菱角梗、菱角殼提取物抑菌活性及其活性成分分析

王洪斌,陳云舒,嚴守雷,3,*,梅大佐,趙道華,張劍雄,王清章,李 潔,3

(1.武昌工學院食品與環境工程學院,湖北武漢 430065; 2.華中農業大學食品科學技術學院,湖北武漢 430070; 3.湖北省水生蔬菜保鮮加工工程技術研究中心,湖北武漢 430070; 4.湖北華貴食品有限公司,湖北洪湖 433200; 5.湖北天井湖農業科技服務有限公司,湖北黃岡 438203)

菱角(TrapabispinosaRoxb.)屬菱科,是一種一年生自由漂浮的植物[1]。原產于歐洲和亞洲的溫和地域,在中國主要種植于南方,特別是太湖地區和長江下游的珠江三角洲[2]。成熟的菱角外果皮堅硬,內有白色果實,口感甘甜[3-5],菱角中含有淀粉、膳食纖維、必需氨基酸、多酚、多糖等物質具有抗癌、抗腫瘤和抗氧化等一系列生物活性[6-8],因此菱角作為一種藥食兩用的果實一直以來受到中國人的青睞。

農產品加工過程中會產生大量副產物,這些副產物中很多都含有豐富的酚類物質,并被證明是酚類抗氧化劑的有效來源[9-10]。菱角殼是菱角加工進程中的主要副產物,約占菱角總量的25%[11-12]。各種研究發現,菱角殼提取物具有降血糖[13-14]、保護肝臟細胞[15-16]、抗癌[17]等作用,這都歸因于菱角殼中含有生物堿、酚酸類、萜類和甾體、多糖類、黃酮類以及苯丙素類等活性物質[18-19]。有研究人員[9]從菱角殼中提取了抑菌活性物質,發現其中主要發揮抑菌作用的成分為沒食子酸以及阿魏酸,并且對革蘭氏陽性菌有良好的抑制效果,然而,對菱角殼提取物的抑菌穩定性以及成分鑒定方面的研究較少。同樣作為菱角加工過程中的副產物,菱角梗中的多糖被證明具有良好的抗氧化活性[20]。但菱角梗引發科學界關注的最神奇之處在于,其可以在炎炎夏日保持多日不腐,而菱角梗提取物的抑菌活性及成分分析情況鮮有報道。

目前對于菱角加工生產過程中產生的大量副產物——菱角梗和菱角殼,只有極少一部分用作中藥材,大部分仍然是作為垃圾丟棄,這造成了極大的資源浪費。本實驗選擇菱角梗和菱角殼為材料制備天然抑菌劑,全面系統地研究這些抑菌物質的抑菌活性以及成分,為其作為抑菌劑在各種食品保鮮中的實際應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

菱角梗和菱角殼 選材于湖北省洪湖市的二角菱;供試微生物金黃色葡萄球菌(AB 99002)、蠟樣芽孢桿菌(AB 2011085)、枯草芽孢桿菌(AB 90008)、大腸桿菌(AB 208270)、銅綠假單胞菌(AB 93066)、釀酒酵母(AY 92003) 由中國典型培養物保藏中心提供;培養基:馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基、營養肉湯培養基 北京路橋技術有限公司;所用試劑 均為分析純。

SPX-250B型生化培養箱 天津市泰斯特儀器有限公司;SB-5200DNT超聲波清洗儀 寧波新芝生物科技股份有限公司;UV-1800紫外-可見分光光度計 日本島津有限公司;ME104電子天平 梅特勒-托多利儀器上海有限公司;SHB-Ⅲ循環水式多用真空泵 鄭州長城科工貿有限公司;RE52型旋轉蒸發儀 上海亞榮生化儀器廠;安捷倫1260高效液相色譜儀 安捷倫科技有限公司;Q-Exactive超高效液相色譜質譜儀 賽默飛世爾科技(中國)有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 乙醇提取液的制備 新鮮菱角梗、菱角殼經洗凈整理后,在日光下曬干,切分成1 cm長度,粉碎后,用60目篩進行處理,得到的粉末低溫冷藏備用。

稱取一定量的菱角梗、菱角殼粉末,料液比1∶30 (g∶mL),提取劑95%乙醇溶液,水浴溫度50 ℃,在功率500 W、振動頻率40 kHz條件下超聲波輔助提取20 min,采用布氏漏斗抽濾,得濾液[21-22]。將上述步驟重復2～3次,把濾液合并后即可得到乙醇提取液。

1.2.2 各溶劑萃取物的制備 將1.2.1中獲得的提取液,在溫度45 ℃的條件下,使用真空旋轉蒸發儀回收全部提取劑,得到乙醇提取物粉末。乙醇提取物粉末用10倍量蒸餾水懸浮,依次用等體積的有機試劑石油醚、乙酸乙酯、正丁醇[23]萃取,各萃取液在溫度45 ℃的條件下,使用真空旋轉蒸發儀回收全部萃取劑,得到各萃取部分粉末。

1.2.3 菌種活化 待測細菌于營養肉湯培養基中37 ℃下培養24 h,使用前在相同培養條件下的試管斜面上活化培養24 h,待測真菌于馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基(potato dextrose agar,PDA)上于28 ℃下培養48 h,使用前在相同培養條件下在試管斜面上活化培養48 h,抑菌實驗前制備菌懸液濃度為106～107CFU/mL。

1.2.4 抑菌活性檢測 抑菌實驗采用濾紙片擴散法[24-26]。樣品利用二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)溶解,采用二倍稀釋法配制系列質量濃度(mg/mL)的待測樣品液。準確吸取100 μL菌懸液均勻涂布于平皿培養基上,在培養基上等間距平鋪4片已滅菌直徑為6 mm的濾紙片,其中3片滴加10 μL經0.22 μm無菌濾頭處理的樣品液,根據實驗目的不同,設置空白對照時,另1片滴加等量的DMSO;設置陽性對照時,另一片滴加陽性對照液,陽性對照液為10.0 μg/mL的氨芐青霉素(Ampicillin)或1.0 mg/mL的兩性霉素B(Amphotericin B)。細菌于37 ℃下培養24 h,真菌于28 ℃下培養48 h,采用十字交叉法量取抑菌圈直徑(包括濾紙片直徑)。觀察菌落生長情況,存在抑菌圈的最低樣品液濃度即為最小抑菌濃度(minimum antimicrobial concentration,MIC)(mg/mL)。菱角梗、菱角殼乙醇提取物的抑菌活性測定過程中,設置陽性對照;菱角梗、菱角殼各溶劑萃取物的抑菌活性測定過程中,設置空白對照和陽性對照。

1.2.5 乙酸乙酯萃取物抑菌穩定性檢測 取三種典型腐敗微生物大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、釀酒酵母菌作為供試菌種,考察溫度、pH、紫外光處理對乙酸乙酯萃取物抑菌穩定性的影響,各處理如下:將濃度為50 mg/mL的萃取物溶液,分別在20、40、60、80、100 ℃水浴溫度下處理30 min,檢測抑菌活性;利用0.1 mol/L的NaOH和0.1 mol/L的HCl溶液調節pH,得到pH分別至5、6、7、8、9濃度為50 mg/mL的萃取物溶液,檢測抑菌活性;使濃度為50 mg/mL的萃取物溶液在30 W的紫外燈下分別照射10、20、30、40 min,檢測抑菌活性。

1.2.6 乙酸乙酯萃取物的純化 根據抑菌實驗結果,選擇活性最強的乙酸乙酯萃取物,采用HP-20大孔樹脂[27]進行初步純化,上樣質量為10 g,柱體積為590 mL(47 cm×4 cm),采用體積分數0～100%的甲醇溶液進行洗脫,得到各洗脫組分。將檢測得到的洗脫活性組分再上Sephadex LH-20凝膠柱(85 cm×1 cm),依次用不同濃度的甲醇液(體積分數0～100%)洗脫,得到進一步的純化品,用于后期的結構鑒定分析。

1.2.7 超高效液質聯用法和高效液相色譜法條件 超高效液質聯用法(ultra-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry,UPLC-MS)條件:色譜柱Agilent ZORBAX SB-C18(2.1 mm×100 mm,1.8 μm);流動相:A,水;B,甲醇;洗脫程序:0～15 min,0～100% B;15～20 min,100% B;20～25 min,100%～0B;流速300 μL/min,進樣量1.0 μL,柱溫40 ℃。質譜條件:電噴霧電離(ESI),檢測離子為負離子;分辨率70000,掃描范圍m/z 140～2000;鞘氣、輔助氣流速分別為35、15 L/min,電離電壓-3.2 kV,離子參數管溫度320 ℃,離子源溫度200 ℃,數據掃描模式Full MS-ddMS2。

高效液相色譜法(high performance liquid chromatography,HPLC)條件參考文獻方法[28-29]:色譜柱,Agilent ZORBAX SB-C18(4.6 mm×250 mm,5 μm);流動相:A,乙腈;B,0.1%甲酸水;洗脫程序:0～3 min,2% A;3～30 min,2%～30% A;30～35 min,30%～70% A;35～39 min,70% A;39～41 min,70%～2% A;41～45 min,2% A。流速0.8 mL/min,進樣量10 μL,柱溫40 ℃。

1.2.8 UPLC-MS和HPLC分析 菱角梗、菱角殼的乙酸乙酯萃取物經UPLC-MS檢測,通過人工譜圖解析及文獻對比,確定了樣品中的各種化學物質,最后利用HPLC法,通過標準品對已知物質進行定量檢測。

1.3 數據處理

所有實驗至少重復三次,數據結果取平均值,采用Origin 8.0進行單因素方差分析與圖表制作。

2 結果與分析

2.1 菱角梗、菱角殼乙醇提取物的抑菌活性分析

菱角梗、菱角殼乙醇提取物在濃度為50 mg/mL時對幾種典型腐敗微生物的生長有明顯的影響,結果見表1。

表1 菱角梗、菱角殼乙醇提取物的抑菌活性Table 1 Antibacterial activity of water chestnut stem and water chestnut pericarp ethanol extract

由表1可知,菱角殼乙醇提取物的抑菌活性強于菱角梗乙醇提取物,且兩者均表現出一定的抑菌規律:對革蘭氏陽性菌抑菌能力>對革蘭氏陰性菌抑菌能力>對真菌抑菌能力。

2.2 菱角梗、菱角殼各溶劑萃取物的抑菌活性分析

菱角梗、菱角殼中各極性萃取物對四種典型腐敗菌(金黃色葡萄球菌、蠟樣芽孢桿菌、大腸桿菌、釀酒酵母菌)的抑菌活性結果見圖1和圖2。由圖1和圖2可知,在同一濃度下(50 mg/mL),菱角梗和菱角殼各極性萃取物對四種典型腐敗菌的抑菌作用趨勢一致,菱角梗各極性萃取物對腐敗菌抑菌能力由強到弱為(除大腸桿菌):乙酸乙酯萃取物>正丁醇萃取物或石油醚萃取物>水萃取物,菱角殼各極性萃取物對腐敗菌抑菌能力由強到弱為:乙酸乙酯萃取物>正丁醇萃取物>石油醚萃取物>水萃取物?？傻贸鼋Y論:發揮主要抑菌能力的活性成分主要集中在中等極性的乙酸乙酯萃取物中,因此,在后續分析及分離鑒定實驗中,重點分析菱角梗的乙酸乙酯萃取物(ethyl acetate extract of water chestnut stem,EAS)和菱角殼的乙酸乙酯萃取物(ethyl acetate extract of water chestnut pericarp,EAP)。

圖1 菱角梗各溶劑萃取物的抑菌活性Fig.1 Antibacterial activity of solvent extracts from water chestnut stem注:s-a:金黃色葡萄球菌;s-b:蠟樣芽孢桿菌;s-c:大腸桿菌;s-d:釀酒酵母菌。

圖2 菱角殼各溶劑萃取物的抑菌活性Fig.2 Antibacterial activity of solvent extracts from water chestnut pericarp注:p-a:金黃色葡萄球菌;p-b:蠟樣芽孢桿菌;p-c:大腸桿菌;p-d:釀酒酵母菌。

2.3 EAS、EAP的最小抑菌濃度

對EAS、EAP的最小抑菌濃度進行測定,結果如表2。EAS、EAP對3種供試菌的抑菌能力由大到小分別為:金黃色葡萄球菌≥大腸桿菌>釀酒酵母菌,該結果與前述抑菌活性篩選的結果一致,表明EAS、EAP對革蘭氏陽性菌的抑菌作用優于革蘭氏陰性菌,對真菌的抑制作用最不明顯。另外,從結果也可看出,EAP的MIC值明顯低于EAS的,說明整體來看,EAP的抑菌能力強于EAS。

表2 EAS、EAP的最小抑菌濃度Table 2 Minimum antibacterial concentration of ethyl acetate extract from water chestnut stem and water chestnut pericarp

2.4 EAS、EAP的抑菌穩定性分析

將EAS、EAP進行不同溫度、不同pH和不同時間的紫外照射處理,對其抑菌穩定性進行分析。由圖3(A)可知,在不同溫度處理后,EAS對三種微生物抑菌能力未出現明顯變化,均表現較好的熱穩定性。由圖3(B)可知,經過不同pH調節處理,EAS對大腸桿菌的抑菌性能波動較大,具體表現為堿性條件下,抑菌性能明顯下降;而對金黃色葡萄球菌和釀酒酵母菌而言,抑菌作用較穩定。因此,酸性環境下更有利于EAS抑菌活力的發揮。由圖3(C)可知,經過不同時間紫外線照射處理后發現,紫外線照射時間30 min可明顯促進EAS對大腸桿菌的抑菌作用;當照射時間20 min,EAS對金黃色葡萄球菌的抑菌能力最強;而紫外線照射處理對釀酒酵母的抑菌作用幾乎沒有影響?？傮w來說,EAS在使用過程中暴露在紫外線下的時間不宜超過30 min。

圖3 各處理條件對EAS抑菌穩定性的影響Fig.3 Effects of various treatment conditions on antibacterial stability of ethyl acetate extract of water chestnut stem

由圖4(A)可知,加熱處理對EAP抑菌能力的影響,呈現先增強后減弱的趨勢,60 ℃下處理30 min時對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的抑菌能力達到峰值,溫度高于60 ℃抑菌能力明顯降低;加熱處理對釀酒酵母的抑菌活性幾乎無影響,與菱角梗的結果類似。由圖4(B)可知,pH高于5時,EAP對金黃色葡萄球菌的抑菌活性出現較明顯的下降,之后隨著pH的升高,保持較好的抑菌穩定性,而對大腸桿菌和釀酒酵母菌的抑菌能力無明顯變化,較EAS而言,EAP表現出更好的酸堿穩定性。由圖4(C)可知,不同時間的紫外線照射處理時,EAP對金黃色葡萄球菌抑菌活性有略微的影響,當照射時間超過20 min后,對大腸桿菌和釀酒酵母菌的抑菌活性有略微下降。但總體而言紫外線照射對EAP的抑菌活性影響不大。

圖4 各處理條件對EAP抑菌穩定性的影響Fig.4 Effects of various treatment conditions on antibacterial stability of ethyl acetate extract of water chestnut pericarp

2.5 菱角梗、菱角殼抑菌成分化學結構鑒定

從EAS中鑒定出10種化合物(見表3),在高效液相色譜圖(見圖5A)中的峰歸屬編號為1～10號,其中化合物1～4、6～10為沒食子酸及其衍生物,化合物5為黃酮類化合物。EAS中沒食子酸最為豐富,含量27.22%,其次為1,2,6-三-O-沒食子酰-β-D-葡萄糖,含量18.65%。有學者在研究中發現,沒食子酸會以劑量依賴性方式引起細菌內膜嚴重收縮和不規則形態,從而表現出抑菌作用[30],這可能就是菱角梗抑菌成分可以達到抑菌效果的原因。

表3 EAS的UPLC-MS和UPLC鑒定結果Table 3 UPLC-MS and UPLC identification results of ethyl acetate extract of water chestnut stem

圖5 EAS、EAP中抑菌成分的高效液相色譜圖Fig.5 High performance liquid chromatograms of antibacterial components in EAS and EAP 注:A:EAS中抑菌成分的高效液相色譜圖; B:EAP中抑菌成分的高效液相色譜圖。

從EAP中鑒定出9種化合物(見表4),在高效液相色譜圖(見圖5B)中的峰歸屬編號為11～19,其中化合物11～15與EAS的化合物1、3、4、5、7分別重疊,化合物14、19為類黃酮類化合物,其余為沒食子酸及其衍生物。EAP中含量最為豐富的為1,2,3,6-四-O-沒食子酰-β-D-葡萄糖,含量33.93%,其次為槲皮素-3-O-半乳糖苷和1,2,6-三-O-沒食子酰-β-D-葡萄糖,含量分別12.23%、11.68%。

表4 EAP的UPLC-MS和UPLC鑒定結果Table 4 UPLC-MS and UPLC identification results of ethyl acetate extract of water chestnut pericarp

3 結論

EAS和EAP都具有較強的抑菌能力,它們均對革蘭氏陽性菌的抑菌作用優于革蘭氏陰性菌,對真菌的抑菌作用最弱。通過比較EAS和EAP的MIC值,EAP的抑菌能力優于EAS。在抑菌穩定性研究中發現,對于EAS而言,其具有良好的熱穩定性,在酸性條件下抑菌活性較強,紫外線中暴露時間不宜超過30 min;對于EAP而言,避免溫度高于60 ℃,酸堿穩定性較好,紫外線照射對抑菌能力的影響較小。利用UPLC-MS和HPLC,從EAS中鑒定出10種化合物,主要為沒食子酸及其衍生物,其中沒食子酸含量27.22%,1,2,6-三-O-沒食子酰-β-D-葡萄糖含量18.65%;從EAP中鑒定出9種化合物,其中最為豐富的為一種沒食子酸衍生物——1,2,3,6-四-O-沒食子酰-β-D-葡萄糖,含量33.93%。本研究為EAS和EAP在食品保鮮加工中作為抑菌劑的利用提供了理論支持,具有實際應用的意義。