甲烷振搖提取4次，每次10 mL，合并三氯甲烷液，回收溶劑至干，殘渣用流動相溶解，轉移至5 mL量瓶中，加“2.1.1項下”流動相至刻度，搖勻，濾過，取續濾液，即得。

2.1.4 線性關系考察 精密吸取對照品溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1 mL各置于1 mL容量瓶中，加“2.1.1項下”流動相定容至刻度，搖勻，制得13.58、27.16、40.74、54.32、67.90 μg/mL。分別吸取對照品溶液各10 μL，按“2.1.1”項下色譜條件進樣，記錄峰面積值。將所得峰面積(Y)與對照品的濃度(X)進行線性回歸，得氫溴酸東莨菪堿回歸方程、相關系數(R)及線性范圍為Y=12071X+148，R=0.9999，135.8～679 μg/mL。

2.1.5 精密度試驗 取“2.1.2”項下對照品溶液10 μL，按“2.1.1”項下色譜條件進樣，連續進樣6次，記錄氫溴酸東莨菪堿峰面積和保留時間值，并計算RSD值，面積和保留時間RSD值分別為1.18%、0.66%，說明該方法精密度良好。

2.1.6 穩定性試驗 于0、2、4、8、12、24 h精密吸取按“2.1.3”項下制備的供試品溶液10 μL，按“2.1.1”項下色譜條件進樣分析，記錄氫溴酸東莨菪堿峰面積和保留時間值，計算 RSD值，面積和保留時間RSD值分別為1.77%、1.00%，說明供試品溶液在24 h內具有較好的穩定性。

2.1.7 重復性試驗 制洋金花樣品粉末混合均勻分成6份，按“2.1.3”項下方法制備得供試品溶液，分別吸取10 μL，按“2.1.1”項下色譜條件進樣，記錄氫溴酸東莨菪堿含量和保留時間值，并計算RSD值，氫溴酸東莨菪堿平均含量0.15%，含量和保留時間RSD值分別為1.35%、0.72%，說明該方法重復性良好。

2.1.8 加樣回收率試驗 制洋金花樣品粉末9份，每份0.5 g，各加入對照品溶液0.9、0.9、0.9、1.1、1.1、1.1、1.3、1.3、1.3 mL，按“2.1.3”項下方法制備供試品溶液，在三氯甲烷溶解蒸干后的殘渣中用流動相溶解，轉移至5 mL量瓶中，加“2.1.1項下”流動相至刻度。按“2.1.1”項下色譜條件進樣，記錄峰面積值，計算回收率以及RSD值，氫溴酸東莨菪堿平均回收率為103.76%，RSD為1.40%，說明該方法具有良好的準確度，具體見表1。

表1 回收率測定結果 (n=9)

2.2 制洋金花炮制工藝單因素考察

2.2.1 生姜加水量考察 取50 g洋金花樣品，生姜用量12.5 g，榨汁機打汁后得到生姜汁10 mL，加水量見生姜打汁后加水量考察表，25 ℃下悶潤30 min后切碎，炒制溫度190～220 ℃(500 W)，炒制時間5 min，樣品的溫度降到29～30 ℃時，噴灑60°白酒6.25 g，25 ℃下悶潤30 min后晾干。按“2.1”項測定東莨菪堿含量。生姜打汁后加水量考察見表2。由表2可知，生姜打汁后加水量為2倍生姜汁體積的水(20 mL)、3倍生姜汁體積的水(30 mL)、4倍生姜汁體積的水(40 mL)時，東莨菪堿含量較高。

表2 生姜打汁后加水量考察表

2.2.2 悶潤時間考察 取50 g洋金花樣品，生姜用量12.5 g，榨汁機打汁后得到生姜汁10 mL，加3倍生姜汁體積的水(30 mL)，25 ℃下悶潤后切碎，悶潤時間見悶潤時間考察表，炒制溫度190～220 ℃(500 W)，炒制時間5 min，樣品的溫度降到29～30 ℃時，噴灑60°白酒6.25 g，25 ℃下悶潤30 min后晾干。按“2.1”項測定東莨菪堿含量。悶潤時間考察見表3。由表3可知，悶潤時間為30 min、40 min、50 min時，東莨菪堿含量較高。

表3 悶潤時間考察表

2.2.3 炒制溫度考察 取50 g洋金花樣品，生姜用量12.5 g，榨汁機打汁后得到生姜汁10 mL，加3倍生姜汁體積的水(30 mL)，25 ℃下悶潤30 min后切碎，炒制溫度見炒制溫度考察表，炒制時間5 min，樣品的溫度降到29～30 ℃時，噴灑60°白酒6.25 g，25 ℃下悶潤30 min后晾干。按“2.1”項測定東莨菪堿含量。炒制溫度考察見表4。由表4可知，炒制溫度為100～130 ℃、190～220 ℃、270～300 ℃時，東莨菪堿含量較高。

表4 炒制溫度考察表

2.2.4 炒制時間的考察 取50 g洋金花樣品，生姜用量12.5 g，榨汁機打汁后得到生姜汁10 mL，加3倍生姜汁體積的水(30 mL)，25 ℃下悶潤30 min后切碎，炒制溫度190～220 ℃(500 W)，炒制時間見炒制時間考察表，樣品的溫度降到29～30 ℃時，噴灑60°白酒6.25 g，25 ℃下悶潤30 min后晾干。按“2.1”項測定東莨菪堿含量。炒制時間考察見表5。由表5可知，炒制時間為5 min、6 min、7 min時，東莨菪堿含量較高。

表5 炒制時間考察表

2.3 制洋金花炮制工藝正交試驗

2.3.1 正交試驗設計 根據單因素試驗的結果，取洋金花樣品選擇生姜打汁后加水量(A)、悶潤時間(B)、炒制溫度(C)、炒制時間(D)為考察因素，以東莨菪堿含量和水分含量評價為指標，進行正交設計安排實驗，因素水平見表6。

表6 因素水平

2.3.2 正交試驗結果 采用L9(34)表安排試驗，以東莨菪堿含量和水分含量評價為指標，制洋金花中水分測定方法見2015版《中國藥典》通則0832第二法[7]。以綜合加權評分法來評價，評分方法為東莨菪堿含量占80%，水分含量占20%。東莨菪堿含量和水分含量的滿分均為10分，綜合評價=東莨菪堿含量/最大的東莨菪堿含量×10×80%+水分含量評價/最大的水分含量評價×10×20%。水分含量評價標準如表7，實驗結果見表8，方差分析見表9。

表7 水分含量評價標準

表8 制洋金花L9(34)正交實驗結果

表9 方差分析

由方差分析可知，生姜加水量對于制洋金花的炮制工藝具有顯著性影響，其影響因素重要性為：生姜打汁后加水量>炒制時間>炒制溫度>悶潤時間。根據正交試驗結果，第5組實驗綜合評價最高，其中東莨菪堿含量和水分含量評價均為最高值，所以選擇第5組實驗方法為最優炮制工藝，即取50 g洋金花樣品，用生姜12.5 g打汁后加3倍生姜汁體積的水(30 mL)，25 ℃下悶潤40 min后切碎，在270～300 ℃下炒制5 min，29～30 ℃下噴灑6.25 g的60°白酒后，25 ℃下悶30 min，晾干。

2.3.3 驗證試驗 采用確定的最優炮制工藝條件，取洋金花樣品進行3次平行試驗，計算東莨菪堿含量和水分，3次測定結果均優于正交試驗各工藝結果，說明制洋金花的炮制工藝合理可行，結果見表10。

表10 驗證試驗

3 討論

生姜加水量范圍選擇，潤透洋金花藥材考察得出，低于2倍生姜汁體積的水(20 mL)，洋金花藥材沒有潤濕完全，高于5倍生姜汁體積的水(50 mL)，洋金花藥材過于潤濕，有滴水現象。對炮制工藝中的噴灑60°白酒進行考察，選取藥材溫度和噴灑60°白酒后的藥材悶潤時間進行考察，藥材溫度過高時噴灑過白酒的藥材進行悶潤，白酒揮發快，本項炮制工藝消耗時間短，結果酒味淡；藥材溫度過低時噴灑過白酒藥材悶潤后，白酒揮發慢，本項炮制工藝消耗時間長，結果酒味濃。本項炮制工藝優選藥材溫度降到29～30 ℃時，噴灑60°白酒，25 ℃下悶潤30 min后晾干，使炮制后的飲片有酒香氣，同時本項炮制工藝用時短，展示出本項炮制工藝效率。

在制洋金花的單因素考察中選取東莨菪堿含量為指標，但在炮制過程中發現雖然水分在上海市中藥飲片炮制規范[6]中沒有明確規定，但其會影響貯藏時間、外觀等方面，在正交試驗中以水分為評價指標，以2015版《中國藥典》對洋金花水分[1]規定的不超過11%為上限，下限不低于5%，制洋金花炒制后表面太干燥，水分含量太少，外觀變形難識別，造成其性狀鑒別難度。

洋金花作為一種毒性藥材，臨床上多有不良反應報道，本項研究對制洋金花進行炮制工藝研究，運用正交試驗對制洋金花的炮制工藝研究，為其他研究工作者提供制洋金花的炮制工藝參考，提高制洋金花的內在質量穩定性，同時在建立藥材內在質量穩定性的情況下，才有藥材功效和毒性的穩定性。優化制洋金花的炮制工藝有利于其質量控制和臨床用藥安全，下一步將開展制洋金花的毒性試驗研究，同時查找出制洋金花中的毒性標記物成分。