不同種源綠色型香椿特征風味的分析

孔 宇,許雅薈,張 旭,韓 冉,王汝華,劉常金,*

(1.天津科技大學食品營養與安全國家重點實驗室,天津 300457; 2.天津科技大學食品科學與工程學院,天津 300457)

香椿,又名香椿芽、椿樹、香椿頭等[1-2],在我國種植面積非常廣泛,主要分布在中部地區。香椿嫩芽中含有豐富的蛋白質、氨基酸、揮發油、維生素等營養物質,具有較高的食用價值和保健作用,是一種高檔特產蔬菜。另外,香椿嫩芽中含有豐富的黃酮、鞣質、生物堿、萜類等成分,可以抗菌、消炎、抗氧化、消除自由基、調節血脂等,具有顯著的藥用價值[3-4]。

除了保健作用和藥用價值以外,香椿獨特的風味使其深受廣大群眾的喜愛。香椿濃郁的香味是其最重要的品質特性,同時也是決定香椿經濟價值和食用價值的重要因素。近年來,隨著現代分析技術的發展,對香椿香氣成分的研究也在不斷深入[5]。前人的研究結果表明,香椿嫩芽中的揮發性化合物主要包括萜烯類化合物、醛類化合物、醇類化合物以及含硫類化合物四種[6-9]。在果蔬香氣成分的提取過程中,由于提取方法不同,香氣成分的損失和品質也會有所不同,因此,選擇一種合適的提取方法是實驗的關鍵步驟。目前應用最為廣泛的提取方法為頂空固相微萃取法(HS-SPME)[10-12],相比于傳統方法,該法測量誤差小,操作簡便,成本低,集采樣、萃取、濃縮、進樣于一體[13],不需要有機溶劑和高溫環境,操作條件溫和,有效地提高了萃取效率,可以與氣相質譜儀聯用,簡化實驗過程[14-17]。

陳叢瑾等[18]采用HS-SPME提取香椿芽、葉中的揮發性成分,通過氣相色譜-質譜(GC-MS)聯用儀進行分析鑒定,用峰面積歸一化法測定了各揮發性物質的相對質量分數,結果在香椿芽中鑒定出了26種成分,香椿葉中鑒定出46種成分。孫曉健等[19]利用HS-SPME結合GC-MS分析了新鮮和凍干香椿的揮發性成分,共檢測出72種、66種揮發性物質,并發現含硫類化合物是香椿的主要呈味物質,而且凍干后的香椿風味沒有發生很大改變。

通過GC-MS聯用儀[20]能夠分析出某種物質中揮發性化合物的種類和含量,但由于沒有直觀的感官嗅聞,很難確定該物質的特征香氣成分。而氣相色譜-嗅聞-質譜(GC-O-MS)[21]添加了嗅聞技術,實驗人員就能夠直觀地感受到某種化合物的風味強度。Lan-Phi等[22]在香氣提取物AEDA技術的基礎上,通過GC-O技術檢測出了柚子的特征香氣成分。因此,GC-O技術可以將食品香氣的關鍵成分檢測出來[23-24]。本實驗選用了四種不同種源表型為綠色的香椿嫩芽,采用HS-SPME結合GC-MS聯用儀對揮發性成分進行檢測,再用GC-O鑒定出香椿芽的特征香氣成分,分析不同種源香椿的風味差異,為進一步開發香椿資源,促進香椿在食品、醫藥等領域的應用提供了理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

實驗香椿 均來源于天津科技大學生物技術實習基地,香椿的具體來源和品種包括安徽省阜陽市太和縣青油椿、山西省永濟香椿、湖北省十堰香椿、陜西省安康市嵐皋香椿,香椿采收時間為2018年4月份,將采摘的香椿清洗干凈后曬干,粉碎,過40目篩,置于密封袋內保存,備用。

Agilent7890氣相色譜-質譜聯用儀 美國安捷倫公司;SPME手動進樣器 HT200H美國Supelco公司;30/50 μm PDMS/DVB、65 μm PDMS/DVB、75 μm CAR/PDMS、100 μm PDMS萃取頭 美國Supelco公司;40 mL頂空萃取瓶 上海安普公司;FA1104A電子天平 上海精天電子儀器有限公司;HH-4數顯恒溫水浴鍋 常州普天儀器制造有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品前處理 用電子天平準確稱量不同種源綠香椿芽1.0 g置于研缽中,將其充分破碎,直到散發出濃郁的香氣,然后將樣品轉移至40 mL的頂空瓶中,加入10 mL蒸餾水,用封口膜密封,在50 ℃的恒溫水浴中靜置一段時間使其達到平衡后,再將老化后的萃取頭插入到頂空瓶中進行萃取,萃取完成后,利用氣相色譜-質譜聯用儀對萃取物進行解吸。每個樣品需要做三次平行實驗,最后取其平均值。

1.2.2 GC-MS條件 氣相色譜條件:選用色譜柱HP-5MS石英毛細管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm);載氣為高純氦氣;進樣溫度為250 ℃,載氣流速為1.0 mL/min;分流比為20∶1;升溫程序:初始溫度60 ℃保持5 min,以5 ℃/min升溫到150 ℃,保持1 min,再以10 ℃/min升溫到250 ℃,保持5 min,溶劑延遲1.5 min。

質譜條件:電離方式選用電子轟擊源(EI),接口溫度為230 ℃,離子源溫度為210 ℃,電子能量70 eV,掃描范圍35～500 aum。

1.2.3 HS-SPME條件的優化 影響頂空固相微萃取技術的因素包括萃取頭類型、萃取溫度、萃取時間[25]。本實驗采用單因素實驗對其進行優化。根據極性和涂層厚度的不同,選用30/50 μm PDMS/DVB、65 μm PDMS/DVB、75 μm CAR/PDMS、100 μm PDMS四種類型的萃取頭對香椿特征香氣物質的萃取;選用的萃取時間分為10、20、30、40、50、60 min六個梯度;萃取溫度為10、20、30、40、50、60 ℃六個梯度。不同萃取梯度所得的色譜峰的總面積有所不同,根據最大的色譜峰面積來確定最佳的萃取頭類型、萃取溫度和萃取時間。

1.2.4 GC-O實驗 嗅聞實驗由六人組成的聞香小組進行,而且聞香員必須提前進行氣味分辨的培訓。六人各進行三次嗅聞,記錄員需要記錄每個嗅聞員對聞到氣味的語言描述、氣味強度與色譜峰保留的時間。氣味強度分為5個標準,用“+”表示香氣強度最弱,“+++++”表示香氣強度最強。

1.2.5 定性與定量分析 利用計算機檢索與質譜檢索庫NIST11進行化合物的定性分析,再對照已發表的人工質譜圖,確定其中的香氣成分。采用峰面積歸一化法進行化合物的定量分析。

1.3 數據處理

采用Excel和Origin軟件對實驗數據進行分析并繪制圖表。

2 結果與分析

2.1 頂空固相微萃取條件的優化

由于萃取頭涂層纖維的厚度對萃取效率影響重大,因此需要選取合適的萃取頭來確保實驗的準確性[26]。本實驗選用30/50 μm PDMS/DVB、65 μm PDMS/DVB、75 μm CAR/PDMS、100 μm PDMS四種類型的萃取頭進行萃取,圖1結果表明,相比于其他三種萃取頭,65 μm PDSM/DVB的萃取頭所萃取的揮發性成分的色譜峰面積最大,由此可見,該萃取頭對香椿揮發性成分的萃取效率最高,故選擇該萃取頭進行進一步的研究。

圖4 四個不同種源香椿揮發性成分GC-MS色譜圖Fig.4 The GC-MS chromatogram of the volatile components of 4 different provenances of Toona sinensis注:A:安徽太和青油椿;B:山西永濟香椿;C:湖北鄖西十堰香椿;D:陜西安康嵐皋香椿。

圖1 不同萃取頭對揮發性物質成分萃取效果的影響Fig.1 Effects of different extraction heads on the extraction of volatile components

一般來說,最佳的萃取時間應該接近達到吸附平衡的時間。圖2結果表明,在40 min之前,萃取時間與色譜峰面積成正比關系,當萃取時間達到40 min時,色譜峰面積也達到最大,若繼續延長萃取時間,色譜峰面積則會逐漸下降,可能是因為萃取時間過長發生競爭吸附而導致小分子物質脫附[6]。此結果表明萃取40 min時,萃取纖維上吸附的揮發性成分與樣品頂空瓶內氣體的成分基本達到了相對平衡的狀態。因此,最佳的萃取時間為40 min。

圖2 萃取時間對色譜峰面積的影響Fig.2 Effects of extraction times on chromatographic peak area

萃取溫度不僅會對揮發性化合物的性質產生影響,還會影響化合物的吸附時間和速度[25]。由圖3可知,萃取溫度達50 ℃時,色譜峰面積最大。在10～50 ℃范圍內,色譜峰面積隨著溫度的升高而增大,繼續升溫后,色譜峰面積反而減小,這可能是因為溫度過低無萃取效果差,溫度過高而會導致已經吸附的物質發生解析[6]。因此,最佳的萃取溫度為50 ℃。

圖3 萃取溫度對色譜峰面積的影響Fig.3 Effect of extraction temperature on chromatographic peak area

2.2 綠香椿揮發性香氣成分的鑒定

根據4種綠香椿的總離子流圖,再結合分析軟件分析可以在綠香椿檢測出46種揮發性香氣成分,如表1所示,其中包括27種萜烯類化合物、12種含硫類化合物、5種醇類化合物、1種醛類化合物、1種酸類化合物。與之前張杰[6]的實驗結果相比,本研究檢測出了一些新的化合物,如:二烯丙基三硫醚、α-律草烯、2-甲基辛酸、醇類物質等,出現不同結果的原因可能是HS-SPME萃取技術能夠使萃取的揮發性成分的提取率達到最大,也可能是質譜檢索庫新增了一些新的化合物[27-28]等。由表1可知,四種香椿分布的地區不同,其中的揮發性成分也會有所不同,青油椿中含36種,永濟香椿中含40種,十堰香椿中含26種,嵐皋香椿中含32種。明顯可以看出,永濟香椿所含化合物種類最多,十堰香椿所含化合物最少,這種差距主要體現在萜烯類化合物上,永濟香椿中的萜烯類物質最多(23種),而十堰香椿只含10種萜烯類物質。在四種綠香椿中,β-石竹烯的含量均為最高,在12.46%～13.63%之間,其次為2-巰基-3,4-二甲基-2,3-二氫噻吩,含量在10%左右。

表1 GC-MS分析四種綠色表型香椿揮發性香氣物質Table 1 GC-MS analysis of volatile aroma compounds of four green phenotypes Toona sinensis

采用峰面積歸一化法對四個不同種源綠香椿揮發性香氣物質的含量進行分析,由圖5可知,萜烯類化合物相對含量均最高,其次是含硫類化合物,醇類、醛類、酸類物質含量均較低,因此,萜烯類化合物和含硫類化合物可以作為綠香椿風味的主要成分。此外,圖5中還可以看出,青油椿與永濟香椿中化合物相對含量大致相同,嵐皋香椿與十堰香椿中化合物相對含量差距很小,因此可以將四種香椿大致分為兩類,青油椿與永濟香椿為一類,十堰香椿與嵐皋香椿為一類,這兩大類在萜烯類化合物的含量上區別較為明顯。

圖5 四個不同種源香椿揮發性物質含量對比圖Fig.5 Volatile matter content comparisons of four Toona sinensis samples in different provenances注:圖中同類化合物不同大寫字母表示差異顯著(P<0.05)。

2.3 綠香椿特征風味物質的鑒定

4個不同種源綠香椿經過GC-O分析,結果如表2所示,共鑒定出18個特征香氣成分,包括8種含硫化合物、9種萜烯類化合物、1種醛類化合物,其中2-巰基-3,4-二甲基-2,3-二氫噻吩的香氣強度最高(5級),其次是β-石竹烯(4級),2,5-二甲基噻吩、二烯丙基三硫醚、α-律草烯香氣強度均為3級,由此可以發現,香椿的特征香氣成分主要是萜烯類和含硫類化合物。有文獻表明[29],含硫化合物一般表現出大蒜、韭菜、硫磺等刺激性氣味,在表2的綠香椿特征香氣中,2-巰基-3,4-二甲基-2,3-二氫噻吩表現出煮熟的香椿味,是綠香椿中最主要呈香味成分。而萜烯類化合物一般表現出藥草味、花香味、果香等氣味,能夠調和含硫化合物的刺激性氣味,從而使香椿表現出其特有的風味。由圖5可知,青油椿和永濟香椿中的萜烯類化合物含量較高,揮發性香氣成分的種類也比較多,這可能是青油椿和永濟香椿的風味比十堰香椿和嵐皋香椿更豐富的原因。

表2 GC-O分析綠色表型香椿共有特征香氣物質Table 2 GC-O analysis of common characteristic aroma compounds of green phenotype Toona sinensis

3 結論

本研究選用頂空固相微萃取技術對四個不同種源綠香椿進行萃取,并對萃取條件進行優化,再結合GC-O-MS對香氣成分進行鑒定和分析。實驗結果表明,HS-SPME的最佳萃取條件為:在50 ℃的條件下,采用65 μm PDSM/DVB的萃取頭萃取40 min,揮發性成分損失最小。萃取之后,對其進行GC-MS檢測,在四種綠香椿中共鑒定出46種香氣成分,其中包括27種萜烯類化合物、12種含硫類化合物、5種醇類化合物、1種醛類化合物、1種酸類化合物。而且四種綠香椿中,永濟香椿中檢測出的香氣成分最多(40種),十堰香椿中最少(26種),這種差距主要體現在萜烯類化合物的種類上。為了檢測到香椿中的特征香氣成分,進行了GC-O分析,共鑒定出了18種特征揮發性成分,其中有8種含硫化合物,9種萜烯類化合物,1種醛類化合物,2-巰基-3,4-二甲基-2,3-二氫噻吩、β-石竹烯、2,5-二甲基噻吩、二烯丙基三硫醚、α-律草烯這5種成分的香氣強度較高,因此,萜烯類和含硫類化合物為綠香椿的主要特征香氣成分,這一結果與孫曉健等[19]報道的研究結果有很大的相似之處。在4種綠香椿中,青油椿和永濟香椿的萜烯類化合物的含量較十堰香椿和嵐皋香椿高,因此在風味上,青油椿與永濟香椿更加溫和與豐富。這一研究結果為香椿香氣在食品工業中的應用提供了理論基礎,從而擴大了香椿市場的發展。