再生半纖維素酶解法制備低聚木糖的工藝優化

張幸旭,張林雅,楊雪松,王興盛

(河北科技大學化學與制藥工程學院,河北石家莊 050018)

隨著當今生態環境狀況日益嚴峻,石油、煤炭等不可再生資源總量的日趨減少,由農林可再生性植物資源轉化獲得新材料、高熱值能源、化工原料及藥物正成為一種重要的發展新趨勢。在再生纖維素纖維生產中,產生大量含半纖維素的廢液。傳統方法將半纖維素直接處理成為污泥,利用率低且能耗高。半纖維素作為一種可生物降解的綠色植物資源,聚合度通常在80～200之間[1],其主要成份是多糖,通過改性加工可得到高附加值的功能性產品,具有極好的應用價值。對于再生纖維素纖維廢液中半纖維素的合理利用,已有研究者及企業展開了相關研究及技術開發,初步取得了一些研究成果[2-3]。

半纖維素再生利用的關鍵是其提取及純化。從農林生物質中提取半纖維素的基礎研究中,常采用的方法有堿法、有機溶劑法、機械化學法和水熱法[4-5]。分離后去除低分子量的木質素、鹽和其他雜質,可利用柱色譜、膜分離、溶劑沉淀等方法純化半纖維素[6-7]。在半纖維素的提取和純化中,膜分離技術選擇性強,分離純度高,近年來得到了廣泛研究應用。

功能性低聚糖性能優良,在世界性保健食品中獨樹一幟,它可改善胰島素的敏感性[8-9]、促進腸道中雙歧桿菌的生長[10-11]、降低血液中膽固醇和甘油三酯的含量[12-13]。低聚糖的制備方法有天然原料中提取、轉移酶和水解酶進行糖基轉移反應、天然高聚糖控制性水解法以及化學合成法[14-16]。與其他方法相比,天然高聚糖的控制性水解法是以酶直接作用于生物質原料,工藝過程簡單。采用酶水解法將半纖維素降解得到低聚糖,是再生纖維素纖維廢液再利用的一個研究方向。有關酶解制備低聚糖已有一些相關研究,例如詹小明[17]研究了玉米皮酶解制備纖維寡糖和低聚木糖,采用分批補料的方法,酶解時間16 h,溫度50 ℃,中試結果表明其原料轉化率為32.7%。趙陽陽[18]研究了以玉米芯超濾濃縮液為底物,酶解制備低聚木糖,酶解時間6 h,溫度60 ℃,低聚木糖得率為11.2%。

本研究針對再生纖維素纖維廢液的污染及合理利用問題,系統探討了半纖維素的分離提取及低聚木糖制備的技術開發。利用酶水解法制備低聚木糖,測定低聚木糖作為飼料級低聚糖干粉的產品指標,分析其應用的可行性,以期變廢為寶,促進再生纖維素纖維廢液處理及植物資源再利用的開發研究。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

半纖維素(純度90%) 唐山三友集團提供;木聚糖酶(酶活≥50000 U/g) 生物試劑,上海譜振生物科技有限公司;用水 為去離子水,自制。

XMYG10/630-UI型板框壓濾機 河北景津壓濾機廠;膜分離裝置、納濾膜 上海凱能公司;陰陽離子樹脂交換器,容積1.5 m3自制;RDME-3型三效蒸發器,蒸發量2 t水/h,材質316 L 江蘇瑞達環保科技有限公司;LPG型噴霧干燥器 材質304,自制;PerkinElmer Frontier型傅里葉變換紅外光譜儀(FT-IR) 珀金埃爾默儀器(上海)有限公司;DIONEX ICS-3000型離子色譜儀 美國戴安公司;Agilent 1260型液相色譜儀 安捷倫科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 半纖維素的提取工藝 應用膜分離裝置提取分離再生纖維素纖維廢液中的半纖維素,工藝路線如圖1所示。具體操作為:將含半纖維素35～50 g/L、燒堿170～220 g/L的再生纖維素纖維廢液經過板框過濾器預處理;半纖維素濾液送入納濾膜分離裝置,濃縮3～4倍;在半纖維素濃縮液中加入50 ℃軟水,稀釋4倍;經過納濾膜水透析,濃縮4倍,得到透過液和截留液。其中,透過液為高濃度堿液,截留液為高濃縮半纖維素和少量的堿液。

圖1 半纖維素膜分離工藝路線Fig.1 Process on membrane separation of hemicelluloses

依據膜分離后所得截留液和透過液中半纖維素的含量,設置膜分離的技術參數如表1,優化濃縮倍數,達到最佳工藝。

表1 半纖維素膜分離技術參數Table 1 Technical parameters on membrane separation of hemicelluloses

1.2.2 低聚木糖的制備工藝 低聚木糖的制備采取酶水解法,工藝路線如圖2所示。具體操作為:將膜分離后的半纖維素濃縮液,其中半纖維素含量為59.82 g/L,導入調節罐內加入鹽酸,調節pH為4.5～6.0;經離子交換柱脫鹽,得到糖液;調節溫度為45～60 ℃,在糖液中加入0.3%的木聚糖酶,反應5～8 h;升溫到80 ℃,滅酶;酶解液過濾后,采用0.5 MPa的蒸汽進行蒸發濃縮,得到質量濃度為25%的低聚木糖糖漿;經過0.5 MPa的蒸汽噴霧干燥,制得低聚木糖產品。

圖2 半纖維素制備低聚木糖工藝路線Fig.2 Technological route of preparing xylooligosaccharide from hemicellulose

1.2.3 低聚木糖制備的正交試驗 設定酶水解制備低聚木糖的主要技術參數,在單因素預實驗基礎上,以低聚木糖含量為檢測指標,選定A(pH)、B(酶解溫度, ℃)、C(酶解時間,h)3個因素,設立4個水平進行正交實驗,探討最佳酶解條件,正交試驗因素水平設定如表2。

表2 酶水解正交試驗因素水平表Table 2 Factors and levesTable for othogonal test of enzymatic hydrolysis

1.2.4 半纖維素含量和提取率的測定 半纖維素含量的測定:稱取樣品5 g,加入100 mL、0.3%的CaOH,60 ℃下提取4 h。離心分離后上清液加入6 mol/L NaOH溶液,低溫濃縮至10 mL。加入4倍體積無水乙醇,反復提取三次,離心分離,沉淀物在60 ℃下干燥24 h,稱重。平行取樣品三份,測定后取平均值。

半纖維素提取率計算如下:

式中:x表示半纖維素提取率,%;m0表示膜分離前樣品的質量,g;m1表示膜分離后干燥樣品的質量,g。

1.2.5 半纖維素及低聚木糖結構表征 采用傅里葉紅外光譜儀對半纖維素及低聚木糖樣品進行結構表征,KBr壓片掃描,光譜范圍為500～4000 cm-1,分辨率為4 cm-1。

1.2.6 半纖維素組成的離子色譜測定 半纖維素水解:稱取樣品0.35 g,加入3 mL、75%的H2SO4于試樣中。120 ℃高壓水解1 h,冷卻后加入氨水中和至中性。用砂芯漏斗過濾,得到半纖維素水解液,按色譜條件進樣檢測。

色譜柱:CarboPac PA100柱(2 mm×250 mm);保護柱:CarboPac PA100柱(2 mm×50 mm);淋洗液:0. 001 mol NaOH-0.05 mol NaAC;流速:0.65 mL/min;進樣體積:10 μL;柱溫:30 ℃。

1.2.7 低聚木糖含量和得率的測定 低聚木糖含量采用高效液相色譜儀檢測。色譜柱:CarboPac PA100柱(4 mm×250 mm);保護柱:CarboPac PA100柱(4 mm×50 mm);淋洗液:0.001 mol NaOH-0.05 mol NaAc;流速:0.65 mL/min;進樣體積:10 μL;柱溫:80 ℃。

低聚木糖得率由每克低聚糖可得木二糖～木四糖的質量表示,計算如下:

式中:s表示低聚木糖得率,%;mi表示木二糖～木四糖的質量,g;m表示低聚糖樣品的質量,g。

1.2.8 飼料級低聚木糖干粉性能測定及技術指標 依據飼料級低聚木糖國家標準的測定方法,檢測試驗所得低聚木糖干粉,檢測方法和技術要求如表3。

表3 低聚木糖干粉性能指標Table 3 Performance indexes of xylooligosaccharide powder

1.3 數據處理

所有實驗均至少測定三次,選取平均值。采用Microsoft Excel 2013、Origin Pro 8.0軟件進行數據處理和圖表制作。

2 結果與討論

2.1 半纖維素的提取與表征

2.1.1 膜分離濃縮倍數確定 采用納濾膜設備,依照設定的膜過濾面積、進出口壓力、運行溫度等技術參數,對纖維廢液進行膜分離提取,測試不同濃縮倍數對半纖維素提取的影響,試驗結果如圖3。

圖3 濃縮倍數對膜分離提取半纖維素的影響Fig.3 The effect of enrichment ratio on extraction of hemicellulose by membrane separation

膜分離過程中,當濃縮倍數高時,半纖維素的高濃度會導致膜通量減小,大量半纖維素附著在透析膜上,造成截留液中半纖維素含量低。隨著濃縮倍數減小,膜通量增加,減小了半纖維素在透析膜上的附著,截留液中半纖維素的含量增大。對比圖3中截留液中半纖維素的含量,選擇濃縮倍數為3.5倍時,所得半纖維素的含量最高,其半纖維素含量為59.82 g/L。經實驗測定,半纖維素的提取率可達到85%。

2.1.2 半纖維素的FT-IR表征 利用傅里葉紅外光譜儀,測定半纖維素樣品的化學結構,FT-IR掃描如圖4。

圖4 半纖維素的FT-IR圖Fig.4 FT-IR spectra of hemicellulose

半纖維素中含大量羥基及亞甲基原子團,各原子團被激發后產生特征振動,其振動頻率反映在紅外吸收光譜上,用于鑒定所提取的半纖維素。圖4中,3432、2923、612 cm-1處顯示出了天然半纖維素的特征吸收峰,3432 cm-1為-OH的伸縮振動吸收峰,2923 cm-1為-CH2的伸縮振動吸收峰,612 cm-1為-OH的指紋區吸收峰。

2.1.3 半纖維素的組成分析 采用離子色譜儀測定半纖維素水解液中單糖及糖醛酸組分,組成及含量如表4。

表4 半纖維素組成及含量Table 4 Composition and content of hemicellulose

由表4可知,膜分離提取的半纖維素中,木糖含量最多,其含量最高,為79.2%,其次是甘露糖和葡萄糖,含量分別為10.9%和8.4%,樣品中半乳糖和葡萄糖醛酸含量很少。分析表明,再生纖維素纖維廢液提取的半纖維素較其它農林生物質,具有雜質少、低聚木糖含量大的特性,采用簡便的酶水解法,直接以木聚糖相關的酶作用于半纖維素,有望制備得到質量較優的低聚糖產品。

2.2 低聚木糖的制備與表征

2.2.1 酶水解正交試驗分析 通過3因素4水平正交試驗,分析A(pH)、B(酶解溫度, ℃)和C(酶解時間,h)的變化對s(低聚木糖得率,%)的影響,探討半纖維素酶水解的最佳工藝條件,正交試驗數據如表5。

表5 酶水解正交試驗數據Table 5 The data of orthogonal test on enzymatic hydrolysis

適宜的酶水解條件有利于激發酶的活性,促進半纖維素水解。分析正交試驗表5,各因素對低聚木糖得率的影響程度依次為A>B>C,pH對酶水解的影響最大。由k值可以確定各因素最佳水平組合為A2B3C3,即pH為5,酶解溫度為55 ℃,酶解時間為7 h,其低聚木糖得率可達到36.2%。

2.2.2 低聚木糖的FT-IR表征 取酶水解后的低聚木糖粉末,利用傅里葉紅外光譜儀,測定低聚木糖中組分的化學結構,FT-IR掃描如圖5。

圖5 低聚木糖的FT-IR圖Fig.5 FT-IR spectra of xylooligosaccharide

低聚木糖中主要為木糖的化學基團,圖5中3417.61 cm-1為-OH的伸縮振動吸收峰,2907.77 cm-1為-CH2的伸縮振動吸收峰,1618.93 cm-1為-CH2的彎曲振動吸收峰,1323.99 cm-1為-CH的彎曲振動吸收峰,1043.19 cm-1為-O-鍵的伸縮振動吸收峰,894.79、811.05 cm-1分別為-CH2、-CH的指紋區吸收峰,654.90 cm-1為-OH的指紋區吸收峰。

2.2.3 低聚木糖主要組分分析 利用液相色譜,分析低聚木糖中的主要組分,測定低聚木糖中主要組分的含量,結果如表6。

表6 低聚木糖主要組分含量Table 6 The content of main components in xylooligosaccharide

低聚糖組成不同,具有不同的功能,其生理活性應用于生物體,達到不同的改善功能。低聚木糖作為一種益生元,其活性組分以木二糖、木三糖和木四糖為優,可改善腸道微生態,調節人體生理機能,同時具有促進機體對鈣、鐵等礦物質吸收的功能,已被證實比低聚果糖等對機體更為有效。表6中的分析表明,半纖維素酶水解所得的低聚木糖中,主要成分為木四糖、木三糖、木二糖和木糖,占比達到90.7%,可極好滿足低聚木糖應用中作為益生元的活性組分需求。

2.2.4 低聚木糖產品的性能指標分析 將半纖維素酶水解制備得到的低聚木糖樣品,應用于飼料級低聚糖干粉,按相關國家標準測試產品,其性能指標如表7。

表7 低聚木糖的性能指標Table 7 The performance indicators of xylooligosaccharide

由表7可知,膜分離提取的半纖維素經酶水解后,制備的低聚木糖外觀滿足標準要求,低聚木糖含量達到36.2%,高于國家標準要求的35%。水分含量為4.92%,低于國家標準規定的≤8%。重金屬砷含量為0.80 mg/kg,低于國家標準規定的≤1.0 mg/kg,且不含鉛,遠低于國家標準規定的≤5%。細菌數和霉菌數同樣遠低于國家標準規定的≤10000 CFU/g和≤500 CFU/g。利用再生纖維素纖維廢液提取半纖維素,酶水解制備的低聚木糖,產品各項指標滿足飼料級低聚糖干粉國家標準的技術要求,具有很好的應用價值。

3 結論

以膜分離處理再生纖維素纖維廢液,設定過濾面積、進口壓力、出口壓力和運行溫度,選擇濃縮倍數為3.5倍時,所得截留液中半纖維素含量為59.82 g/L,半纖維素的提取率可達到85%。膜分離提取的半纖維素中,木糖含量可達79.2%。采用酶水解法制備低聚木糖,通過正交試驗確定最佳工藝參數,pH為5,酶解溫度為55 ℃,酶解時間為7 h,其低聚木糖得率可達到36.2%。半纖維素酶水解所得的低聚木糖中,主要成分為木四糖、木三糖、木二糖和木糖,占比達到90.7%。按飼料級低聚糖干粉的國家標準測試產品,其各項指標均可極好地滿足國家標準的技術要求,具有很好的應用價值。