全譜解卷積核磁共振定量法測定嬰幼兒配方乳粉中23種小分子有機物

李 瑋,王奕寒,姜 潔,林 立

(北京市食品安全監控和風險評估中心,北京 100094)

嬰幼兒配方乳粉是以母乳組成的營養元素為標準,以牛乳、羊乳等為原料,適當添加營養素使其組成在數量上、質量和生物學功能上都無限接近于母乳,符合嬰兒消化吸收和營養需要的特殊食品。為最大程度地模擬母乳,滿足嬰幼兒的生長發育需要,生產廠商會按照配方設計添加核苷酸、有機酸、氨基酸等添加劑,這些小分子物質在嬰幼兒的免疫調節、提高記憶力、改善腸道菌群及促進機體代謝等方面都發揮重要的作用[1-5]。因此,對配方乳粉中多種小分子物質的測定對乳粉的質量評價和精確模擬母乳成分具有重要意義。

核磁共振定量(Quantitative Nuclear Magneticresonance,qNMR)分析方法以結構測定為基礎,是一種可以從整體角度對食品的化學成分進行定性、定量綜合分析的現代分析方法。因其非靶向、無偏向的分析特點,qNMR分析方法在食品生產中原料的質量控制、產品穩定性、生產過程中產生的新物質成分及產品研發過程中品質的鑒別等領域,具有很好的檢測優勢[6-9]。

與目前國標及文獻中報道的分光光度法[10-11]、液相[12-14]、氣相[15]、質譜[16]等傳統檢測方法相比,qNMR法能夠同時測定多種小分子物質,具有前處理過程簡單、取樣量小、專屬性強等優點。傳統的qNMR法是在樣品中加入已知量的化合物作為校正參比內標,將被測樣品定量質子的信號峰面積與內標物定量信號峰面積進行比較,最終確定樣品的濃度[17]。因此,qNMR法的準確性依賴于完整清晰的定量信號峰和準確的定量峰積分面積。然而,嬰幼兒配方乳粉的成分復雜,小分子水溶性成分結構相似、含量不高,1H-NMR信號峰會出現信號峰重疊,難以辨認。采用傳統qNMR方法進行定量分析時,會遇到無法得到完整信號積分,受相位、基線調節影響大等問題,從而影響定性、定量的準確性。全譜解卷積(Global Spectral Deconvolution,GSD)是一種NMR的信號處理方法,能夠在幾秒鐘內對整個圖譜進行解卷積處理,整合復雜峰重疊信號,從而提供完整的峰形、化學位移、耦合常數及積分信息,非常適合1H-NMR信號重疊、信噪比不高的物質定量分析。同時,GSD處理可以降低1H-NMR圖譜積分對基線和相位調節的要求,使積分值更加穩定和準確[18]。目前,關于NMR的乳品研究報道多集中在牛乳、人乳的代謝輪廓研究[19-22],少量的嬰幼兒配方乳粉NMR定量研究也都采用傳統qNMR方法進行定量[23-25]。

本研究首先對嬰幼兒配方乳粉水溶液的1H-NMR圖譜中的核苷酸、核苷、有機酸、氨基酸等23個小分子水溶性物質進行信號歸屬,在此基礎上,建立了無需對照品的快速、專屬、簡單的嬰幼兒配方乳粉中23個小分子化合物含量的GSD-qNMR同時測定方法。采用建立的定量方法對實際樣品進行了測定,以期為今后嬰配乳粉的配方研發、產品生產、質量質控、安全檢測提供技術支持。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

不同批次廠家的嬰幼兒配方乳粉 購于本市超市,均在保質期內,開啟后密閉容器內4 ℃保存;重水(D2O,氘代度:99.8%)、3-(三甲基硅基)氘代丙酸鈉(TMSP) 美國CIL公司;PBS溶液(pH=7.4) 美國Thermo Fisher公司;超濾離心管(3KD) 美國Millipore公司;Norell 5 mm核磁管 美國Norell公司。

Bruker AVANCE 600 MHZ超導傅立葉變換核磁共振儀(配有CPBBO探頭,Topspin 3.2處理軟件及60位自動進樣器) 美國Bruker公司;XS204電子天平 瑞士Mettler Toledo公司;Centrifuge 5424R離心機 德國Eppendorf公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品溶液的制備 稱取2.00 g奶粉樣品于10 mL帶蓋離心管中,加入純凈水5 mL,渦旋3 min,超聲15 min后,再渦旋1 min。取渦旋后的液體3 mL于3 kDa的超濾離心管中,9500 r/min轉速下離心20 min。取超濾離心得到的樣品液體420 μL于5 mm核磁管中,再加入60 μL的重水溶液(含186.8 μg/mL的TMSP)和120 μL的PBS(pH=7.40)溶液,混勻后待測。

1.2.2 儀器條件 定性測定:1H-NMR實驗使用Bruker儀器脈沖程序noesypr1d,檢測溫度25 ℃,設定參數1H的90°脈沖寬度為11.90 μs,譜寬為12019.230 Hz,中心頻率為2811.01 Hz,掃描次數為32次。J-分辨、1H-1H COSY、HSQC、HMBC使用Bruker標準脈沖程序,檢測溫度均為25 ℃,掃描次數分別為 32、16、8、16次。

定量測定:1H-NMR實驗使用Bruker儀器脈沖程序noesypr1d,檢測溫度25 ℃,設定參數1H的90°脈沖寬度為11.90 μs,譜寬為12019.230 Hz,中心頻率為2811.01 Hz。脈沖脈沖延遲時間為4 s,掃描次數為96。

1.2.3 樣品測定及譜圖處理 在1.2.2項實驗條件下,調整儀器參數、調諧、控溫、勻場、采樣及傅里葉變換,得到1H-NMR圖譜。測得的1H-NMR譜使用Bruker Topspin 3.2軟件處理,變換點數為64 K,LB為1.00 Hz,用指數窗函數處理,基線和相位校正均采用手動方式進行,TMSP為內標信號(δ0.00)。

1.2.4 GSD數據處理 處理后的圖譜導入MestReNova(version 12.0,Spain)軟件,選擇積分校正方法為信號峰校正(Peaks),設置細化等級為等級1,對23個定量物質和定量內標TMSP的定量峰進行解卷積處理,獲取各定量峰的峰面積。

1.2.5 定量計算公式 以TMSP為定量內標,分別采用傳統的積分方法和解卷積處理后的圖譜積分方法按以下公式計算樣品中各物質的含量。

式(1)

式中:W為各物質的含量;A為定量峰積分面積;N為定量峰所包含的質子數;M為物質相對分子質量;下標u及t分別為分析物和內標物。

1.2.6 方法學考察

1.2.6.1 標準曲線 稱取適量23種標準品置于燒杯中,加水溶解后轉移到10 mL容量瓶中,加水至刻度線后搖勻,配制成混標儲備液。混標溶液中各物質濃度分別為:纈氨酸1.18 mg/mL、乳酸1.75 mg/mL、丙氨酸1.12 mg/mL、乙酸47.5 mg/mL、檸檬酸35.72 mg/mL、肌酸3.07 mg/mL、肌酐0.83 mg/mL、膽堿6.51 mg/mL、L-左旋肉堿0.85 mg/mL、胞嘧啶核苷0.69 mg/mL、腺嘌呤核苷0.73 mg/mL、次黃嘌呤核苷0.55 mg/mL、乳清酸2.17 mg/mL、馬尿酸1.96 mg/mL、尿嘧啶核苷0.31 mg/mL、鳥嘌呤核苷0.66 mg/mL、胞嘧啶核苷酸2.67 mg/mL、尿嘧啶核苷酸2.34 mg/mL、鳥嘌呤核苷酸3.26 mg/mL、甲酸0.13 mg/mL、次黃嘌呤核苷酸0.73 mg/mL、腺嘌呤核苷酸1.79 mg/mL、煙酸0.89 mg/mL。吸取100 μL的混標儲備液,加純凈水900 μL后混勻,取500 μL稀釋后儲備液,在再加500 μL純凈水,依次對倍稀釋為5個濃度的混標溶液。取混標溶液420 μL于5 mm核磁管中,再加入60 μL的重水溶液(含186.8 μg/mL的TMSP)和120 μL的PBS(pH=7.40)溶液,混勻。以1.2.2節中的測定條件進行1H-NMR圖譜,以積分得到的標準品定量峰面積為Y軸,以加入標準品質量為X軸做線性回歸。

1.2.6.2 精密度 按1.2.1節方法制備供試品一份,將制備好的供試品在1.2.2節下條件平行測定6次,計算樣品中23個化合物定量峰積分面積的RSD。

1.2.6.3 重復性 取同一品牌、同一批次的奶粉樣品,按1.2.1節下方法平行制備6份供試品溶液,在1.2.2節條件下測定1H-NMR圖譜,計算樣品中23個化合物定量峰積分面積的RSD。

1.2.6.4 穩定性 取同一供試品溶液,分別在制備后0、2、4、8、12、24 h,在1.2.2節條件下測定1H-NMR圖譜,計算各時間點圖譜的23個化合物定量峰面積的RSD。

1.2.6.5 回收率 平行稱取同一品牌的奶粉樣品9份,按照1.2.1項下制備供試品溶液,其中3份作為對照,另外6份各加入100 μL稀釋后的混標溶液,其中混標溶液中含纈氨酸59.00 μg/mL、乳酸87.75 μg/mL、丙氨酸56.25 μg/mL、乙酸23.75 μg/mL、檸檬酸1786.25 μg/mL、肌酸153.60 μg/mL、肌酐1.75 μg/mL、膽堿325.75 μg/mL、L-左旋肉堿42.5 μg/mL、胞嘧啶核苷34.5 μg/mL、腺嘌呤核苷36.75 μg/mL、次黃嘌呤核苷27.85 μg/mL、乳清酸108.65 μg/mL、馬尿酸98.00 μg/mL、尿嘧啶核苷15.45 μg/mL、鳥嘌呤核苷32.95 μg/mL、胞嘧啶核苷酸113.65 μg/mL、尿嘧啶核苷酸116.95 μg/mL、鳥嘌呤核苷酸163.25 μg/mL、甲酸6.75 μg/mL、次黃嘌呤核苷酸36.75 μg/mL、腺嘌呤核苷酸89.85 μg/mL、煙酸44.65 μg/mL。在1.2.2項下條件測定1H-NMR圖譜,計算各化合物的加標回收率。

1.3 數據處理

樣品檢測結果以平均值±標準偏差表示。

2 結果與分析

2.1 信號峰定性歸屬結果

嬰幼兒配方乳粉水提物的1H-NMR圖譜見圖1A。根據圖譜中質子信號的化學位移、耦合常數等信號特征,結合2D-NMR數據及相關文獻報道[19-20,25]等信息,共對1H-NMR圖譜中23個小分子水溶性成分進行信號歸屬,它們是纈氨酸、乳酸、丙氨酸、檸檬酸、肌酸、肌酐、膽堿、L-左旋肉堿、胞嘧啶核苷、腺嘌呤核苷、次黃嘌呤核苷、乳清酸、馬尿酸、尿嘧啶核苷、鳥嘌呤核苷、胞嘧啶核苷酸、尿嘧啶核苷酸、鳥嘌呤核苷酸、甲酸、次黃嘌呤核苷酸、腺嘌呤核苷酸、煙酸,數據歸屬詳見表1,其中表中加粗數據為用于定量計算的定量峰化學位移。

圖1 嬰幼兒配方乳粉水提物1H-NMR圖譜(A); 解卷積信號提取后得到的23種 小分子化合物的定量峰圖譜(B)Fig.1 1H-NMR spectra of infant formulas(A); Quantitative peaks selected by global spectral deconvolution(GSD)in1H-NMR spectrum of 23 low-molecular-weight organic components content注:1.纈氨酸;2.乳酸;3.乙酸;4.丙氨酸;5.檸檬酸;6.肌酸;7.肌酐;8.膽堿;9.L-左旋肉堿;10.胞嘧啶核苷;11.腺嘌呤核苷;12.次黃嘌呤核苷;13.乳清酸;14.馬尿酸;15. 尿嘧啶核苷;16.鳥嘌呤核苷;17.胞嘧啶核苷酸;18.尿嘧啶核苷酸;19.鳥嘌呤核苷酸;20.甲酸;21.次黃嘌呤核苷酸;22.腺嘌呤核苷酸;23.煙酸。

表1 嬰幼兒配方乳粉中23個小分子有機 成分1H-NMR圖譜信號歸屬表Table 1 1H-NMR data for 23 low-molecular-weight organic components in infant formulas extracts

2.2 GSD提取定量峰

采用1.2.4中GSD數據處理方法提取出嬰幼兒配方乳粉水提物中纈氨酸、乳酸、丙氨酸、檸檬酸、肌酸、肌酐、膽堿、L-左旋肉堿、胞嘧啶核苷、腺嘌呤核苷、次黃嘌呤核苷、乳清酸、馬尿酸、尿嘧啶核苷、鳥嘌呤核苷、胞嘧啶核苷酸、尿嘧啶核苷酸、鳥嘌呤核苷酸、甲酸、次黃嘌呤核苷酸、腺嘌呤核苷酸、煙酸，23種小分子化合物的定量特征信號,見圖1(B),具體化學位移見表1中加黑數據。以內標化合物TMSP為定量內標物,計算23種化合物的含量。

2.3 方法學驗證

采得圖譜經過傅里葉變換、定標、相位和基線調整后,分別采用GSD法和傳統積分兩種方式對內標和化合物的定量峰進行積分,按照1.2.5公式計算結果。分別按照1.2.6中方法學考察內容進行方法學考察實驗,兩種積分方式的方法學驗證結果見表2、表3。

表2 采用傳統積分方法處理圖譜后的23種化合物定量方法考察學結果Table 2 The results of methodological study for 23 compounds after dealing with the atlas by the traditional integral method

表3 采用GSD方法處理圖譜后的23種化合物定量方法學考察結果Table 3 The results of methodological study for 23 compounds after dealing with the atlas by the GSD method

續表

結果顯示,采用傳統積分方式定量方法的相關系數在0.9843～0.9990之間,精密度的RSD在2.03%～8.28%之間,重復性的RSD在2.53%～7.23%之間,穩定性的RSD在2.19%～5.93%之間,回收率在72.60%～129.41%之間;采用GSD積分方式定量方法的相關系數在0.9960～0.9997之間,精密度的RSD在1.02%～3.72%之間,重復性的RSD在1.34%～3.68%之間,穩定性的RSD在1.62%～3.20%之間,回收率在85.02%～110.00%之間。由此可見,GSD定量方法的精密度、穩定性、重現性和回收率都要優于傳統的積分方法,因此,基于GSD處理的qNMR法更適用于嬰幼兒配方乳粉中小分子水溶性物質的全面檢測。特別是采用了這種積分方式可以減少定量對基線調整的依賴,當內標定量峰與化合物定量峰化學位移相差較大時,效果更為明顯。

2.4 樣品檢測

精密稱取6個品牌的乳粉樣品,按照1.2.1項下制備供試品,按照1.2.2項下條件測定樣品的1H-NMR圖譜,采用GSD方法對定量峰進行積分,按照式(1)計算各定量物質的含量,結果見表4。結果顯示兩種檢測方法的測定數值相對標準偏差為3.32%～12.42%,結果較為一致。

表4 6個品牌乳粉樣品中23種小分子化合物的含量(mg/100 g,n=3)Table 4 Determination of 23 low-molecular-weight organic components content in infant formulas extracts from 6 manufacturers

3 結論

本研究采用GSD結合qNMR技術建立了嬰幼兒配方乳粉水提物中23個小分子水溶性物質的含量測定方法,解決了傳統qNMR方法受基線調整及內標峰化學位移影響較大的問題。方法學驗證結果表明,23種化合物的線性線性相關系數在0.9960～0.9997之間,平均加樣回收率為85.02%～110.00%,且精密度、穩定性和重復性的RSD值均小于4%,均優于傳統qNMR方法。在對實際樣品的檢測中,膽堿測定含量與國標法測定數值相對標準偏差為3.32%～12.42%,較為一致,進一步說明了本方法的可靠性。因此,GSD-qNMR法具有準確、穩定、重復性好優點,適用于復雜食品基質中小分子物質的定量檢測。