細胞生長和非生長相結合的擬干酪乳桿菌高效生產L-乳酸研究

張 悅,田錫煒,莊英萍,3

(1.華東理工大學生物工程學院,上海 200237; 2.華東理工大學發酵工程實驗教學示范中心,上海 200237; 3.華東理工大學生物反應器工程國家重點實驗室,上海 200237)

乳酸是一種天然存在的有機酸,其廣泛應用于食品、醫藥、化工、化妝品、材料等眾多行業[1-2]。由于乳酸的分子結構中有一個手性的碳原子,因此乳酸有兩種光學結構,其中L-乳酸被認為是安全無害的[3-4]。目前,有80%以上的乳酸作為風味劑、pH調節劑、酸化劑以及防腐劑等被用于食品工業中,這也大大增加了食品市場對L-乳酸的需求,因此,如何實現L-乳酸發酵過程的高效生產一直是研究的熱點。

雖然已有報道多種微生物能夠生產乳酸[5-8],但是商業乳酸生產主要通過乳酸菌發酵來實現[9]。擬干酪乳桿菌是一種潛在的工業乳酸生產菌,其具有良好的乳酸生產能力,能夠在高初始葡萄糖濃度的條件下高效生產L-乳酸[10-12]。通過Luedeking-Piret模型對乳酸發酵過程進行模擬后發現,其產物合成與生長相關系數要大于非生長相關系數,因此乳酸菌代謝葡萄糖生產乳酸的過程被認為是一個與細胞生長非常相關的過程[13-15]。批發酵模式是最常用的乳酸生產方式,但是在實際乳酸發酵過程中往往會出現發酵結束時菌體代謝活力仍很高的情況,因此這也就為后續較高密度細胞再發酵提供了可行性。高密度發酵能夠有效增加細胞對底物的轉化,同時在消耗少量營養物質的情況下,提高底物轉化率,并減少發酵罐清洗、種子制備、細胞生長等一系列輔助時間,從而提升發酵罐的體積產率和生產效率[16-20]。因此,在乳酸發酵過程中,可以利用批發酵結束時細胞高活性的特點,形成靜息細胞的高密度發酵策略,從而實現乳酸生產效率的提高。

本研究通過考察擬干酪乳桿菌非生長狀態下細胞代謝葡萄糖生產乳酸的能力,以及利用高細胞密度開發偶聯細胞生長和細胞非生長相關的乳酸組合生產新模式,從而提高產物生成速率以及底物利用速率、轉化率,實現乳酸高效生產。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

擬干酪乳桿菌(LactobacillusparacaseiNCBIO-01) 國家生化工程技術研究中心(上海)保藏菌株;葡萄糖 上海泰坦科技股份有限公司;蛋白胨(Peptone)、酵母提取物(Yeast Extract) Oxoid;牛肉提取物(Beef Extract) 生工生物工程(上海)股份有限公司;其他試劑 來源于國藥集團化學試劑有限公司。

5 L攪拌式生物反應器 上海國強生化工程裝備有限公司;pH和溶氧(DO)電極 美國梅特勒-托利多公司;752紫外可見分光光度計 上海菁華科技儀器有限公司;SBA-40D生化分析儀 山東省科學院;FM-8P全自動冰點滲透壓計 上海醫大儀器廠;高效液相色譜柱(Metacarb H柱)、安捷倫1100高效液相色譜儀 美國安捷倫公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 培養基成分 種子培養基(g/L):蛋白胨10,牛肉提取物10,酵母提取物10,檸檬酸氫二銨2,磷酸氫二鈉2,無水乙酸鈉4,硫酸鎂0.2,硫酸錳0.2,氯化鈉0.03,硫酸鐵0.01,碳酸鈣25,吐溫-80 1 mL/L,氫氧化鈉調節初始培養基pH為6.0,115 ℃滅菌20 min,葡萄糖溶液(40 g/L)與其他成分分開配制,115 ℃滅菌20 min。發酵培養基(g/L):蛋白胨 13.33,酵母提取物 13.33,無水乙酸鈉 0.67,硫酸鎂 0.0133,硫酸錳 0.0133,氯化鈉 0.0133,硫酸鐵 0.0133,115 ℃滅菌20 min。葡萄糖溶液與其他成分分開配制,115 ℃滅菌20 min。

1.2.2 培養條件 種子培養:用50 mL無菌水將新鮮茄子瓶斜面中的菌體懸浮,取15 mL懸浮液接種于85 mL種子培養基中,在37 ℃,110 r/min培養箱中培養12 h;搖瓶發酵培養:將20 mL種子培養液接種于80 mL發酵培養基中,接種量為20%,250 mL三角搖瓶置于37 ℃,110 r/min培養箱中培養24 h,發酵初始加入25 g/L碳酸鈣調節過程pH;5 L罐發酵培養:發酵過程中工作體積為4 L,接種量為20%,溫度和轉速分別為37 ℃和150 r/min,通氣量為0.125 vvm。發酵過程通過自動反饋不斷補入25%(w/w)氨水溶液作為中和劑維持過程pH為6.0。

1.2.3 不同初糖濃度下L-乳酸生產 在5 L發酵罐中配制不同濃度初始葡萄糖(100、120、140、160、180 g/L),進行擬干酪乳桿菌L-乳酸生產發酵,考察細胞生長、葡萄糖消耗和L-乳酸生產情況。

1.2.4 不同靜息細胞濃度下L-乳酸生產 將擬干酪乳桿菌細胞在5 L發酵罐中培養14 h后,離心(0 ℃,10000 r/min)3 min,獲得穩定期靜息細胞菌體。菌體用葡萄糖溶液進行重懸,使得溶液中細胞濃度分別為2.35、4.69、7.43、9.36、11.94、14.12、16.47、18.55 g/L。在100 mL搖瓶考察中,配制初始葡萄糖濃度為60 g/L;在5 L發酵罐考察中,初始葡萄糖濃度分別配制為80、100、120、140 g/L。搖瓶中添加10 g/L碳酸鈣作為中和劑,發酵罐中通過不斷補入25%(w/w)氨水溶液維持pH在6.0。

1.2.5 高滲條件下靜息細胞生產L-乳酸 在5 L發酵罐中(60 g/L初始葡萄糖),以1 mol/L NaCl作為高滲條件,考察穩定期(發酵14 h后)靜息細胞(4.36 g/L)在添加高滲條件和未添加高滲條件下,細胞葡萄糖消耗和L-乳酸生產的情況。培養過程中,通過自動反饋不斷補入25%(w/w)氫氧化鈣溶液維持pH在6.0。

1.2.6 細胞生長和非生長相關組合的L-乳酸高效生產 同時在兩個5 L發酵罐中(140 g/L初始葡萄糖)進行擬干酪乳桿菌生產L-乳酸批發酵(第一階段)。待批發酵結束后,通過離心(0 ℃,10000 r/min,3 min),用100 g/L葡萄糖溶液將菌體重懸并合并在一起,繼續進行靜息細胞的L-乳酸生產(第二階段),直至葡萄糖降零后結束。

1.2.7 細胞生物量測定 用稀鹽酸稀釋發酵液至一定濃度,以稀鹽酸作為對照,在紫外可見分光光度計下測定620 nm 波長時的吸光值,使得測定的光密度值(OD)處于0.2～0.8之間。細胞生物量通過細胞干重(DCW)來表示,兩者關系為:1 OD相當于0.41 g/L DCW。

1.2.8 發酵液L-乳酸和葡萄糖測定 取一定量發酵液在5000 r/min條件下離心10 min,棄去菌體,稀釋上清液使得葡萄糖和L-乳酸濃度分別處于1和0.5 g/L以下。L-乳酸和葡萄糖濃度通過SBA-40C生物傳感分析儀進行測定。

1.2.9 發酵液滲透壓測定 將發酵液稀釋一定倍數,使得測定樣品的滲透壓處于300～800 mOsm/kg之間,再通過FM-8P全自動冰點滲透壓計進行發酵液滲透壓的測定。

1.2.10 葡萄糖消耗速率計算方法 根據一定時間內發酵液中葡萄糖濃度的變化量計算得到此時間內葡萄糖消耗速率,具體公式如下:

rs=(S1-S2)/(t2-t1)

式中:rs表示葡萄糖消耗速率,g/L/h;S1和S2分別表示t1和t2時刻發酵液中葡萄糖濃度,g/L。

1.2.11 L-乳酸生產速率計算方法 根據一定時間內發酵液中L-乳酸的含量計算得到此時間內L-乳酸生產速率,具體公式如下:

rp=(P2-P1)/(t2-t1)

式中:rp表示L-乳酸生產速率,g/L/h;P1和P2分別表示t1和t2時刻發酵液中L-乳酸濃度,g/L。

1.2.12 L-乳酸比生產速率計算方法 根據一定時間內細胞生產L-乳酸的量以及菌體的濃度計算得到此時間內L-乳酸比生產速率,具體公式如下:

Qp=(P2-P1)/(t2-t1)/X

式中:Qp表示比生產速率,g/g/h;P1和P2分別表示t1和t2時刻發酵液中L-乳酸濃度,g/L;X表示菌體濃度,g/L。

1.2.13 L-乳酸轉化率計算方法 根據一定時間內發酵液中葡萄糖濃度和L-乳酸濃度的變化計算得到此時間內L-乳酸轉化率,具體公式如下:

Yp=(P2-P1)/(S1-S2)

式中:Yp表示L-乳酸轉化率,g/g;P1、P2、S1和S2分別表示t1和t2時刻發酵液中L-乳酸濃度和葡萄糖濃度,g/L。

2 結果與分析

2.1 不同初始葡萄糖濃度下擬干酪乳桿菌生產L-乳酸

葡萄糖作為擬干酪乳桿菌生產L-乳酸的底物,其濃度的高低決定著最終L-乳酸的產量以及整體發酵過程的生產效率[21-22]。從圖1A可以看出,雖然初始葡萄糖濃度從100 g/L增加到180 g/L,但是細胞的生長并未受到葡萄糖濃度的影響,生長期均為12 h左右,而且最大生物量也相差不大。從L-乳酸合成以及葡萄糖的消耗變化圖來看(圖1B和C),發現只有當初始葡萄糖濃度在140 g/L以下時,菌體能夠在較短時間內完全耗盡葡萄糖,并生成L-乳酸,且整體生產效率相差不大。當初始葡萄糖濃度為160 g/L時,雖然菌體在發酵前中期表現出近似低初始葡萄糖濃度下的生產能力,但是在發酵后期無法完全耗盡葡萄糖(圖1B和C),這是因為氨水作為中和劑時,高初始葡萄糖濃度條件下發酵后期菌體會受到嚴重的高滲應激,因此影響葡萄糖代謝和L-乳酸生產;此外,180 g/L初始葡萄糖濃度條件下,菌體不但在發酵后期受到強烈的高滲應激,其中前期發酵可能也受限于高底物濃度抑制,呈現出相對緩慢的生產能力(圖1B和C)。另一方面,雖然乳酸菌生產乳酸過程被認為是一個與生長非常相關的過程,但是從生產速率來看,初始葡萄糖濃度低于140 g/L條件下,發酵結束時,菌體仍表現出非常強的代謝活性,因此,在接下來的實驗中,考察了不同穩定期靜息細胞濃度生產L-乳酸的能力,為后續進一步開發偶聯細胞生長和細胞非生長相關的乳酸組合生產新模式提供理論和數據支撐。

圖1 初始葡萄糖濃度對擬干酪乳桿菌生長(A)、 L-乳酸生產(B)和葡萄糖消耗(C)的影響Fig.1 Effects of different initial glucose concentrations on cell growth(A),L-lactic acid production(B) and glucose consumption(C)of L. paracasei

2.2 不同穩定期靜息細胞濃度生產L-乳酸能力

通過在5 L發酵罐(140 g/L初始葡萄糖濃度)中培養細胞至穩定期(14 h),冷凍離心獲取菌體后,在搖瓶(60 g/L初始葡萄糖濃度)中配制成不同細胞濃度(2.35、4.69、7.43、9.36、11.94、14.12、16.47、18.55 g/L)進行L-乳酸生產能力考察。從圖2A和C可以看出,在起始的2 h內,L-乳酸產量與細胞濃度呈線性關系,這也說明此階段內菌體比生產速率基本維持不變,但是隨著時間的增加,較低細胞濃度仍能維持與初始階段一致的比生產速率,而高細胞濃度的比生產速率則明顯下降,這更有可能是由于高細胞濃度在前期會產生高濃度的乳酸[23],因此發酵液中高濃度產物會明顯抑制菌體的代謝,而不是隨著時間的增加,細胞代謝活性下降[24-25]。在接下來的實驗中,將在5 L發酵罐中對高細胞濃度(18.55 g/L)進行L-乳酸生產能力考察,確定影響菌體代謝能力的時間范圍。

在圖2B中,初始葡萄糖濃度為80和100 g/L時,菌體能夠非常快速地消耗完所有的葡萄糖(5和6.4 h),并生成L-乳酸,其葡萄糖消耗速率和L-乳酸生成速率分別為16.0、15.8 g/(L·h)和15.6、15.3 g/(L·h)。雖然初始葡萄糖濃度120和140 g/L條件下菌體也能完全耗盡所有葡萄糖(9和15 h),但是其葡萄糖消耗速率和L-乳酸生成速率分別較100 g/L條件時下降15.8%、41.8%和17.0%、43.3%。這些實驗結果表明穩定期靜息細胞能夠在6 h左右內仍維持很高的代謝活性,而且完全耗盡100 g/L的初始葡萄糖,生成98 g/L的L-乳酸。

圖2 不同濃度靜息細胞在搖瓶(A)和5 L發酵罐(B)中 代謝能力的考察以及搖瓶中比生產速率的比較(C)Fig.2 Study of metabolic capacity of resting cells in shake flask(A)and 5 L bioreactor(B),and comparison of specific L-lactic acid productivity in shake flask(C)

2.3 高滲條件對穩定期靜息細胞生產L-乳酸的影響

為了進一步探索6 h以后細胞代謝活性下降的原因,在搖瓶中考察了高滲環境對穩定期靜息細胞生產L-乳酸的能力(圖3)。從圖3B中可以看出,高滲條件下環境滲透壓為2200 mOsm/kg左右,與上述100 g/L初始葡萄糖濃度條件下發酵結束時環境滲透壓相當,而圖3A則表明高滲條件并不會對穩定期靜息細胞量以及初期細胞代謝產生影響,但是隨著發酵的進行(6 h以后),細胞的代謝能力明顯下降。因此,在后續開發偶聯細胞生長和細胞非生長相關的乳酸組合生產新模式過程中,將在第一階段采用140 g/L初始葡萄糖濃度進行兩個平行罐的發酵,當其發酵結束后,將兩個罐細胞通過離心收集后繼續進行第二階段發酵(100 g/L初始葡萄糖濃度),從而減少一系列發酵輔助時間,提高生產效率和生產能力。

圖3 高滲環境對靜息細胞代謝能力的影響Fig.3 Effect of high osmolality on metabolic capacity of resting cells

2.4 細胞生長和非生長相關組合的L-乳酸高效生產

在擬干酪乳桿菌發酵生產L-乳酸過程中,只要調節初始葡萄糖濃度在140 g/L范圍內,細胞就能快速地耗完所有葡萄糖,并且發酵結束時細胞在一定時間范圍內(6～7 h)仍有很強的代謝活性,因此可用于穩定期靜息細胞的發酵,從而提高發酵過程整體生產效率。從圖4中可以看出,在第一階段,兩批平行發酵能夠很快地耗盡140 g/L左右初始葡萄糖,產生近126 g/L的L-乳酸,其葡萄糖消耗速率和L-乳酸生產速率分別為6.3 g/(L·h)和5.9 g/(L·h),L-乳酸轉化率為0.940 g/g。當第一階段結束后,將兩批平行發酵罐菌體通過離心合并繼續進行靜息細胞發酵,此時初始葡萄糖濃度為102 g/L。由于此時細胞濃度為第一階段單個發酵罐生物量的1.7倍左右,菌體能夠在7 h內耗盡所有的葡萄糖,生成98 g/L的L-乳酸,其葡萄糖消耗速率、L-乳酸生產速率和L-乳酸轉化率分別達到了14.6、14.4 g/(L·h)和0.985 g/g。由此可知,雖然處理穩定期靜息細胞的時間可能需要1 h左右,但是在第二階段的生產速率要遠遠大于第一階段,而且需要指出的是,第二階段由于不存在細胞生長的原因,其L-乳酸轉化率也要明顯高于第一階段,從而能夠進一步提高生產效率。

圖4 擬干酪乳桿菌細胞生長 和非生長相關組合的L-乳酸高效生產Fig.4 Efficient L-lactic acid production based on the combination of cell growth related and unrelated modes by L. paracasei注:空心圖標表示常規批發酵條件下細胞生長、 L-乳酸生產和葡萄糖消耗的變化;實心圖標 表示細胞生長和非生長相關組合下細胞生長、 L-乳酸生產和葡萄糖消耗的變化; 相同形狀的空、實心圖標所代表的測定指標相同。

3 結論

擬干酪乳桿菌在140 g/L初始葡萄糖濃度條件下,能夠快速生長并代謝葡萄糖生成L-乳酸,同時在發酵結束后,其穩定期靜息細胞能夠在一定時間范圍內(6～7 h)仍保持非常高的細胞代謝活性。因此,通過開發基于細胞生長和非生長相關組合的高細胞密度L-乳酸生產策略,能夠使得擬干酪乳桿菌細胞在常規發酵結束后繼續高密度高效生產L-乳酸,其生產速率是常規發酵階段的2.4倍,而且L-乳酸轉化率也表現出明顯的提升,達到0.985 g/g,非常接近理論值(1.0 g/g)。本研究開發的發酵過程策略最終實現了生產效率提升的目的,同時也能為工業乳酸生產過程提供借鑒。