南山牧場生鮮牛乳理化指標與微生物多樣性對比分析

周杏榮,周 輝,羅 潔,劉成國,*,雷文平,周佳豪

(1.湖南農業大學食品科技學院,湖南長沙 410128; 2.湖南省發酵食品工程技術研究中心,湖南長沙 410128)

原料乳營養成分的組成是評價乳品品質的重要指標,它不僅決定著牛乳的營養價值,而且在一定程度上影響著乳制品的加工特性。荷斯坦牛、娟珊牛是我國優良的奶牛品種,其乳成分有不同的特性。荷斯坦奶牛因其產奶量高、生產性能穩定好成為世界上飼養數量最多、使用數量最大的奶牛品種[1]。

南山牧場是中國南方最大的高山苔地草原,平均海拔1760 m,享有“南方的呼倫貝爾”、“中國的新西蘭”之美譽。該地區草場面積大,水質符合國家地表水環境質量一類水質標準,空氣質量佳,這些良好的自然資源條件為發展南山生態特色奶業提供了優良的基礎條件。目前關于不同地區對牛乳品質影響的研究局限于奶牛泌乳量等方面[2],在牛乳的理化指標與微生物多樣性上并未有研究。因此,研究不同地區對牛乳品質的具體影響因素具有重要意義。

本文主要研究湖南山區高海拔牧場的牛乳,并以城郊牧場牛乳作為對照,對牛乳常規營養成分、礦物質元素、氨基酸組成及揮發性成分進行分析測定,并基于Illumina Hiseq高通量技術研究牛乳樣品中微生物多樣性,從而研究牛乳微生物種群與乳成分之間的關系,旨在比較不同牧場生鮮牛乳之間的差異,為改善南山牧場地區原料乳的品質以及對其的合理開發利用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

南山牧場荷斯坦牛乳樣品(NS)、城郊牧場荷斯坦牛乳樣品(HST)、城郊牧場娟姍牛乳樣品(JS)、城郊牧場荷斯坦及娟姍混合牛乳樣品(HSTJS) 南山牧場及城郊牧場采集牛奶樣品,用無菌棉簽蘸少量滅菌的生理鹽水擦拭乳頭后,將牛奶擠入無菌管中,隨機取得牛奶樣品60(15×4)份,將所有樣品低溫保存并盡快運至實驗室保存于-80 ℃冰箱;硫酸鐵銨(NH4Fe(SO4)2·12H2O) 純度>99.99%,上海聯邁生物工程有限公司;碳酸鈣(CaCO3) 純度>99.99%,上海澤葉生物科技有限公司;氧化鋅(ZnO) 純度>99.99%,海順新材料有限公司;硒標準溶液(1000 mg/L) 上海恪敏生物科技有限公司;五水硫酸銅(CuSO4·5H2O) 純度>99.99%,東莞市譜標實驗器材科技有限公司;磷酸二氫鉀(KH2PO4) 純度>99.99%,浙江新化化工股份有限公司。

FT 120乳品分析儀 上海瑞玢國際貿易有限公司;PUCHUN型電子天平 上海精密科學儀器有限公司;601型超級恒溫水浴鍋 金壇市醫療器廠;SC-320D型冷藏柜 青島海爾股份有限公司;AAS6800型原子吸收光譜儀 日本島津公司;ARL Perform’X 2500 X射線熒光光譜儀 賽默飛世爾科技公司;Alpha1900型紫外可見分光光度計 上海譜元儀器有限公司;GCMS-QP2010型氣質聯用儀 島津企業管理(中國)有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品的選擇 理化指標及微生物多樣性測定中,選用南山牧場荷斯坦牛乳樣品(NS)、城郊牧場荷斯坦牛乳樣品(HST)、城郊牧場娟姍牛乳樣品(JS)進行比較,是為了分析在相同環境或不同環境下,不同品種的牛乳乳成分、微生物多樣性是否存在差異,從側面看出環境對牛乳的影響;微生物多樣性測定中,又加入了荷斯坦和娟姍牛乳的混合奶樣(HSTJS),目的是為了觀察兩種牛乳樣品混合是否會改變其細菌的多樣性。

1.2.2 理化指標的測定 牛乳常規營養成分分析:取得樣品后,在冷藏的條件下送至湖南農業科學院進行測定,利用FT 120乳品分析儀測定牛乳的各項基本營養成分含量,包括脂肪、蛋白質、乳糖、全乳固體、非脂乳固體、密度、酸度、游離脂肪酸;礦物質元素的測定,參照GB 5009.90-2016《食品中鐵的測定》、GB 5009.92-2016《食品中鈣的測定》、GB 5009.14-2017《食品中鋅的測定》、GB 5009.93-2017《食品中硒的測定》、GB 5009.13-2017《食品中銅的測定》、GB 5009.87-2016《食品中磷的測定》;氨基酸的測定,參考GB/T 5009. 124-2010 《食品中氨基酸的測定》。揮發性風味物質測定,參照文獻方法[3]進行牛乳樣品的頂空萃取及風味物質的測定:

a.GC條件:DB-WAX毛細管色譜柱(30 m×0.25 mm,0.25 μm);進樣口溫度250 ℃;柱箱升溫程序:初溫35 ℃保持3 min,然后以3 ℃/min升溫至200 ℃,再以20 ℃/min升溫至250 ℃,保持5 min;載氣為氦氣He,流速為1 mL/min;進樣采用自動分流方式進行,分流比10∶1。

b.MS條件:EM電離源,離子源溫度250 ℃;接口溫度200 ℃;檢測電壓為1 kV;質量掃描范圍m/z為30～400。

1.2.3 高通量測序牛乳中微生物細菌多樣性的測定 將所有樣品低溫保存并盡快運至北京諾禾致源科技股份有限公司進行高通量測序;首先,將測序結果中的reads數據使用Cutadapt[4]進行低質量部分剪切,再根據Barcode從得到的reads中拆分出各樣品數據,截去Barcode和引物序列初步質控得到原始數據，經過以上處理后得到的Reads需要進行去除嵌合體序列的處理,Reads序列通過與物種注釋數據庫進行比對檢測嵌合體序列,并最終去除其中的嵌合體序列[5],得到最終的有效數據。

1.3 數據處理

采用Excel 2010軟件進行數據統計分析,顯著性水平為P<0.05,每個樣品檢測均為3次重復;揮發性成分獲得數據采用美國國家標準與技術研究院(national institute of standards and technology,NIST)2015版本對照,相似度在80%以上為有效數據。

2 結果與分析

2.1 南山牛乳與其他乳常規營養成分的比較

由表1可知,與HST牛乳相比,NS牛乳脂肪含量較低,為3.37%;有研究報道,荷斯坦牛乳脂肪相對含量較低,均值為4.10%[6],而娟姍奶牛以較高的乳脂率和乳蛋白率而聞名。對比表1中結果,JS牛乳的脂肪及蛋白質含量最高,HST牛乳脂肪為4.04%,NS牛乳脂肪顯著低于HST牛乳(P<0.05),且NS牛乳蛋白質含量3.28%與HST牛乳蛋白質含量3.22%呈顯著差異(P<0.05)。引起脂肪和蛋白質含量差異的因素有很多,可能的原因是飼糧結構,飼糧結構的組成比例不同會對奶牛生產性能以及乳品質產生很大的影響[7]。表1中,NS牛乳乳糖含量為4.61%,相較于城郊牧場JS和HST牛乳明顯較低,較適合乳糖不耐受人群的食用。此外,全乳固體、密度和酸度是衡量鮮乳質量的重要指標,雖然南山牧場牛乳全乳固體及非脂乳固體含量雖然明顯低于城郊牧場HST和JS牛乳,但符合國家標準,并且其游離脂肪酸含量明顯高于城郊牧場2種牛乳。正常鮮乳的相對密度在1.028～1.032之間,酸度小于18 °T。表1中,南山牧場牛乳密度為1.03,酸度為13.60 °T,牧場之間有顯著差異(P<0.05),但均達到正常鮮乳的標準。本研究表明南山牧場地區生鮮乳與城郊牧場生鮮乳的營養成分具有明顯的差異,對引起該地區乳品質差異的因素還有待進一步研究。

表1 常規營養成分測定結果Table 1 Determination results of conventional nutrition components

2.2 礦物質元素含量的比較

牛乳中的礦物質是人體獲取礦物元素來源的一個重要途徑[8]。3種牛乳中含有鐵、鈣、鋅、硒、磷5種元素。鐵是人體所需的重要微量元素,參與體內氧的轉運、交換和組織呼吸過程,維持機體正常造血功能,對人體健康有重要意義[9]。由表2可知,南山牧場牛乳鐵含量(5.200 mg/L)約為城郊牧場JS牛乳和HST牛乳的2倍,但JS牛乳與HST鐵含量差異并不顯著(P>0.05)。并且城郊牧場JS牛乳及HST牛乳鋅含量均低于南山牧場NS牛乳。此外,3種牛乳鈣、硒、總磷含量均呈顯著性差異(P<0.05),其中,城郊牧場HST牛乳3種礦物質含量最高;對于鈣、硒含量,JS牛乳最低;對于總磷含量,NS牛乳最低。造成差異的可能原因,一方面是地質環境不同導致的土壤、牧草中元素含量不同引起的,另一方面也不排除不同地區家畜品種、飼養方式、季節等因素的交叉影響。

表2 礦物質元素測定結果Table 2 Determination results of mineral elements

2.3 氨基酸含量的比較

表3中,JS牛乳、NS牛乳、HST牛乳中氨基酸總量分別為3.646、3.102、3.217 g/100 g;8種必需氨基酸含量分別為1.532、1.303、1.376 g/100 g;必需氨基酸分別占總氨基酸含量的 42.0%、42.0%、42. 8%,必需氨基酸與非必需氨基酸的比值分別為0.725、0.724、0.747,接近 FAO/WHO標準規定的必需氨基酸含量(40%)和E/N值(0.6)[10],說明兩個牧場的生鮮乳都屬于優質蛋白質資源,從單個氨基酸含量來看,甘氨酸(Gly)、胱氨酸(Cys)、纈氨酸(Val)、蛋氨酸(Met)、苯丙氨酸(Phe)、賴氨酸(Lys),NS牛乳與HST牛乳有顯著差異性(P<0.05),但谷氨酸、丙氨酸、異亮氨酸、脯氨酸的含量NS牛乳與HST牛乳基本無差異,且除胱氨酸、丙氨酸及絲氨酸外,兩個牧場荷斯坦牛乳其他氨基酸含量與JS牛乳都存在顯著差異性(P<0.05)。同一品種生鮮乳,影響乳品質的主要因素之一是地區差異[11],因此可能取決于明顯的地區差異、氣溫的變化、飼糧結構組成和飼養管理方式等因素。

表3 氨基酸測定結果(g/100 g)Table 3 Amino acid determination results(g/100 g)

2.4 揮發性成分結果分析

由表4可知,對兩個牧場的牛乳進行GC-MS分析,均有效萃取檢出了揮發性風味物質。其中,在JS牛乳中共檢出13種揮發性物質,其中酮類7種、醛類2種、烷烴類1種、其他3種。在NS牛乳中共檢出11種揮發性物質,其中酮類5種、醛類2種、烷烴類2種、其他2種。在HST牛乳中共檢出13種揮發性物質,其中酮類7種、醛類2種、烷烴類3種、其他1種。南山牧場牛乳中揮發性物質種類相對較少;城郊牧場兩種牛乳揮發性物質的種類和含量比較接近。

將3種牛乳樣品的揮發性物質進行比較分析,結果顯示,3種牛乳樣品中主要的揮發性物質為酮類、烷烴類、醛類;共有的揮發性物質為6種,分別為丙酮、2-庚酮、2-壬酮、2-甲基-4-庚酮、壬醛、癸醛。其中,2-庚酮和2-壬酮呈奶香、甜香風味,是牛乳風味的代表性揮發性風味物質[12]。NS牛乳中這兩種物質含量分別達到了8.54%和21.98%,明顯高于JS、HST牛乳。醛類物質由于風味閾值較低,且具有奶香、油脂風味,也是牛乳風味的常見特征組分[13]。表4中可知,壬醛所占含量在醛類中較高,NS牛乳高達16.51%,而JS和HST牛乳含量極低。烷烴類物質在3種牛乳樣品中相對含量少,且該類物質由于風味閾值較高[14],對于牛乳風味的貢獻不大。結果表明,不同品種牛乳揮發性風味物質差異不大,兩個牧場的同一品種牛乳揮發性風味物質具有明顯差異,南山牧場牛乳奶香味更加濃郁。

表4 鮮牛奶風味物質的測定結果Table 4 Measurement results of fresh milk flavor substances

2.5 高通量測序中微生物多樣性比較

2.5.1 樣品測序結果及多樣性指數 通過16S rRNA基因序列測序,分析樣品中的微生物群落多樣性。對樣品原始序列條帶中低質量條帶進行嵌合體過濾,得到可用于后續分析的有效數據,如表5所示。Alpha多樣性用于分析單個樣品內的微生物群落多樣性和豐富度,它有多種衡量指標:Chao1和ACE指數衡量物種豐度,Shannon用于衡量物種多樣性,受群落中各物物種豐度和均勻度的影響[15]。由表5可知,HSTJS樣品中的OTUs和微生物多樣性最高,這個結果可能是混合了兩種牛乳樣品導致增加了其微生物種類。NS樣品中的OTUs和微生物多樣性明顯低于HST樣品,且低于JS樣品,說明兩個牧場微生物多樣性存在明顯差異。可能是環境因素的影響,南山處于高海拔地區,氣溫較低,不適宜部分微生物生長導致牛乳中微生物多樣性較少。OTUs覆蓋率數值越高,則樣品中物種被測出的概率越高。表中所有樣品的覆蓋率均在99%以上,說明測序結果可以反應樣本中微生物真實情況。

表5 牛乳樣品測序數據集匯總及統計分析Table 5 Summary and statistical analysis of milk sample sequencing data set

從樣本中隨機抽取一定測序量的數據,統計它們所代表物種數目,以抽到的序列數與其對應的OUTs構建曲線,可直接反映測序數據量的合理性,并間接反映樣本中物種的豐富程度[16]。樣品中細菌的稀釋曲線,如圖1所示,所有樣品的稀釋曲線已趨于平緩,說明樣本的OUTs覆蓋度已基本飽和,測序數據量合理。

圖1 不同牛乳樣本的稀釋曲線Fig.1 Dilution curves of different milk samples

2.5.2 微生物群落的多樣性分析

2.5.2.1 細菌門、科分類水平的比較 門分類水平菌群的組成和結果,如圖2所示,共得到10種細菌類群。樣品NS與其他牛乳樣品中,優勢細菌類群及其所占比例不同。NS樣品中的優勢菌群為變形菌門(Proteobacteria,61.76%)最高、擬桿菌門(Bacteroidetes)、厚壁菌門(Firmicutes)、放線菌門(Actinobacteria)次之,所有樣品均含有這 4 種細菌類群,但在樣品中占比差異較大。HST、JS樣品中豐度最高的細菌類群是Firmicutes;其次是Proteobacteria和Bacteroidetes。張敏等[17]研究表明,原奶中主要的菌群是變形菌門,厚壁菌門和變形菌門是最占優勢的菌群門,這與本實驗結果一致。科分類水平如圖3所示。研究發現,不同樣品來源細菌類群差異較大。NS樣品豐度較高的是莫拉氏菌科(Moraxellaceae,39.23%)、假單胞菌科(Pseudomonadaceae,14.40%),且高于城郊牧場樣品。樣品HST的優勢菌類群有腸球菌科(Enterococcaceae,12.64%)。不同樣品之間細菌類群的組成比例明顯不同,城郊牧場樣品細菌類群多樣性更為豐富。結果表明,不同牧場間同一品種的牛乳優勢細菌門類有所不同。

圖2 細菌門分類水平的比較Fig.2 Comparison of bacteria groups at phylum level

圖3 細菌科分類水平的比較Fig.3 Comparison of bacteria groups at family level

2.5.2.2 細菌屬分類水平的比較 在屬分類水平上菌群的組成和結果,如圖4所示。NS樣品具有相對較高的菌群豐度,主要涉及4個屬,不動桿菌(Acinetobacter,33.91%)、假單胞菌(Pseudomonas,17.40%)、金細菌(Chryseobacterium,15.92%)、水桿菌(Enhydrobacter,5.16%)。Von Neubeck等[18]研究發現,原料乳中的優勢菌屬為假單胞菌屬(Pseudomonas)、乳球菌屬(Lactococcus)和不動桿菌屬(Acinetobacter),這與本研究結果相近。不同牧場的牛乳之間差異較大,在城郊牧場三個樣品中,占優勢豐度的是腸球菌(Enterococcus),不動桿菌、假單胞菌所占比例低,尤其是樣品HST中,不動桿菌屬只占2.17%,但HST樣品乳桿菌屬(Lactobacillus)豐度在另外三種樣品中最高,達4.14%。不動桿菌屬是原料乳中常見的嗜冷菌,若大量繁殖會影響破壞乳成分,導致腐敗變質[19]。南山處于高海拔地區,氣溫相對較低,可能是導致原料乳出現嗜冷菌的主要原因。嗜冷菌的污染源是水和土壤,而水和土壤則有可能污染奶牛乳頭和乳房表面;嗜冷菌也可能來源于有關器具和設備,但這些污染都是可以避免的,可以通過加強衛生管理,對污染源進行處理。

圖4 細菌屬分類水平的比較Fig.4 Comparison of bacteria groups at genus level

2.5.3 牛乳樣品中微生物區系的比較 利用樣品中細菌群落的主成分分析(PCA,Principal Component Analysis),可以確定4個牛乳樣品中細菌菌群組成之間的關系(圖5)。

圖5 不同牛乳樣品的PCA分析Fig.5 PCA analysis of different milk samples

PC1的貢獻率為42.97%,PC2的貢獻率為36.26%，累積貢獻率為79.23%。樣本的群落組成越相似,則它們在PCA圖中的距離越接近。如圖5所示,NS樣品和HST樣品明顯分離,說明這兩個牧場的荷斯坦牛乳樣品菌群的組成差異大。

3 結論

營養成分分析表明南山牧場牛乳的脂肪、乳糖含量分別為3.37%、4.61%,顯著低于城郊牧場牛乳(P>0.05);南山牧場牛乳蛋白質含量為3.28%,高于城郊牧場的荷斯坦牛乳。礦物質含量分析:南山牧場牛乳含較高的鐵和鋅,分別為5.200、6.390 mg/L,城郊牧場兩種牛乳都低于南山牧場牛乳;氨基酸測定結果存在明顯的地區差異,氣溫的變化、飼糧結構組成和飼養管理方式是造成該差異的主要因素,揮發性風味物質數據顯示,同一牧場中風味物質種類相近,不同牧場的荷斯坦牛乳,有明顯差異。微生物多樣性分析:南山牛乳微生物組成中,莫拉氏菌科為優勢菌類群,豐度達39.23%,其中,不動桿菌屬也為優勢菌群,嗜冷菌多,不利于牛乳的低溫儲藏,容易使牛乳變質,應加強衛生管理。

同一品種的牛乳受地理環境因素影響大,不同牧場之間牛乳的常規成分以及礦物質含量有明顯差異,但氨基酸含量較為穩定;微生物多樣性受環境因素影響更為顯著,且會影響乳成分品質。南山牧場是中國南方獨特的天然草場和種畜牧草良種繁殖場,氣候冷涼,多年平均溫度為 11.2 ℃,荷斯坦奶牛耐寒但不耐熱,因此南山的氣候環境適宜于荷斯坦奶牛生長和泌乳[20]。然而,本文僅對兩個牧場的牛乳做了基礎對比分析,不同地區牛乳之間差異性更深入的原因還需更進一步的研究。