兒童肺炎肺實變住院患兒支氣管肺泡灌洗液病原分析

李飛，朱其國，施鵬，曹凌峰，王立波，陸柔劍，譚文杰，沈軍

1. 國家兒童醫學中心，復旦大學附屬兒科醫院感染傳染科，上海 201102； 2. 復旦大學附屬兒科醫院廈門分院呼吸科，福建 廈門 361006； 3. 國家兒童醫學中心，復旦大學附屬兒科醫院統計與數據管理中心，上海 201102； 4. 國家兒童醫學中心，復旦大學附屬兒科醫院分子生物實驗室，上海 201102； 5. 國家兒童醫學中心，復旦大學附屬兒科醫院呼吸科，上海 201102； 6. 中國疾病預防控制中心病毒病預防控制所應急技術中心，北京 102206

肺炎是兒童住院治療的常見原因，肺炎鏈球菌(Streptococcuspneumoniae，SP)曾是導致兒童大葉性肺炎的主要病原體。疫苗的接種和抗菌素的普遍使用，可能導致SP的兒童實變性肺炎的主要病原體[1-3]。由于肺炎發生時存在于肺部的病原體尚不能明確，因而研究病原譜構成對臨床上制訂抗感染治療策略、對疾病進行防控等有直接指導意義。對支氣管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid，BALF)標本進行檢測，能較準確反映肺部病原體的感染情況，但一般只在較嚴重的肺部感染如肺部實變不張時通過支氣管鏡診治時采集[4-6]。對存在肺炎肺實變患兒的BALF標本進行病原學檢測與分析，可以了解此類臨床表型患兒的肺部病原體構成。本研究依托國家兒童醫學中心病原學檢測平臺，分析2019年1月—2020年1月復旦大學附屬兒科醫院纖維支氣管鏡室診治的住院肺炎病例的BALF標本病原譜，期望供臨床和科研參考，并為今后多重聚合酶鏈反應(multiple polymerase chain reaction，multiple PCR)、二代測序(也稱next-generation sequencing，NGS)等新技術平臺在臨床應用[6-7]提供基礎數據。

1 材料和方法

1.1 研究對象

以2019年1月—2020年1月在復旦大學附屬兒科醫院(國家兒童醫學中心)纖維支氣管鏡室接受診治的291例患兒及其293份BALF標本為研究對象。納入標椎為研究期間本中心所有行纖維支氣管鏡檢查的病例及對應獲取的BALF標本；排除標準為院內呼吸道感染、新生兒、氣道異物吸入、肺結核等病例。本研究經復旦大學附屬兒科醫院倫理委員會批準。病例診斷參照兒童社區獲得性肺炎診療規范(2019年版)標準[5]。

1.2 研究方法

1.2.1 樣本信息采集根據統一的流行病學調查表，由專人采集醫院360電子信息系統中樣本人群的臨床信息，包括影像學檢查和病原學資料。臨床信息包括患者的年齡、性別、臨床診斷和纖維支氣管鏡手術日期，影像學檢查包括胸部X線檢查、胸部電子計算機斷層掃描(computed tomography，CT)或磁共振成像(magnetic resonance imaging，MRI)。

病原學資料由兩名高年資小兒感染科醫師基于臨床信息解讀。

1.2.2 檢測試劑盒將BALF標本進行細菌學培 養，同時采用直接免疫熒光法(direct immunofluorescence assay，DFA)檢測標本中呼吸道合胞病毒、腺病毒、甲型/乙型流感病毒、副流感病毒1型/2型/3型、人偏肺病毒8種呼吸道病毒。使用美國Chemicon公司的呼吸道病毒診斷試劑盒檢測呼吸道合胞病毒、腺病毒、甲型流感與乙型流感病毒、副流感病毒1型/2型/3型；人偏肺病毒檢測采用美國HYBRIDS公司Metapneumovirus DFA Reagent試劑盒完成。BALF鼻病毒檢測采用湖北朗德醫療科技有限公司人鼻病毒核酸檢測PCR-熒光探針法試劑盒完成；BALF肺炎支原體檢測使用中山大學達安基因股份有限公司肺炎支原體核酸檢測試劑盒完成。上述檢測均嚴格按照試劑盒說明書進行操作。

1.2.3 結核感染T細胞斑點試驗(T-cell spot test for tuberculosis infection, T-SPOT)操作按試劑盒說明書及文獻報道[8]進行。

1.2.4 支氣管肺泡灌洗術患兒家長簽署知情同意書，局麻下進行手術。選擇患兒病變肺段，將支氣管鏡置于目的肺葉，使用生理鹽水分3次進行灌洗，總量1～3 mL/kg；吸引器以25～100 kPa負壓收集BALF于無菌試管，4～8 ℃條件下送中心實驗室檢測，若不能及時送檢則置于 -80 ℃凍存。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 臨床信息

291例患兒中5例患兒存在氣道異物或吸入，共286例患兒納入研究；每名患兒可采集到1份獨立標本，共286份。其中，195例患兒存在肺炎肺實變，對應195份BALF標本(見表1)。

表1 286例患兒信息特征

由患兒信息特征數據可知， 12.2%(35/286)的患兒存在基礎疾病，分別為免疫缺陷7例(低丙種球蛋白血癥1例、無丙種球蛋白血癥1例、慢性肉芽腫病1例、PIK3CD基因突變2例、SH2D1A基因突變1例、CD48LG基因突變1例)，支氣管哮喘6例，支氣管狹窄2例，囊性纖維化病伴支氣管擴張和胰腺外分泌功能不全1例，癲癇1例，結節性硬化癥1例，先天性支氣管軟化伴漏斗胸1例，Prader-Willi綜合征1例，先天性支氣管狹窄伴肌性斜頸1例，先天性單腎缺如1例、先天性心臟病(術后)1例，染色體異常伴腦發育不全1例，喉先天性畸形(喉裂術后)1例，胃食管反流1例，系統性血管炎(ANCA相關性血管炎)1例，食管裂孔疝1例，色素失調癥伴左側視網膜摘除術后1例，先天性外耳道閉鎖(左側)1例，先天性半椎體畸形(左側T3)伴先天性心臟病(繼發房缺、卵圓孔未閉)1例，髓質海綿腎1例，幼年特發性關節炎1例，幼年型皮肌炎1例，生長發育遲緩伴房室分離1例。

2.2 病原學檢測結果

2.2.1 病原檢出情況286份標本中病原總檢出率為76.6%(219/286)；肺實變和無肺實變肺炎患兒標本病原檢出率分別為77.9%(152/195)和73.6%(67/91)。286份標本中，單種病原檢出率為61.9%(177/286)，其中肺炎支原體單獨檢出率為52.1%(149/286)，混合病原檢出率為14.7%(42/286)。前5種檢出病原體為肺炎支原體、腺病毒、鼻病毒、呼吸道合胞病毒和副流感病毒3型，檢出率分別為65.4%(187/286)、9.8%(28/286)、6.6%(19/286)、2.4%(7/286)和2.4%(7/286)；肺實變和無肺實變肺炎患兒標本中前5種病原相同，且檢出率差異無統計學意義(P>0.05)。具體如表2所示。

表2 286例患兒病原體檢出分布

286份標本中細菌學培養陽性11份(株)：其中肺炎鏈球菌5株(4株單一感染，1株合并肺炎支原體陽性)、銅綠假單胞菌2株(1株合并肺炎支原體陽性，1株合并肺炎支原體和鼻病毒陽性)、金黃色葡萄球菌(合并肺炎支原體和鼻病毒陽性)、副流感嗜血桿菌(單一感染)、鮑曼不動桿菌(合并肺炎支原體陽性)和嗜麥芽假單胞菌(合并肺炎支原體、鼻病毒和副流感病毒3型陽性)各1株。所有標本真菌培養陰性，且所有病例T-SPOT結果陰性。

肺炎支原體real-time PCR檢測陽性判定為肺炎支原體陽性，本研究肺炎支原體陽性檢出率為65.4%(187/286)。

2.2.2 各月份病原體檢出情況肺炎支原體呈全年高檢出表現，在8月份檢出率最高，為92.3%(12/13)；腺病毒檢出率也在8月份達最高，為23.1%(3/13)；鼻病毒檢出率在10月份最高，為15.0%(3/20)。各病原不同月份檢出分布流向如圖1所示。

Note：drawned by Power BI software, the widths of the data bars on both sides correspond to the monthly specimen numbers and the positive specimen samples of each pathogen.

2.2.3 各年齡組病原檢出率比較3個年齡組總病原檢出率差異比較：<1歲、1～<5歲、≥5歲患兒中總病原檢出率分別為 68.8%(11/16)、70.5%(74/105)和81.2%(134/165)，各兩組間病原檢出率差異無統計學意義(P>0.05)。肺炎支原體在各年齡組中的檢出率分別為31.3%(5/16)、53.3%(56/105)和77.0%(127/165)，各兩組間肺炎支原體檢出率差異有統計學意義(P<0.05)，且年齡越大，檢出率越高；腺病毒、鼻病毒的檢出率則隨年齡增長而下降。具體如圖2所示。

注：A總病原；B肺炎支原體；C腺病毒；D鼻病毒；E呼吸道合胞病毒；F副流感病毒3型；*P<0.05。

2.2.4 各年齡組肺實變和無肺實變病例病原檢出率比較各年齡組內有、無肺實變總病原檢出率差異比較：<1歲、1～<5歲、≥5歲患兒中有肺實變和無肺實變病例總病原檢出率分別為66.7%(8/12)和75.0%(3/4)、71.7%(43/60)和68.9%(31/45)、82.1%(101/123)和78.6%(33/42)，檢出率差異均無統計學意義(P>0.05)。各年齡組內有、無肺實變患兒之間幾種主要病原檢出率差異比較：各年齡組患兒無論是否有肺實變，其肺炎支原體、鼻病毒、呼吸道合胞病毒和副流感病毒3型的檢出率差異均無統計學意義(P>0.05)。1～<5歲有肺實變和無肺實變病例中腺病毒檢出率分別為26.7%(16/60)和68.9%(31/45)，差異有統計學意義(P<0.05)，<1歲和≥5歲病例中，有肺實變和無肺實變患兒的腺病毒檢出率差異均無統計學意義(P>0.05)，具體如圖3所示。

注：A總病原；B肺炎支原體；C腺病毒；D鼻病毒；E呼吸道合胞病毒；F副流感病毒3型。

3 討論

兒科臨床中肺炎肺實變的病例較常見，但典型的肺炎球菌性肺炎(又稱大葉性肺炎)發病率已降低[1,9]。感染性肺炎伴肺實變相對于無實變病例，其抗感染治療可能相對復雜，并易形成肺空洞、壞死性肺炎等遠期并發癥。對支氣管肺泡灌洗液標本進行病原學檢測基本可確定導致肺部炎癥的真實病原體[3,5,7]，明確肺部病原體對臨床經驗性抗感染治療有指導作用。本研究基于國家兒童醫學中心較成熟的臨床微生物實驗室平臺和感染專科的有利條件，對2019年1月—2020年1月復旦大學附屬兒科醫院(國家兒童醫學中心)的單中心纖維支氣管鏡手術病例的臨床資料進行回顧性分析。在納入的286例病例中，最小年齡為0.4歲，最大年齡為17歲，平均年齡和中位數分別為5.7歲和6.0歲， 提示研究樣本人群亦是期間實施纖維支氣管鏡手術的主要人群，即5歲左右的學齡前期和學齡期兒童。課題組的既往研究發現，上海社區獲得性肺炎(community acquired pneumonia，CAP)患兒中，≥5歲患兒由于肺炎支原體感染而導致急性下呼吸道感染的可能性明顯升高，同時腺病毒、鼻病毒和呼吸道合胞病毒亦均為本地區兒童急性下呼吸道感染最常見的病原體[10-15]。<1歲及≥5歲患兒的CAP病原譜與 1～<5 歲患兒相比可能存在差異[1,2,10-11, 15]，因此本研究按此年齡分層進行分析。肺炎伴肺實變患兒與無肺實變患兒的致病原之間是否存在明顯差異是本研究的目的之一。

在本研究中，總病原檢出率為76.6%(219/286)，明顯高于課題組以往研究的急性下呼吸道感染住院患兒標本53.9%的總病原檢出率[10]。可能的原因是，一方面本研究檢測支氣管肺泡灌洗液而非經鼻吸取的深部痰液，可能有更高的病原檢出率；另一方面本研究中增加了鼻病毒及人偏肺病毒的檢測，兩者檢出陽性標本數分別為19份和4份，共7份標本是人偏肺病毒及鼻病毒單獨檢測，貢獻了2.4%(7/286)的檢出率(結果未顯示)；而更主要的原因可能是，本研究病例的肺部感染相對較重、存在基礎性疾病的患兒較多、需要纖維支氣管鏡進行診治。前5種檢出病原為肺炎支原體、腺病毒、鼻病毒、呼吸道合胞病毒和副流感病毒3型，檢出率分別為65.4%(187/286)、9.8%(28/286)、6.6%(19/286)、2.4%(7/286)和2.4%(7/286)，與以往兒童CAP的主要病原學研究結果基本一致[1,10,15]。以往的研究發現，在不同的兒童年齡組、不同的地理區域、不同的年份或納入的不同樣本人群中，檢測到的CAP病原譜可能不同[1,7]。

本研究的BALF細菌培養結果表明，肺炎鏈球菌檢出率最高，但陽性率僅為1.7%(5/286)；細菌培養時活菌的檢出率低，不排除與纖維支氣管鏡手術前采用抗菌素治療有關。提示今后應采用其他技術方法，如multiplex PCR、NGS等進一步檢測病原體核酸加以驗證，這也是課題組未來的研究方向。

由于本研究僅跨度13個月，對各病原體的季節性分布情況研究意義有限。但比較明確的是，肺炎支原體檢出率在全年均較高，包括在肺實變患兒中亦是如此；其他病原因樣本量較小，很難在病原檢出分布流行圖上體現其流行季節分布的特點，比如呼吸道合胞病毒共檢出7份標本陽性，其中2019年2月、3月、9月、11月和2020年1月分別有1份陽性，2019年12月2份陽性，這可能與以往存在冬季流行高峰[1,10,15-16]的研究結果一致。

本研究主要發現：①肺實變和無肺實變肺炎患兒總病原檢出率分別為77.9%(152/195)和73.6%(67/91)，差異無統計學意義；②在<1歲、1～<5歲、≥5歲3個年齡組內，肺實變和無肺實變肺炎患兒總病原檢出率分別為66.7%(8/12)和75.0%(3/4)，71.7%(43/60)和68.9%(31/45)，82.1%(101/123)和78.6%(33/42)，檢出率差異均無統計學意義(P>0.05)；③在同一年齡組內，肺實變和無肺實變的肺炎病例中，肺炎支原體、鼻病毒、呼吸道合胞病毒和副流感病毒3型的檢出率差異均無統計學意義(P>0.05)，1～<5歲有肺實變和無實變病例中腺病毒檢出率分別為26.7%(16/60)和68.9%(31/45)，差異具有統計學意義(P<0.05)，而在<1歲和≥5歲病例中，有肺實變和無實變患兒的腺病毒檢出率差異均無統計學意義(P>0.05)。這些結果提示，導致肺實變CAP的主要病原體與無肺實變CAP的主要病原體可能基本相同，這對臨床經驗性抗感染治療有一定的參考意義。

在本研究中，<1歲、1～<5歲、≥5歲3個年齡組病例的總病原檢出率分別為68.8%(11/16)、70.5%(74/105)和81.2%(134/165)，各兩組間病原檢出率差異無統計學意義(P>0.05)，提示總病原檢出率可能與年齡不相關；肺炎支原體在各年齡組的檢出率分別為31.3%(5/16)、53.3%(56/105)和77.0%(127/165)，各兩組間肺炎支原體檢出率差異具有統計學意義(P<0.05)，且年齡越大，檢出率越高；腺病毒、鼻病毒則隨年齡增長，檢出率下降，證實在不同的年齡組內，CAP病原譜可能不同，這與既往的相關研究相符[13,15]。需要指出的是，本研究中按照此年齡分層得到的所有結果，如擴大樣本量或采用不同方法進行年齡分層，可能會有不同的結果，后續的研究須進一步明確。

本研究的特點是利用BALF對導致兒童CAP并肺實變的病原譜進行分析，這對臨床有一定的提示意義。但由于單中心、小樣本量而未能將病例根據標本采集時的病程或抗感染情況進行分組，且病原學檢測方法不統一(綜合了DFA、PCR和細菌培養)，針對以上研究局限，未來將補充相關的研究。今后，將針對兒童肺實變這類特殊的樣本人群，于嚴重急性呼吸綜合征冠狀病毒2型等特殊病原體流行期間，開展兒童CAP的病原學研究，利用新的技術推廣[17-19]進一步完善兒童肺炎病原譜，理論上均可為臨床預防和診治CAP帶來 益處。