朱砂及其復方與氯化汞、甲基汞對小鼠腎轉運體基因表達影響對比

隋 怡 楊 虹 田興中 付中祥 時京珍

貴州中醫藥大學，貴州 貴陽 550002

朱砂及含朱砂的中藥含汞，汞被列入有毒重金屬范疇，使其用藥安全性遭受質疑。目前均以總汞含量為指標來評價含朱砂中藥的安全性。然而，自然界中汞的形式多種多樣，不同形式的汞其毒性差異巨大，以總汞含量為指標評價朱砂安全性似乎欠妥[1-4]。腎臟是汞的毒性靶器官之一。腎轉運體種類眾多，介導各種機體內、外源性物質自腎臟的排泄。本實驗前期研究了小鼠連續灌胃30 d后，朱砂安神丸及含汞化合物對小鼠腎轉運體基因表達的影響[5]，發現與正常組小鼠相比，HgCl2組和MeHg組小鼠腎汞蓄積量顯著升高、腎轉運體基因(Oat1、Oat2、Oat3、Mrp2、Mrp4、Urat1)表達有顯著性差異，其余各組以上基因的表達與正常組小鼠相比無顯著性差異。表明與HgCl2和MeHg相比，朱砂及其復方對小鼠造成的腎轉運體基因表達的影響相對較低。本次實驗采用實時RT-PCR的方法，繼續檢測連續灌胃30 d后，朱砂安神丸及含汞化合物對小鼠腎轉運體(Oatp4c1、Ost-α和Ost-β)基因表達的影響，從而進一步為科學的評價朱砂及含朱砂中藥的安全性提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 清潔級健康成年雄性昆明種小鼠，體重18～22g，購自貴陽中醫學院實驗動物中心，動物許可證號：SCXK(黔)2002-0001。

1.1.2 藥品 朱砂安神丸水蜜丸(哈藥集團世一堂制藥廠)、朱砂(毫州市京皖中藥飲片廠，水飛炮制品)、HgS(美國Sigma公司)、HgCl2(貴州省萬山特區礦產公司)、MeHg(美國Sigma公司)。藥物的配制：以上各種藥物均用去離子水配制。

1.1.3 試劑 Trizol(invitrogen公司，批號5194 1204)、高容量逆轉錄酶試劑盒(High Capacity Reverse Transcriptase Kit：Applied Biosystems,Foster City,CA,USA，批號0810067)、Power SYBR Green ?PCR Master Mix(Takara公司，批號0912197)、引物設計與合成(上海捷瑞生物工程有限公司)、焦碳酸二乙酯(diethylpyrocarbonate,DEPC，北京索寶來科技有限公司，批號426A057)。

1.1.4 主要儀器 JA2003N型電子天平(上海菁海儀器有限公司)、ND-2000(NaNoDop 2000)微量紫外-可見分光光度計(美國Thermo Scientific公司)、22331型多功能梯度PCR儀(Matercycler gradient，德國Eppendorf公司)、CFX-connect型熒光定量PCR儀(美國BIO-RAD公司)。

1.2 方法

1.2.1 動物分組與給藥 小鼠42只，隨機分成7組，每組6只。分別為正常組、朱砂安神丸組(灌胃，1.8g·kg-1，含汞0.17 g·kg-1)、朱砂組(灌胃，0.2 g·kg-1，含汞0.17 g·kg-1)、朱砂高劑量組(灌胃，2g·kg-1，含汞1.7 g·kg-1)、HgS組(灌胃，0.2 g·kg-1，含汞0.17 g·kg-1)、HgCl2組(灌胃，0.032 g·kg-1，含汞0.024 g·kg-1，約1/7朱砂中汞含量)、MeHg組(灌胃，0.026 g·kg-1，含汞0.024 g·kg-1，約1/7朱砂中汞含量)。每天灌胃給藥1次，連續30 d，處死小鼠取腎組織，進行實時熒光定量RT-PCR檢測。

1.2.2 實時RT-PCR法檢測小鼠腎轉運體基因的表達 RNA的提取、純化與濃度檢測：取50mg腎組織，加入1mL Trizol，冰上勻漿。離心后取上清液加入500 μL異丙醇沉淀RNA，75%乙醇充分洗滌3次后用DEPC水100μL溶解備用。紫外可見分光光度計檢測RNA純度，OD260/OD280>1.7認為RNA純度達到要求，RNA濃度(ng·μL-1)=OD260·40。按檢測的RNA濃度用DEPC水稀釋，配制成200 ng·μL-1的RNA樣品稀釋液備用。

逆轉錄：取6 μL RNA稀釋液按High Capacity RT試劑盒說明書逆轉錄成cDNA，用DEPC水稀釋成濃度為10 ng·μL-1備用。引物序列見表1。

表1 RT-PCR所用引物

PCR擴增：配置15 μL反應體系，包括3 μL cDNA稀釋液、7.5 μL Power SYBR Green PCR Master Mix、0.5 μL混合引物(表1)、4 μL DEPC水。反應條件：95 ℃×10 min，3個循環；95 ℃×10 s，60 ℃×1 min，40個循環；95 ℃×1 min，55 ℃×1 min，55 ℃×10 s，80個循環。以β-actin作為內參基因，根據結果對基因表達進行相對定量。

基因相對表達(%)=目的基因的表達/內參基因的表達×100。

2 結果

朱砂安神丸、朱砂、HgS、HgCl2、MeHg對小鼠腎組織Oatp4c1、Ost-α、Ost-β基因表達的影響， 與正常組相比，小鼠腎Oatp4c1基因的表達在朱砂安神丸組顯著升高(P<0.05)； Ost-α、Ost-β的表達在HgCl2組和MeHg組均顯著降低(P<0.05)。其余各組基因的表達與正常組相比差異無統計學意義(P>0.05)。見表2。

表2 朱砂安神丸、朱砂、HgS、HgCl2、MeHg對小鼠腎組織Oatp4c1、Ost-α、Ost-β基因表達的影響

3 討論

自然界中汞的形式有很多，常見的汞以與硫結合的形式存在，即HgS的形式。HgS的口服吸收度較差，毒性較低；而汞的另外兩種形式氯化汞和甲基汞，易于在海洋生物體內蓄積，主要造成嚴重的肝、腎和神經毒性[1]。不同形式的汞毒性差異巨大。朱砂安神丸全方含汞約為9%，主要為HgS，目前以總汞含量評價含朱砂中藥用藥安全性。然而HgS的水溶性小、口服吸收率低。HgCl2為可溶性二價汞，體內吸收率遠高于HgS。MeHg為脂溶性有機汞，很容易穿透細胞膜，易于蓄積造成毒性。

課題組前期研究發現，HgCl2組和MeHg組小鼠腎轉運體基因表達與正常組相比有顯著性差異，朱砂及朱砂安神丸對腎轉運體基因表達影響較小[5]。由于腎臟轉運體對腎功蓄積和腎臟毒性起到重要的作用[5]，因此課題組從基因水平考察不同形式的汞對腎轉運體基因表達的影響。

有機陰離子轉運多肽Oatp4c1表達于腎近端小管上皮細胞基底膜，介導有機陰離子從腎小管周組織轉運至腎小管上皮細胞內[6]。Oatp4c1底物眾多，其中包括cAMP等機體內源性代謝產物[6]。cAMP為某些細胞信號傳導通路中重要的第二信使，其在細胞內含量升高會激活PKA，激活的PKA使特定蛋白質磷酸化，從而發揮生理作用。在心肌細胞中，PKA激活會使Ca2+通道開放，使得心肌自律細胞4期自動去極化加快，為快速心律失常危險因素[7]。心肌細胞內cAMP的消除有多種方式，心肌細胞上存在一些轉運體，可以直接將cAMP排出心肌細胞，降低心肌細胞內cAMP水平[8]。本次實驗結果中，朱砂安神丸組小鼠腎臟中Oatp4c1基因的表達與正常組相比顯著增加，表達的加強可能會增強腎臟cAMP的排泄，使心肌細胞內cAMP維持在較低水平。

有機溶質轉運體α、β(Ostα、Ostβ)為膽汁酸轉運體。其在不同部位表達有不同的生理意義：在小腸中主要表達介導膽汁酸的吸收；在肝臟表達介導膽汁酸自肝細胞進入血液循環；在腎臟表達介導膽汁酸及其代謝產物的重吸收[9]。肝細胞合成膽汁酸，其與鈉、鉀離子形成的膽鹽有助于脂肪在腸道內的乳化、吸收。膽汁酸的排泄主要是通過腸道和腎[10]，健康機體能通過加強膽汁酸腎小管重吸收等方式，最大程度地保留體內膽汁酸；而在病理情況下(如肝臟損害、膽汁淤積)，機體會調節膽汁酸轉運體的表達，加強膽汁酸自糞或尿的排泄。課題組前期的實驗結果顯示[11]，小鼠灌胃 0.032 g·kg-1氯化汞30 d可見肝組織炎癥細胞浸潤、肝細胞水腫。灌胃 0.026g·kg-1甲基汞30 d可見肝組織大量炎性細胞浸潤，肝細胞水腫明顯，或壞死，顯示出氯化汞和甲基汞對肝臟的損害。本實驗中，在氯化汞組、甲基汞組小鼠腎內Ost-α、Ost-β基因表達式顯著下調，聯系之前觀測到的氯化汞和甲基汞造成的肝臟損傷，課題組認為這是一種機體的自我保護機制，即肝臟損害誘導腎內Ost-α、Ost-β基因表達下調，降低膽汁酸在腎內重吸，加速其排泄，緩解肝臟損傷。而與正常組相比，其余各組Ost-α、Ost-β基因表達無顯著性差異。表明不同形式的汞對小鼠腎轉運體基因表達影響差異巨大，其毒理作用有待進一步考量。