肺腺癌EGFR基因突變與Ki67、P53蛋白水平的相關性研究

張芳，楊寶軍，王婧華

（平煤神馬醫療集團總醫院 病理科，河南 平頂山467009）

肺癌是目前臨床死亡率最高的惡性腫瘤，其中非小細胞肺癌約占全部肺癌的80%以上，而在非小細胞肺癌中，肺腺癌最為常見，是醫學界研究熱點。肺腺癌臨床表現無明顯特異性，但具有獨特分子學特征。表皮生長因子受體（EGFR）是一種原癌基因C－erbB－1表達產物，其異常表達及基因突變與腫瘤侵襲和轉移、化療抗性、新生血管生成及預后密切相關［1］。在免疫表型方面，肺腺癌具有一些特異分子標記物，Ki67屬于腫瘤增殖相關抗原，參與腫瘤細胞增殖及調控；而P53蛋白是腫瘤細胞生長周期負調節因子，與細胞DNA修復、周期調控、細胞分化和凋亡等生物學功能相關，具有廣譜腫瘤抑制作用和反式激活功能［2］。基于此，本研究選取我院收治的肺腺癌患者160例，分析肺腺癌EGFR基因突變與Ki67、P53蛋白水平的相關性，旨在為臨床治療及預后評估提供依據，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料選取2017年7月至2019年6月我院收治的160例肺腺癌患者作為研究對象。納入標準：病理均診斷為肺腺癌；確診前未接受放化療；患者及家屬知情并簽署同意書。排除標準：心肝腎等臟器功能異常；合并其他惡性腫瘤；確診前接受靶分子治療；精神系統或神經系統疾病；難以配合檢查。其中男86例，女74例；年齡30～81歲，平均年齡（58.96±7.11）歲；分化程度：低分化54例，中分化58例，高分化48例。檢測肺腺癌EGFR基因突變情況，根據檢測結果將其分為EGFR陽性組和EGFR陰性組各80例。兩組的性別、年齡、分化程度等一般資料比較無統計學差異（P＞0.05）。

1.2 方法

1.2.1 EGFR基因19、21位點突變檢測 采用EGFR基因突變檢測試劑盒（批號20170202H，海吉利生物有限公司），采用Taq man－ARMS法檢測EGFR基因19、21位點突變情況，EGFR基因19、21位點突變為陽性，無基因突變為陰性。

1.2.2 Ki67、P53蛋白表達檢測 實驗步驟如下：（A）常規HE染色實驗：常規石蠟標本切片，切片厚度＜3μm；干烤箱內100℃烤片固定40 min；切片室溫靜置60 min，并在二甲苯內浸泡2次，10 min／次，依次于濃度100%、95%、85%、75%、50%乙醇內浸泡5 min，采用蒸餾水孵育5 min后PBS緩沖液孵育5 min；蘇木素染色5 min，再用自來水沖洗2 min；分化液分化，2次振蕩，停留15 s后再次用自來水流水洗滌；流水沖洗返藍，沖洗時間2 min；伊紅染色，振蕩3下；不同濃度酒精脫水，5 min／次；風干，中性樹膠封固，采用顯微鏡觀察。（B）免疫組化法：石蠟標本切片，切片厚度＜3μm；切片室溫靜置60 min，二甲苯內浸泡2次，10 min／次，依次于濃度100%、95%、85%、75%、50%乙醇內浸泡5 min，蒸餾水孵育5 min后PBS緩沖液孵育5 min；滴加3%H2O2，采用濕盒孵育10 min，清洗；PBS緩沖液再次浸泡，共3次，5 min／次；切片置入檸檬酸緩沖液，連同容器置于高壓鍋內加熱至沸騰，維持8 min，后自然降至室溫；PBS緩沖液浸泡2次，5 min／次；滴加已稀釋的一抗，4℃過夜，PBS緩沖液沖洗2次，10 min／次；滴加二抗，室溫孵育30 min，PBS緩沖液沖洗2次，10 min／次；滴加新鮮DAB工作液，采用濕盒孵育，顯微鏡下觀察染色程度，控制反應時間，判斷染色結束后，緩沖液浸泡3次，5 min／次；蘇木素復染3 min，沖洗多余染液；1%鹽酸酒精浸泡數秒，清洗切片；不同濃度酒精脫水，5 min／次，置入二甲苯浸泡，10 min／次，共2次；擦去多余液體，中性樹膠固定，蓋玻片封片，顯微鏡下觀察。（C）Ki67、P53蛋白結果判讀：陽性：細胞核呈棕黃色，根據細胞核染色程度分為1分（淡黃色）、2分（棕黃色和黃色）、3分（棕黑色）；根據染色細胞所占同類細胞數比例：＜10%為0分，10%～30%為1分，31%～70%為2分，＞70%為3分。Ki67蛋白：≥3分為高表達，＜3分為低表達；P53蛋白：≥3分為高表達，＜3分為低表達。

1.3 觀察指標①觀察兩組的Ki67、P53蛋白水平；②分析EGFR基因突變與Ki67、P53蛋白水平的相關性。

1.4 統計學方法采用SPSS 24.0統計學軟件處理數據。計數資料以n（%）表示，行χ2檢驗；采用Pearson法進行相關性分析；P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組的Ki67、P53蛋白水平比較Ki67陽性表達定位于細胞核，P53陽性表達定位于細胞漿和細胞核，EGFR陽性組的Ki67、P53高表達率分別為48.75%、52.50%，高于EGFR陰性組的21.25%、25.00%（P＜0.05）。見表1。

表1 兩組的Ki67、P53蛋白水平比較［n（%）］

2.2 相關性分析Pearson相關性分析顯示，EGFR基因突變與Ki67蛋白表達呈正相關（r＝0.148，P＝0.002），與P53蛋白表達呈正相關（r＝0.121，P＝0.001）。

3 討論

肺腺癌是全球范圍內發病率和死亡率均極高的惡性腫瘤之一［3］。EGFR屬于受體型酪氨酸激酶erbB／HER家族成員，與其配體結合后，可造成受體自身磷酸化，活化PI3／AKT、RAS／MAPK及磷脂酶C－γ信號轉導通路，參與腫瘤細胞增殖、轉移、侵襲及腫瘤血管形成等過程［4］。相關研究［5］表明，肺腺癌發生、進展與EGFR位點基因突變密切相關，并影響臨床治療方案制定及預后效果。目前，針對EGFR基因突變肺腺癌患者，臨床采用EGFR酪氨酸酶抑制劑治療，可顯著延長生存期，表明EGFR基因突變屬于肺腺癌進展驅動因子［6］。Ki67蛋白是分布于增殖細胞中的非組蛋白性核抗原，在人增殖細胞G1、G2、S、M期表達，G0期低表達或無表達，其表達程度可反映腫瘤增殖率，在多數惡性腫瘤進展期，Ki67呈高表達［7］。P53蛋白是細胞生長周期中的一種負調節因子，與細胞分化、細胞周期調控、細胞凋亡、DNA修復等重要生物學功能相關，通常認為P53過表達與腫瘤復發、轉移、浸潤及不良預后有一定關聯［8］。本研究結果顯示，EGFR陽性組的Ki67、P53高表達率與EGFR陰性組比較差異有統計學意義（P＜0.05）；Ki67、P53蛋白水平與EGFR基因突變呈正相關（P＜0.05），表明判斷Ki67、P53表達能評估EGFR基因突變狀況，對臨床治療肺腺癌及預后評估具有重要作用。

綜上所述，肺腺癌EGFR基因突變與Ki67、P53蛋白水平具有相關性，Ki67、P53蛋白表達能夠有效評估肺腺癌基因突變程度、增殖活性及預后效果，為臨床治療及預后評估提供一定的依據。